維生素C通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能緩解大鼠黃斑變性的研究

杜柏榮, 許衍峰, 韋志強(qiáng)

(甘肅省酒泉市人民醫(yī)院, 1. 科教科, 2. 藥劑科, 3. 眼科, 甘肅 酒泉, 735000)

年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是一種好發(fā)于50歲以上人群的慢性進(jìn)展性疾病，是老年人群不可逆性視力損傷的主要原因之一[1]。AMD的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為該病與年齡、種族、遺傳、氧化應(yīng)激、炎癥等相關(guān)[2-4]。研究[5-6]表明, AMD本質(zhì)上是慢性炎癥，而巨噬細(xì)胞作為參與炎癥的重要細(xì)胞，其在AMD發(fā)病機(jī)制中的作用一直受到關(guān)注。對于AMD的治療，目前臨床上通常采用全身補(bǔ)充抗氧化劑藥物如維生素C等進(jìn)行治療[7-8], 但關(guān)于維生素C緩解AMD的機(jī)制的研究仍較少。本研究探討維生素C通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能緩解黃斑變性進(jìn)展的機(jī)制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與動物

碘酸鈉，購自美國Sigma-Aldrich公司; 維生素C粉劑，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 熒光標(biāo)記抗小鼠流式抗體，購自美國Biolegend公司。

2周齡SD大鼠30只，雄性，體質(zhì)量200～220 g, 購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號為SCXK(京)2016-0011。實驗過程中嚴(yán)格遵守3R原則。

1.2 造模與分組給藥

參照參考文獻(xiàn)[9]造模，并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。30只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、治療組，每組10只。正常組不給予處理; 治療組尾靜脈注射40 mg/kg碘酸鈉造模，實驗開始后每天灌胃1次維生素C, 灌胃劑量100 mg/kg; 模型組尾靜脈注射40 mg/kg碘酸鈉造模，實驗開始后每天灌胃等體積生理鹽水。共治療14 d, 2 d測量1次體質(zhì)量。

1.3 視網(wǎng)膜電圖(ERG)測定

給藥治療結(jié)束后，將大鼠暗適應(yīng)12 h、散瞳、使用50 mg/kg 氯胺酮和5 mg/kg甲苯噻嗪腹腔注射麻醉后，在雙側(cè)眼瞼內(nèi)安放銀-氯化銀電極，參考電極和接地電極分別置于同側(cè)下肢和后頸處。采用Ganzfeld Q400刺激器進(jìn)行刺激，使用RETI-port視網(wǎng)膜電圖記錄系統(tǒng)進(jìn)行暗適應(yīng)、明適應(yīng)、混合反應(yīng)、振蕩電位和閃爍光反應(yīng)視網(wǎng)膜電圖檢測，記錄各組大鼠a波、b波的峰時值(ms)和振幅值(μV)。

1.4 視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變化檢測

給藥結(jié)束后，將大鼠麻醉，取出眼球后脫臼處死。將眼球置于4%多聚甲醛中固定30 min, 剝離出視網(wǎng)膜后再次固定24 h, 后經(jīng)脫水、包埋、切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(HE染色)。在光學(xué)顯微鏡下對視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞數(shù)、視網(wǎng)膜色素上皮層數(shù)進(jìn)行計數(shù)。

1.5 巨噬細(xì)胞流式檢測

將大鼠眼球取出后，采用生理鹽水漂洗干凈，剪成小塊，置于含0.8 mg/mL 膠原酶Ⅳ和0.5 μg/mL RNase Ⅰ的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃消化30 min。采用70 μm細(xì)胞過濾器過濾, PBS清洗后得到單細(xì)胞懸液。

