淫羊藿苷對(duì)模擬高原環(huán)境下雄性大鼠生殖系統(tǒng)損傷的保護(hù)作用研究

張喜艷，柏鑫，閻一鑫，陳克明，王玲*

(1.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，蘭州 730050；2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730030；4.甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050)

淫羊藿苷是傳統(tǒng)中藥淫羊藿的主要活性成分，具有廣泛的藥理和生物活性，包括抗炎、抗抑郁、抗腫瘤活性、抗氧化作用、雌激素活性、心血管保護(hù)、促進(jìn)骨愈合和神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)和改善性功能[1]。淫羊藿作為治療男性生殖功能障礙的傳統(tǒng)中藥已有數(shù)千年的歷史[2]，但很少有研究調(diào)查其對(duì)生殖功能(如精子發(fā)生和睪酮產(chǎn)生)的其他藥理活性或其潛在機(jī)制。不孕癥已成為全球公共衛(wèi)生問(wèn)題，影響全球約12%～15%的夫婦[3]，在不孕原因中男性因素占50%[4]。男性不育的原因是廣泛的，目前研究表明，缺氧是男性不育的主要原因之一，環(huán)境性缺氧和病理性缺氧對(duì)男性的精液參數(shù)、睪丸功能、生殖激素分泌和妊娠結(jié)局均產(chǎn)生不利影響[5]。本研究旨在觀察淫羊藿苷對(duì)模擬高原環(huán)境下的大鼠出現(xiàn)的生殖損傷的保護(hù)作用，以期為淫羊藿苷的臨床藥物開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：30只12周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體重(220±15)g，購(gòu)自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(甘)2018-0002。

實(shí)驗(yàn)廢棄物及動(dòng)物尸體等按照《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》要求進(jìn)行無(wú)害化處理，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵守國(guó)家科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》，盡可能減少對(duì)動(dòng)物的傷害。實(shí)驗(yàn)得到了聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2.實(shí)驗(yàn)試劑：淫羊藿苷(HI008055298)購(gòu)自寶雞市辰光生物科技有限公司；丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司；血清睪酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)的試劑盒購(gòu)自睿信生物科技有限公司；精子形態(tài)學(xué)快速染色液及精子活體染色液購(gòu)自上海索萊寶生物科技有公司。

3.主要儀器：DYC-3070型模擬高原低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙群(貴州風(fēng)雷航空軍械)；光學(xué)顯微鏡(鳳凰光學(xué))；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā))；Epoch熒光酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.動(dòng)物分組與處理：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為平原對(duì)照組、高原模型組和淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組，每組10只。平原對(duì)照組大鼠飼養(yǎng)于本院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(海拔1 400 m)，高原模型組和淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組飼養(yǎng)于模擬高原動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙，以5 m/min的速度上升至海拔6 000 m高度[6]。淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組每天上午9時(shí)給予淫羊藿苷100 mg/kg[7]灌胃，連續(xù)30 d，其余兩組給予等體積生理鹽水灌胃。在實(shí)驗(yàn)期間，各組大鼠自由攝食飲水，光照時(shí)間8：00～20：00，溫度為24℃±1℃。每周稱(chēng)量所有大鼠體質(zhì)量。

2.組織取材及處理：干預(yù)期滿后各組大鼠禁食水12 h，麻醉后迅速剪開(kāi)腹腔，暴露腹部?jī)?nèi)容物，將其推向一側(cè)，牽拉精索，引出睪丸和附睪，摘取雙側(cè)睪丸和附睪；剔除粘連的血管、脂肪等組織，雙側(cè)睪丸組織稱(chēng)重后將左側(cè)睪丸放入4%多聚甲醛溶液中，右側(cè)睪丸放入-80℃冰箱中保存待用。將大鼠腹主動(dòng)脈暴露完全，尋找最佳穿刺點(diǎn)采集血液，室溫下靜置30 min后放入4℃冰箱中冷藏30 min以使血清析出，2 000～2 500 r/min離心20 min，將上清液儲(chǔ)存于2 ml無(wú)菌無(wú)酶的 EP管中，-20℃保存?zhèn)溆?。睪丸指數(shù)=睪丸重量/體質(zhì)量。

3.睪丸組織病理學(xué)檢測(cè)：取固定于4%多聚甲醛溶液中的左側(cè)睪丸組織，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯處理、石蠟包埋、切片以及HE染色處理。

4.精子懸液指標(biāo)及精子質(zhì)量評(píng)估：取雙側(cè)附睪置于生理鹽水中，剪碎并待精子釋放制備成精子懸液。取一滴精子懸液滴入載玻片，計(jì)數(shù)每毫升懸液中精子濃度(107/ml)，并在40倍鏡下觀察，計(jì)數(shù)200個(gè)精子，依精子活動(dòng)狀態(tài)分為前向運(yùn)動(dòng)(PR)、非前向運(yùn)動(dòng)(NP)、及不活動(dòng)(IM)。精子活動(dòng)率(%)=(PR+NP)/(PR+NP+IM)。取精子懸液于載玻片涂片后進(jìn)行Diff-Quik染色，于100倍鏡下觀察，計(jì)數(shù)畸形的精子(頭部畸形、尾部畸形、其他形態(tài)異常)所占比例，每張涂片計(jì)數(shù)200個(gè)以上的精子。取精子懸液于載玻片涂片后采用伊紅-苯胺黑染液染色，于100倍鏡下觀察，計(jì)數(shù)染色精子和非染色精子(染色為死精子，非染色精子為活精子)，每張涂片計(jì)數(shù)200個(gè)以上的精子。

