自動化DNA 組裝儀器研制

陳 紅，榮 振，王升啟

（軍事科學院軍事醫(yī)學研究院微生物流行病研究所，北京 100850）

DNA 組裝方法是整個合成生物學的基礎(chǔ)，合成生物學依賴于將組裝的特定DNA 片段導入細胞內(nèi)發(fā)揮功能來實現(xiàn)目的，DNA 組裝技術(shù)是實現(xiàn)合成生物學各種目的的關(guān)鍵技術(shù)，但設(shè)計并合成基因組的能力還遠遠落后于已掌握的合理設(shè)計生物元件的能力。隨著合成生物學的發(fā)展，研究者開發(fā)了依賴于DNA 聚合酶或DNA 連接酶的不同DNA 組裝技術(shù)；為了降低組裝成本和便于實現(xiàn)DNA 組裝的自動化，也發(fā)展了一些非酶依賴的DNA 組裝技術(shù)；而幾百KB 到MB 的大片段DNA 的組裝則多數(shù)依賴于微生物體內(nèi)重組[1]。

2002 年，合成的脊髓灰質(zhì)炎病毒cDNA 被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄成病毒RNA，在無細胞提取物中翻譯和復制，從而產(chǎn)生傳染性脊髓灰質(zhì)炎病毒的從頭合成[2]，表明僅通過序列，就可以通過體外化學合成感染因子。2008 年Venter 研究組利用TAR（Transformation Associated Recombination）方法在釀酒酵母體內(nèi)完成了生殖道支原體基因組的最后一步組裝[3]。2009 年，Gibson 開發(fā)了DNA 多片段體外一步拼接的方法，將核酸外切酶、聚合酶和連接酶加入反應體系，50 ℃孵育60 min即可完成組裝[4]。2010 年，Venter 團隊和Smith 團隊合成了長達1.08 MB 的蕈狀支原體基因組，成功轉(zhuǎn)入到山羊支原體宿主細胞內(nèi)，是人工合成基因創(chuàng)造新細胞的歷史性一步[5]。2017 年，紐約大學Boeke 教授團隊在“人工合成酵母基因組計劃（Sc2.0）”中，用同源重組的方法，成功組裝了大片段的DNA 且同時置換了野生型染色體[6]。同年，我國天津大學[7-8]、清華大學[9]、深圳華大基因研究院[10]完成了4 條釀酒酵母染色體的全合成，且合成的染色體經(jīng)過人工設(shè)計，刪除了無用序列，比天然染色體的基因序列更短。

國內(nèi)也發(fā)展了多種DNA 組裝新技術(shù)。趙國屏院士團隊開發(fā)出位點特異性重組串聯(lián)SSRTA、核酸內(nèi)切酶連接、MASTER 連接及iBrick 等組裝方法[11-12]；覃重軍研究員團隊發(fā)展出CasHRA 技術(shù)[13]，實現(xiàn)胞內(nèi)多個100 KB 以上DNA 片段組裝；戴俊彪研究員團隊建立了可用于代謝工程優(yōu)化和蛋白表達的YeastFab 和EcoExpress DNA 組裝技術(shù)[14-15]；趙惠民教授團隊提出一種高效準確的多片段DNA 組裝方法雙引物組裝（Twinprimer non-enzymatic DNA assembly，TPA）[16]，這是一種在不使用酶的情況下將PCR 反應擴增的片段組裝成質(zhì)粒的方法。TPA 克隆無疤痕且與序列無關(guān)，即使不使用酶，TPA 的性能也與目前可用的一些最好的體外組裝方法相當。

雖然DNA 組裝的方法技術(shù)已經(jīng)很成熟，但完成DNA 組裝相關(guān)的實驗成本太高、耗費的時間太長、占用的人力太多。本文研制了一種DNA 組裝儀器，可以自動化、快速地滿足DNA 組裝實驗中的移液要求及溫度控制條件。

