鄭州市育齡期健康女性抗磷脂抗體的分布范圍

李爽，崔金全，郭婷婷，歸婧，謝林森，楊小風

(1.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院 婦產科，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學第二附屬醫(yī)院 婦產科，河南 鄭州 450000)

抗磷脂綜合征(anti-phospholipid syndrome，APS)是一種由多種抗磷脂抗體(anti-phospholipid antibody，aPL)介導的非炎癥、多系統受累的免疫性疾病[1]，其特征為存在aPL，例如抗心磷脂抗體(anti-cardiolipin antibody，aCL)、抗β2-糖蛋白1抗體(anti-β2-glycoprotein 1 antibody，aβ2GP1)和狼瘡抗凝物(lupus anticoagulant，LA)。APS有多種臨床表型，復雜多變，包括動靜脈血栓的形成以及產科并發(fā)癥(無法解釋的反復發(fā)作的早期流產、先兆子癇、早產等)[2]等。參考2010年修訂的札幌標準，至少同時滿足1條臨床標準及1條實驗室標準才可明確診斷APS[3]。實驗室標準主要評估的是aPL滴度，aPL持續(xù)性中高滴度是APS重要的血清學標志。隨著研究的深入，發(fā)現aPL與多種分類標準外的臨床表現有密切關聯，并且酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)作為標準推薦的aPL的檢測方法，存在標準化缺乏、實驗操作影響因素較多、實驗室間檢測結果變異系數大等缺陷，因此實驗室選用重復性高、建立由本地健康志愿者及檢測儀器、試劑得到的內部臨界值對于臨床精準診斷、降低誤診漏診率至關重要。本研究可使aPL的檢測更具有特色和地域化，而非單獨參考商品試劑提供的參考閾值，為臨床特異性診斷該疾病、提升臨床診治能力提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料隨機選取2020年1—12月于鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院體檢中心進行體檢的150名至少已正常分娩過1次的20～40歲志愿者為研究對象。排除標準：存在妊娠并發(fā)癥、腫瘤、血栓、自身免疫病、不良孕產史、感染等。最終入組120例健康受試者。志愿者均簽署知情同意書。本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核通過。

1.2 儀器與材料選取鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院檢驗科所用的6種商用試劑(INOVA檢測試劑盒)，分別是aCL和aβ2GP1的IgA、IgG、IgM亞型，使用全自動化學發(fā)光免疫分析儀進行檢測。

1.3 檢測原理本試驗采用化學發(fā)光的2步免疫方法。(1)試劑包含包被心磷脂的磁性顆粒，可以捕獲樣品中aCL。經過孵育、磁性分離和清洗后，加入包含異魯米諾標記的抗人IgA、IgG、IgM抗體示蹤劑，可以結合顆粒上捕獲的抗心磷脂IgA、IgG、IgM抗體。再次經過孵育、磁性分離和清洗后，加入激發(fā)劑，采用全自動免疫分析儀光學系統以相對光單位(relative light unit，RLU)測定該反應所發(fā)的光。RLUs的值與樣品中抗心磷脂IgA、IgG、IgM抗體水平成正比。(2)試劑包含包純化的人抗β2-糖蛋白1的磁性顆粒，可以捕獲樣品中aβ2GP1。經過孵育、磁性分離和清洗步驟后，加入包含異魯米諾標記的抗人IgA、IgG、IgM抗體示蹤劑，可以結合顆粒上捕獲的抗β2-糖蛋白1的IgA、IgG、IgM抗體。再次經過孵育、磁性分離和清洗步驟后，加入激發(fā)劑，采用全自動免疫分析儀光學系統以RLU測定該反應所發(fā)的光。RLUs的值與樣品中抗β2-糖蛋白1的IgA、IgG、IgM抗體水平成正比。