5.睪丸組織氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定：取右側(cè)睪丸組織，按照1∶9的質(zhì)量比例加入低溫生理鹽水后機(jī)械勻漿，4℃條件下3 500 r/min離心10 min，取上清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行SOD活力和MDA水平測(cè)定。

6.生殖激素檢測(cè)：使用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)測(cè)定大鼠血清T、LH、FSH含量，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、各組大鼠的一般情況比較

與平原對(duì)照組相比，高原模型組與淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組體重均顯著下降(P<0.05)，而淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組與高原模型組體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)；高原模型組睪丸指數(shù)顯著低于平原對(duì)照組與淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，而淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組的睪丸指數(shù)與平原對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

A：大鼠體重逐周變化情況；B：各組的睪丸指數(shù)。與其他兩組比較，*P<0.05。圖1 各組大鼠體重變化情況及睪丸指數(shù)比較

二、各組大鼠睪丸組織的病理學(xué)結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示：平原對(duì)照組大鼠的睪丸組織形態(tài)完好，生精上皮結(jié)構(gòu)完整，由排列有序的各級(jí)生精細(xì)胞和成熟的支持細(xì)胞組成，上皮下的基膜明顯，管腔內(nèi)精子豐富，間質(zhì)細(xì)胞成群分布于生精小管之間；高原模型組的大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)異常，生精小管管腔不規(guī)則，且大小不一，生精上皮有1～2層生精細(xì)胞，且結(jié)構(gòu)紊亂，生精細(xì)胞變性壞死脫落至管腔，支持細(xì)胞可見(jiàn)大量空泡，上皮下基膜變薄甚至斷裂缺失，管腔正常形態(tài)結(jié)構(gòu)消失，管腔內(nèi)空洞化，無(wú)可見(jiàn)的長(zhǎng)梭形的精子，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，充血水腫，且有大量紅細(xì)胞；淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組睪丸組織生精小管形態(tài)大小較均一，內(nèi)約有3～4層排列相對(duì)規(guī)則的各級(jí)生精細(xì)胞，偶有脫落壞死的生精細(xì)胞，支持細(xì)胞有數(shù)量較少的空泡，基膜較陽(yáng)性對(duì)照組增厚，管腔較規(guī)則，內(nèi)有大量精子，間質(zhì)細(xì)胞較豐富，偶見(jiàn)炎癥細(xì)胞(圖2)。

A：平原對(duì)照組；B：高原模型組；C：淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組；紅色箭頭示生精細(xì)胞。圖2 睪丸組織的病理學(xué)結(jié)果比較(HE ×200)

三、各組大鼠的附睪精子質(zhì)量比較

與高原模型相比，平原對(duì)照組及淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組的精子數(shù)量、精子存活率和精子總活動(dòng)率均顯著上升(P<0.01)，精子畸形率顯著下降(P<0.01)；平原對(duì)照組和淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組間的精子質(zhì)量參數(shù)無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖3)。

四、各組大鼠的血清性激素水平比較

與平原對(duì)照組相比，高原模型組大鼠血清T、FSH和LH水平均顯著下降(P<0.01)，而淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組的大鼠血清性激素水平無(wú)顯著性變化(P>0.05)；與高原模型組相比，淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組的性激素水平均顯著升高(P<0.01)(圖4)。

與其他兩組比較，**P<0.01。圖3 各組大鼠附睪精子質(zhì)量情況比較

與其他兩組比較，**P<0.01。圖4 各組大鼠的血清性激素水平

五、各組大鼠睪丸氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較

與平原對(duì)照組相比，高原模型組大鼠睪丸組織SOD活性顯著下降(P<0.01)，MDA水平顯著上升(P<0.01)，淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組睪丸組織氧化應(yīng)激指標(biāo)無(wú)顯著性變化(P>0.05)；與高原模型組相比，淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組睪丸組織水平SOD活性顯著上升(P<0.01)，MDA水平顯著下降(P<0.01)(圖5)。

與其他兩組比較，**P<0.01。圖5 各組大鼠的睪丸組織SOD和MDA的水平

討 論

有研究表明，缺氧暴露環(huán)境導(dǎo)致體重下降可能與缺氧暴露能提高身體新陳代謝降低食欲有關(guān)[7]。Chen等[8]研究發(fā)現(xiàn)，平原環(huán)境中淫羊藿苷治療的大鼠體重未發(fā)生顯著變化，而本次研究結(jié)果顯示模擬高原環(huán)境會(huì)導(dǎo)致大鼠體重增長(zhǎng)緩慢，淫羊藿苷給藥后大鼠的體重?zé)o顯著性變化，但淫羊藿苷給藥后能夠使大鼠睪丸指數(shù)與平原環(huán)境下相近，且顯著高于高原模型組，初步說(shuō)明淫羊藿苷能夠?qū)Υ笫蟛G丸起到一定的保護(hù)作用。