1 DNA 組裝儀設(shè)計

針對現(xiàn)有的DNA 組裝中常見的通量低、速度慢及自動化程度低等問題，本文從工程學角度出發(fā)，合理設(shè)計DNA 組裝儀的結(jié)構(gòu)，搭建原理樣機并完成相應控制系統(tǒng)的開發(fā)。

自動化DNA 組裝儀是一個綜合自動移液、運動控制與循環(huán)控制溫度于一體的多模塊、集成化儀器，對運動的準確定位、精確移液及溫度控制要求較高。如圖1所示，自動化DNA 組裝儀主要由大底板、移液運動模塊及溫度控制模塊3 大結(jié)構(gòu)部分組成。大底板是整個DNA 組裝儀的基礎(chǔ)，分為底板結(jié)構(gòu)設(shè)計和反應試劑裝載區(qū)設(shè)計，大底板是整個儀器的支撐，移液運動、溫度控制等工作均在底板上進行，底板上放置有槍頭盒、試劑盒、廢液池和溫度控制模塊。移液運動模塊包含二維運動平臺和移液器組件2 部分。溫控模塊由溫度循環(huán)模塊及熱蓋結(jié)構(gòu)組成。

圖1 整機設(shè)計架構(gòu)圖

2 結(jié)果與分析

2.1 機械結(jié)構(gòu)

DNA 組裝儀的機械結(jié)構(gòu)組成如圖2 所示。其中，龍門架、大底板、試劑裝載區(qū)構(gòu)成儀器的主題框架；移液器組件、步進電機和直線導軌組成儀器的主要移液運動模塊；熱蓋、溫度循環(huán)模塊構(gòu)成儀器的核心反應溫控模塊。

圖2 DNA 組裝儀硬件系統(tǒng)設(shè)計圖

儀器整體的運動主要體現(xiàn)在移液器模塊帶動反應體系在水平和垂直方向上頻繁往復移動，所以分別選用X、Z 方向上的步進電機，并根據(jù)受力和行程合理設(shè)計導軌的載荷和長度，X 軸的行程是107 cm，速度是72.5 mm/s，Z 軸的行程是27 cm，速度是72.5 mm/s。為了提高儀器移液的精度及移液的效率，本文設(shè)計了一種八連排移液器組件，通過安裝塊搭載在Z 軸機械臂上，在Z 軸和X 軸的步進電機帶動下，準確到達指定的位置。如圖3 所示，移液器組件主要由微量泵、42 直線電機、機械臂安裝板、導向裝置、8 個單獨的移液器通道及限位開關(guān)組成。為了保證吸排液體時的密封性，將移液器與槍頭適配處設(shè)計成楔形的結(jié)構(gòu)，與槍頭可以緊密貼合在一起。

圖3 八連排移液器組件結(jié)構(gòu)圖

溫控模塊的設(shè)計尺寸為足夠放入一塊96 孔的反應小管，并設(shè)計熱蓋進行自動化的開閉。熱蓋結(jié)構(gòu)如圖4 所示，熱蓋內(nèi)單獨設(shè)計加熱片，防止反應體系蒸發(fā)后在管壁或頂部凝結(jié)，且需要與溫度循環(huán)模塊保持緊密接觸。熱蓋設(shè)計有可防蒸發(fā)的高溫模塊和可以自動進行熱蓋開關(guān)的機械運動模塊。

圖4 熱蓋結(jié)構(gòu)設(shè)計圖

溫度循環(huán)模塊為PCR 擴增提供準確的溫度，結(jié)構(gòu)如圖5 所示，由半導體加熱制冷片、溫度傳感器、試管槽、散熱片、散熱擋片及風扇等組成。電壓是15 V，功率為900 W。

圖5 溫度循環(huán)模塊結(jié)構(gòu)設(shè)計圖

2.2 控制系統(tǒng)