1.4 檢測方法取受試者血液5 mL置于無抗凝劑紅管中，垂直靜置1 h后以3 500 r·min-1離心8 min，檢測前由檢驗科專業(yè)醫(yī)生對全自動化學發(fā)光免疫分析儀進行校準及質控，合格后使用儀器按照標準操作流程檢測血清aCL和aβ2GP1水平。測量單位為CU。1 CU對應的是16.3 μg·L-1的嵌合參考抗體。

1.5 統計學方法采用SPSS 22.0統計軟件進行分析。分別計算aCL和aβ2GP1的IgA、IgG、IgM的第50百分位數、第95百分位數以及第99百分位數。

2 結果

2.1 一般資料120例健康受試者的年齡、體質量指數及籍貫見表1。

表1 健康受試者的一般資料

2.2 aCL及aβ2GP1各型別結果aCL的IgA、IgG、IgM的第99百分位數分別是3.9、20.0、11.0 CU，其中IgA和IgM與廠家截斷值有較大差別，IgG與參考值相同。aβ2GP1的IgA、IgG、IgM的第95百分位數分別是4.0、10.6、35.5 CU，與廠家截斷值均有明顯差別，其中最明顯的是IgA，其次是IgM。見表2。

表2 aCL和aβ2GP1的IgA、IgG、IgM的各型別結果及廠家截斷值/CU

3 討論

APS是一種獲得性自身免疫性血栓形成性疾病，研究表明該病主要發(fā)生在育齡期婦女中，大于50歲的女性發(fā)病率僅為12%[4]。APS可分為原發(fā)性APS、繼發(fā)性APS和災難性APS，其臨床表現多樣且復雜多變，非孕期的APS患者存在血小板減少、血栓形成、溶血性貧血、心臟瓣膜病變等表現，妊娠合并APS的患者多表現為復發(fā)性流產、胎兒生長受限、嚴重子癇前期、早產等，此類患者又被稱為產科抗磷脂綜合征(obstetric antiphospholipid syndrome，OAPS)[5-6]。有研究表明，aPL持續(xù)陽性的女性發(fā)生不良妊娠的概率是正常人群的2～3倍[7]。復發(fā)性流產患者中aPL的陽性率可達5%～20%[8]。研究表明中高滴度的aCL水平與孕婦子癇前期的發(fā)生呈正相關[9]。因此明確診斷APS，提高診斷敏感性，從而進行有效的治療對改善患者妊娠結局十分必要。

APS的診斷依賴于患者的臨床癥狀及標準的實驗室檢查。札幌標準規(guī)定診斷APS需要至少1項臨床癥狀和至少1項實驗室陽性指標[3](LA陽性；中、高滴度的IgG、IgM型aCL；IgG、IgM型aβ2GP1陽性。以上至少檢測到2次，且每次間隔超過12周)。LA檢測過程較為煩瑣，且對于標本的要求較高，現已較少使用。臨床較為常用的為aCL及aβ2GP1。aPL是一組異質性較大的自身抗體，在經典APS及非標準產科APS患者中存在差異，且在系統性紅斑狼瘡等自身免疫病、惡性腫瘤、感染性疾病甚至部分正常人中也可出現低滴度陽性。有研究表明低滴度的aPL陽性率在一般人群中為1%～5%；在無不良妊娠史的育齡期婦女中約為2%，有復發(fā)性流產史的女性中可達到15%[10]。所以使用重復性佳的檢測方法建立屬于本地實驗室的截斷值對避免漏診誤診存在重要意義。

目前，實驗室多采用ELISA檢測aCL和aβ2GP1水平。標準品及標準化操作缺乏共識導致檢測程序標準化較差，實驗室間和分析間存在高度差異[11]?，F在已有新的方法用于檢測aPL水平?；瘜W發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)目前可用于aPL水平檢測。有研究表明CLIA檢測aCL及aβ2GP1的靈敏度及特異性比ELISA高，實驗操作相對快速簡單，并且高度自動化，可減少實驗室間變異[12-15]。本研究中所使用的全自動化學發(fā)光免疫分析儀已證實與ELISA的診斷性能相當[16]。現在CLIA已逐步應用于國內的實驗室。