使用2% BSA/PBS封閉單細(xì)胞30 min, 取1×106細(xì)胞(100 μL)按說明書加入適量熒光標(biāo)記的抗小鼠CD11b、F4/80、CD36或CD206抗體，避光孵育30 min。再次離心后，使用PBS重懸，使用流式細(xì)胞儀對巨噬細(xì)胞(CD11b+F4/80+)的CD36、CD206陽性細(xì)胞比率進(jìn)行檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用單因素方差分析(ANOVA)對組間均數(shù)進(jìn)行比較，進(jìn)一步采用最顯著差數(shù)法(LSD-t法)進(jìn)行多重兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 維生素C對大鼠體質(zhì)量的影響

實驗結(jié)果顯示，維生素C作為臨床常用的抗氧化劑，灌胃給藥持續(xù)時間對大鼠體質(zhì)量無影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 說明維生素C用于治療黃斑變性是相對安全的。見表1。

2.2 維生素C能夠恢復(fù)黃斑變性大鼠視網(wǎng)膜電位

暗適應(yīng)0.01 ERG檢測結(jié)果顯示，相較于正常組，模型組ERG b波降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。維生素C灌胃給藥治療14 d后，治療組ERG b波振幅升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與暗適應(yīng)0.01 ERG結(jié)果相似，與正常組比較，模型組暗適應(yīng)3.0 ERG、暗適應(yīng)3.0振蕩電位、明適應(yīng)3.0 ERG以及明適應(yīng)3.0閃爍光反應(yīng)的振幅均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)過14 d的維生素C灌胃治療后，治療組上述相關(guān)ERG檢測治療均有不同程度的恢復(fù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 維生素C能夠抑制黃斑變性大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步檢測維生素C對大鼠黃斑變性的緩解效果，將治療后的大鼠視網(wǎng)膜剝離, HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察并統(tǒng)計視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞數(shù)和視網(wǎng)膜色素上皮層數(shù)。實驗結(jié)果顯示，正常組大鼠視網(wǎng)膜層析分明，細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)無異常。模型組大鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)一定程度的病理損傷，視網(wǎng)膜色素上皮層數(shù)減少，細(xì)胞呈波浪狀排布。經(jīng)維生素C灌胃治療后，相較于模型組，治療組視網(wǎng)膜色素上皮層數(shù)有所增加，細(xì)胞恢復(fù)成較為整齊的排列。視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞數(shù)和視網(wǎng)膜色素上皮層數(shù)的定量結(jié)果顯示，相較于正常組，模型組視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞數(shù)和視網(wǎng)膜色素上皮層數(shù)均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); 相較于模型組，治療組視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞數(shù)和視網(wǎng)膜色素上皮層數(shù)則有增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。上述結(jié)果證實了維生素C對大鼠黃斑變性進(jìn)展有較好的緩解效果。見圖1、表3。

表1 各組大鼠灌胃給藥持續(xù)時間對體質(zhì)量變化的影響 g

表2 各組大鼠ERG檢測 μV

A: 正常組大鼠視網(wǎng)膜; B: 模型組大鼠視網(wǎng)膜; C: 治療組大鼠視網(wǎng)膜。圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜HE染色圖(放大倍數(shù)200倍)

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞數(shù)和視網(wǎng)膜色素上皮層數(shù)變化

2.4 維生素C改變黃斑變性大鼠視網(wǎng)膜巨噬細(xì)胞功能

與正常組相比，模型組大鼠眼球中與細(xì)胞吞噬相關(guān)的CD36陽性巨噬細(xì)胞比率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 而CD206陽性的M2樣巨噬細(xì)胞比率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。相較于模型組，經(jīng)維生素C灌胃治療后，治療組CD36陽性巨噬細(xì)胞比率升高，而CD206陽性的M2樣巨噬細(xì)胞比率下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 說明維生素C可能是通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力、抑制巨噬細(xì)胞的M2極化來發(fā)揮緩解黃斑變性的功效。見表4。