DNA 組裝儀控制系統(tǒng)由運動控制系統(tǒng)和溫度控制系統(tǒng)構(gòu)成，其系統(tǒng)框圖如圖6 所示?？刂齐娐分饕芍骺匦酒琒TM32F103 和溫控芯片STC15W4KS4 構(gòu)成雙中央處理結(jié)構(gòu)，其中主控芯片主要負責電機脈沖信號輸出、AD 信號轉(zhuǎn)換、觸摸屏交互、上位機通訊、RCC時鐘控制等，溫控芯片主要作用是接收主控信號、控制加熱片、接收溫度采集信號等。電源轉(zhuǎn)換芯片則將直流電壓進行轉(zhuǎn)換，分別輸出3.3 V 和24 V 到控制芯片和步進電機驅(qū)動器。

圖6 控制系統(tǒng)框圖

在對2 個電機的控制過程中，需要保持反應體系穩(wěn)定性的情況下，盡可能提升電機位移速度，減少計時器的中間等待時長，快速將反應體系加入反應孔中。溫度控制除了要在溫度循環(huán)器和熱蓋上設(shè)置多個熱敏電阻檢測溫度，還需要優(yōu)化閉環(huán)控溫方案、采用PID 算法對控溫參數(shù)進行整定，實現(xiàn)對反應孔和熱蓋溫度的快速、精準、穩(wěn)定控制。

2.3 性能驗證

對自動化DNA 組裝儀進行一次完整的PCR 擴增驗證儀器的溫控性能。PCR 擴增的實驗流程如下：95 ℃3 min，95 ℃10 s，65 ℃5 s，72 ℃1.5 min，變性、退火及延伸這3 個溫度循環(huán)25 次，最后72 ℃延伸5 min，總計用時65 min，商業(yè)化的PCR 儀器（伯樂的T100 Thermal Cycler）做相同的實驗循環(huán)用時85 min，明顯優(yōu)于商業(yè)化的熱循環(huán)儀。溫度結(jié)果如圖7 所示，溫控性能好，能快速達到PCR 擴增需要的溫度。

圖7 DNA 組裝儀溫度測量圖

對DNA 組裝儀的八連排移液器組件進行測試，每次吸取相同體積的去離子水，獨立重復3 次，記錄每次移取液體的體積，結(jié)果見表1，8 個移液通道對應的變異系數(shù)范圍是1.23%～7.55%，移液性能好。

表1 移液性能測試

3 討論

本文對自動化DNA 組裝儀器的設(shè)計進行了研究，從儀器的機械結(jié)構(gòu)、各個模塊的布局、硬件電路的設(shè)計到溫度的控制算法及上位機控制程序的編寫都進行了詳細介紹。機械部件的選型上，選用57HB115L4 兩相步進電機作為X 軸和Z 軸機械臂的驅(qū)動單元，采用MF65 薄膜型熱敏電阻作為溫度傳感器，溫度循環(huán)模塊采用半導體加熱制冷片，導熱材料采用鋁合金6063，風扇和散熱片作為散熱模塊。在電路模塊上，選用TMCM-6110 6 軸步進電機驅(qū)動器對運動模塊的電機進行控制，設(shè)計了主控制器、溫度的采集和控制電路、通訊模塊電路。溫度控制采用簡單易實現(xiàn)的PID 算法，用C 語言編寫了單片機程序，用Python 語言編寫了上位機控制程序。進行了組裝實驗中一次完整的PCR 擴增，記錄了PCR 擴增的溫度變化并繪制成溫度曲線，驗證了溫控系統(tǒng)的性能。對移液器組件的移液性能進行了驗證，變異系數(shù)均小于10%，表明移液器組件的移液性能良好。以上結(jié)果表明，本文所建立的自動化DNA組裝儀器可以滿足DNA 組裝實驗需要的移液條件及溫度循環(huán)條件的要求，但是溫度的檢測量和實際值之間存在小誤差，后續(xù)需要進一步優(yōu)化硬件電路設(shè)計。