為了驗證廠商提供的截斷值是否適用于本地，本研究選取了120名健康且至少已正常生產過1次的女性，采用CLIA方法檢測aCL及aβ2GP1的3種亞型，并計算其第99百分位數，可以看出aCL的IgG亞型與廠家截斷值基本一致，但IgA與IgM低于廠家截斷值，而aβ2GP1的IgM高于廠商截斷值，IgG與IgA均低于廠家截斷值。這表明廠家截斷值并不完全適用于本地。按照此次研究得出的截斷值，部分曾無法得到確診的血清學陰性但臨床表現符合APS的患者便可診斷，得到標準內的規(guī)范化治療，極大提高了疾病診斷率，減少臨床漏診誤診，從而為規(guī)范化診療提供一定的參考。

目前臨床診斷APS時，多發(fā)現aCL和aβ2GP1的IgG及IgM滴度增高，IgA陽性較少見。但IgA型aCL和aβ2GP1是aPL的重要組成部分，既往已有研究表明其與不良妊娠及血栓形成有關[17]。第13屆國際抗磷脂抗體大會的共識表明，檢測aCL和aβ2GP1時，優(yōu)先推薦IgM與IgG亞型，當兩者均陰性時檢測IgA亞型[3]。目前支持aCL及aβ2GP1的IgA亞型作為APS的診斷標志物的證據主要為回顧性研究數據，且存在一定局限性，如研究人群的異質性、研究設計、使用的檢測方法以及陽性臨界值等的確定仍存有爭議[18]。有研究表明，盡管所有抗體同種型均對APS具有特異性，但aβ2GP1的IgA亞型對APS的特異性優(yōu)于aβ2GP1的IgM亞型[19]。另有多中心研究(納入5 892例患者)表明，aβ2GP1的IgA亞型陽性與動靜脈血栓以及多種血栓形成的風險增加有關[20]。最近1項針對新型冠狀病毒肺炎患者的研究顯示，3例腦梗死患者血清中aCL及aβ2GP1的IgA亞型均呈高滴度陽性[21]。本研究結果顯示，aCL及aβ2GP1的IgA亞型水平較低，重新定義其截斷值或許對明確診斷APS患者有深遠意義。

本研究中除aCL的IgG亞型與廠商提供的參考區(qū)間基本一致，其余5項指標與其相差較大，可能存在以下原因：檢測標本數量較少，實驗過程存在誤差，部分入組志愿者隱瞞健康狀況，人群的異質性等。應擴大志愿者人群，減少誤差，得到更準確的數據。臨床上表現為APS但aCL及aβ2GP1未達到陽性標準的患者較多，若排除以上因素，是否存在更加具有特異性的指標用于診斷APS值得思考，如抗磷脂酰絲氨酸/抗凝血酶原抗體(anti-phosphatidylserine/prothrombin，aPS/PT)、抗磷脂酰乙醇胺抗體(anti-phosphatidylethanolamine antibodies，aPE)等，已有研究表明這些非標準aPL與血栓形成、產科并發(fā)癥有較強的相關性[22-23]。有研究顯示，同時檢測aPS/PT有助于APS的診斷[24]?？鼓委煵桓蓴_aPS/PT的檢測，此項指標很有可能成為LA的替代指標。目前aPS/PT已被納入APS評分體系中，用于評估個體APS相關血栓風險。

隨著醫(yī)學的進步和科學技術的發(fā)展，aPL的檢測方法將更加規(guī)范化、標準化。在此之前，應根據各地區(qū)受眾人群、檢測方法等的不同建立符合當地特點的參考范圍，從而更加準確地診斷APS患者，為提升臨床診治能力提供一定的參考。