表4 各組大鼠眼球巨噬細(xì)胞CD36、CD206陽性細(xì)胞比率變化

3 討 論

AMD是老年人主要的致盲眼病之一，主要癥狀是視物變形、變色，視力下降甚至失明[7]。AMD包括地圖樣萎縮(GA)和新生血管性老年性黃斑變性(nAMD), 主要病理特點(diǎn)是脈絡(luò)膜與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層(RPE)之間玻璃膜疣形成, Bruch膜增厚，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和光感受器細(xì)胞凋亡，黃斑區(qū)脈絡(luò)膜新生血管形成[10]。AMD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究[3, 8, 11]發(fā)現(xiàn)遺傳、炎癥、氧化應(yīng)激等均與AMD相關(guān)。研究者[10, 12]發(fā)現(xiàn), AMD視網(wǎng)膜中免疫及炎癥反應(yīng)對于該病的進(jìn)展具有重要影響。

巨噬細(xì)胞與免疫及炎癥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞具有極強(qiáng)的可塑性，在不同的生理環(huán)境下的功能是可變的。根據(jù)其功能、標(biāo)志物的不同，巨噬細(xì)胞可以分為經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞(M1樣巨噬細(xì)胞)和替代活化型巨噬細(xì)胞(M2樣巨噬細(xì)胞)[13-14]。M1樣巨噬細(xì)胞在脂多糖、γ-干擾素等誘導(dǎo)下極化而成，細(xì)胞的促炎因子及炎癥介質(zhì)表達(dá)增高，主要介導(dǎo)Th1反應(yīng)。M2樣巨噬細(xì)胞是在白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-13(IL-13)等誘導(dǎo)下形成，其抗炎細(xì)胞因子表達(dá)增加，主要介導(dǎo)Th2免疫反應(yīng)[15]。M2樣巨噬細(xì)胞具有抗炎、促腫瘤、促血管新生等作用，在黃斑變性病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[5, 16]。Drusen是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和Bruch膜之間的胞外沉積物[17]。巨噬細(xì)胞吞噬能力下降，導(dǎo)致Drusen沉積，可能是導(dǎo)致AMD的直接原因之一[18]。此外, M2巨噬細(xì)胞產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板源性生長因子等，可促進(jìn)血管形成，進(jìn)而介導(dǎo)nAMD的發(fā)生[19-20]。M1樣巨噬細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)，且其表達(dá)的IL-18能夠?qū)筕EGF導(dǎo)致的血管新生[21], 表明將視網(wǎng)膜中的巨噬細(xì)胞由M2樣逆極化到M1樣將有助于AMD的治療。

由于AMD的病理因素復(fù)雜，因此有關(guān)AMD的治療較為困難且難以根治。使用抗氧化劑如維生素C是目前臨床上防治AMD的熱點(diǎn)[8]。研究[22-24]表明，作為高效抗氧化劑的維生素C可以通過中和自由基來預(yù)防或延遲AMD的進(jìn)展。研究[25]表明，維生素C除了可以抑制巨噬細(xì)胞脂質(zhì)過氧化作用而保護(hù)機(jī)體免受損傷，還可以明顯提高巨噬細(xì)胞的增殖、遷移與吞噬能力[26-27]。本研究結(jié)果顯示，灌胃維生素C能夠上調(diào)黃斑變性大鼠視網(wǎng)膜巨噬細(xì)胞中清道夫受體CD36陽性細(xì)胞的比率，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)Drusen沉積物的清除; 同時，維生素C還可以抑制巨噬細(xì)胞的M2極化，降低CD206陽性巨噬細(xì)胞的比率，減弱巨噬細(xì)胞對黃斑變性病變進(jìn)程的影響。

本研究結(jié)果顯示，維生素C能夠減緩大鼠視網(wǎng)膜損傷，增加視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞數(shù)和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層數(shù)，提高AMD大鼠視網(wǎng)膜電位，保護(hù)大鼠視網(wǎng)膜功能，緩解AMD進(jìn)展。維生素C可能是通過增強(qiáng)視網(wǎng)膜巨噬細(xì)胞吞噬能力、抑制巨噬細(xì)胞M2極化來發(fā)揮緩解黃斑變性的功效。