睪酮對(duì)于性別分化、維持精子發(fā)生和男性第二性征的表達(dá)至關(guān)重要。有研究表明，睪酮在睪丸的形態(tài)發(fā)育和生殖功能中都起著重要作用[9]。淫羊藿苷在平原環(huán)境中對(duì)雄性大鼠生殖系統(tǒng)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，成年大鼠口服淫羊藿苷顯著提高睪酮水平，并上調(diào)睪丸生成基因的表達(dá)，如苯二氮卓類(lèi)受體和類(lèi)固醇源性急性調(diào)節(jié)蛋白，改善雄性大鼠的生殖功能[6]。本實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)高原環(huán)境中血清睪酮水平、FSH水平、LH水平和精子數(shù)量較平原對(duì)照組降低，在模擬高原環(huán)境中給予淫羊藿苷干預(yù)后睪酮水平得到好轉(zhuǎn)，與常德輝等[10]的研究結(jié)果一致。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是參與細(xì)胞對(duì)缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1 在男性睪丸組織的生殖細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。膽固醇是合成睪酮的原料[11]，類(lèi)固醇急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)介導(dǎo)的膽固醇轉(zhuǎn)移是睪酮合成的限速步驟，而StAR 是該過(guò)程的限速蛋白[12]。Wang等[13]在HIF-1對(duì)StAR轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及對(duì)睪丸細(xì)胞合成和分泌睪酮的影響研究中表明，在缺氧條件下，HIF-1水平升高，機(jī)體睪酮分泌量降低，HIF-1對(duì)StAR的轉(zhuǎn)錄抑制是缺氧條件下睪酮減少的一種機(jī)制。在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷有影響HIF-1表達(dá)的潛力[14]，這為以后進(jìn)一步研究中藥淫羊藿苷的藥用價(jià)值提供新思路。

目前研究表明睪丸組織的過(guò)氧化損傷是導(dǎo)致睪丸功能受損的重要原因[15]。MDA水平經(jīng)常被用作組織氧化應(yīng)激的關(guān)鍵指示指標(biāo)，它是由自由基對(duì)細(xì)胞膜成分的損傷造成[16]。SOD酶是對(duì)抗氧化應(yīng)激的重要抗氧化防御指標(biāo)，在細(xì)胞中，SOD酶將超氧陰離子(?O2-)轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫(H2O2)，進(jìn)而谷胱甘肽過(guò)氧化物酶可以將H2O2分解為水[17]。在本研究中，模擬高原低壓低氧環(huán)境致使大鼠睪丸組織SOD酶活性降低，而睪丸組織MDA水平升高；然而，高原模擬環(huán)境中淫羊藿苷的干預(yù)提高了睪丸組織SOD酶的活性，抑制MDA水平。結(jié)果表明，由高原低壓低氧環(huán)境引起的睪丸組織的氧化應(yīng)激在淫羊藿苷的干預(yù)下得以減輕，提示淫羊藿苷可能具有針對(duì)環(huán)境性缺氧所介導(dǎo)的生殖毒性的保護(hù)作用，其具體保護(hù)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

精子質(zhì)量是評(píng)估男性生育能力的重要指標(biāo)。成熟且有功能的精子發(fā)生于睪丸生精小管并儲(chǔ)存于附睪中，慢性低氧導(dǎo)致睪丸生精上皮空泡化、生殖細(xì)胞變形或生成減少，從而導(dǎo)致精子數(shù)量減少以及精子畸形率增加，精子存活率下降以及精子活力下降[18]。有研究報(bào)道，雄性大鼠給予淫羊藿苷處理增加附睪精子數(shù)量且對(duì)睪丸組織形態(tài)學(xué)無(wú)不利影響[6]。本研究中，高原環(huán)境中淫羊藿苷干預(yù)能夠改善雄性大鼠精子質(zhì)量，且睪丸組織病理學(xué)形態(tài)趨向正常，淫羊藿苷對(duì)模擬高原環(huán)境所致雄性生殖系統(tǒng)損傷的保護(hù)作用機(jī)制可能是通過(guò)減輕睪丸組織中氧化應(yīng)激損傷的途徑保護(hù)睪丸生精小管，并且與提高生殖激素水平有關(guān)，但所涉及的分子水平機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，高原環(huán)境中給予淫羊藿苷干預(yù)有逆轉(zhuǎn)生殖毒性損傷的趨勢(shì)，表明淫羊藿苷對(duì)持續(xù)缺氧環(huán)境所導(dǎo)致的生殖系統(tǒng)損傷具有保護(hù)作用，可能與淫羊藿苷提高血液中的睪酮濃度及增強(qiáng)抗氧化酶的活性，使睪丸組織生精小管免受缺氧應(yīng)激損傷有關(guān)。但本研究中對(duì)相應(yīng)的具體分子機(jī)制及雄性生殖系統(tǒng)細(xì)胞和基因水平上的研究有所不足，仍有待進(jìn)一步研究。