膽管癌腫瘤微環(huán)境與免疫治療

陳 順， 王 俊

1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院(中山市中醫(yī)院) 普外科， 廣東 中山 528400；2 湖南省人民醫(yī)院 肝膽外科， 長(zhǎng)沙 410005

膽管癌(cholangiocarcinoma，CCA)是起源于膽管上皮的惡性腫瘤，根據(jù)解剖位置可分為肝內(nèi)膽管癌、肝門膽管癌和遠(yuǎn)端膽管癌。CCA是原發(fā)性肝癌的一種，發(fā)病率僅次于肝細(xì)胞癌，近30年來的發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢(shì)[1]。CCA發(fā)病隱匿，早期無明顯癥狀，但具有較強(qiáng)侵襲性，極易向膽管壁浸潤(rùn)并侵犯周圍肝組織，多數(shù)患者確診時(shí)即為晚期，無法進(jìn)行根治。對(duì)于早期CCA患者，行根治性肝切除術(shù)已是共識(shí)，然而，即使行根治性切除術(shù)，術(shù)后仍然極易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，術(shù)后5年總體生存率為25%～40%，預(yù)后較差[2]。盡管肝內(nèi)膽管癌、肝門膽管癌和遠(yuǎn)端膽管癌具有各自獨(dú)特的發(fā)病機(jī)制、生物學(xué)特征和臨床表現(xiàn)，但在微環(huán)境構(gòu)成方面具有相似的特點(diǎn)[3]。有研究[4-6]報(bào)道，CCA對(duì)放化療不敏感，這與其獨(dú)特的腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)有著密不可分的關(guān)系。CCA微環(huán)境具有豐富的間質(zhì)纖維化特征，伴有大量浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞和腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)，這種促纖維增生的環(huán)境不僅促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)還導(dǎo)致腫瘤對(duì)治療的耐受性。同時(shí)，腫瘤進(jìn)展很大程度上取決于TME中癌細(xì)胞與非癌組分之間的相互作用，不僅影響腫瘤的發(fā)展，而且影響其對(duì)治療干預(yù)的敏感性和抵抗性。目前，CCA TME相關(guān)轉(zhuǎn)化治療也尚處于探索階段，基于CCA的微環(huán)境尋找新的免疫轉(zhuǎn)化治療是極具潛力的研究方向，筆者就CCA TME和免疫治療近年的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為CCA的進(jìn)一步研究與治療提供參考。

1993年，Loannnides等[7]首次提出TME概念，特指腫瘤發(fā)生、發(fā)展所處的局部環(huán)境，主要包括由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞及其分泌性細(xì)胞因子以及細(xì)胞外基質(zhì)等通過相互作用共同構(gòu)成的有利于腫瘤生存、增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的特殊環(huán)境。TME是腫瘤異質(zhì)性的決定因素，腫瘤細(xì)胞與周圍微環(huán)境彼此依存，相互影響，腫瘤細(xì)胞能夠釋放細(xì)胞外信號(hào)作用于TME，使其產(chǎn)生免疫耐受。同時(shí)，微環(huán)境中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞也可以殺傷腫瘤細(xì)胞，防止其繼續(xù)增殖和轉(zhuǎn)移。CCA的TME是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)微環(huán)境，具有組織缺氧、低pH、間質(zhì)高壓等特點(diǎn)，可以通過自身基質(zhì)和外基質(zhì)細(xì)胞分泌與CCA相關(guān)的調(diào)節(jié)介質(zhì)來構(gòu)建有利于腫瘤細(xì)胞自身發(fā)展的環(huán)境，也可以通過腫瘤細(xì)胞的自分泌和旁分泌方式改變周圍微環(huán)境，共同作用促進(jìn)CCA的進(jìn)展，并且可以增強(qiáng)CCA對(duì)轉(zhuǎn)化治療的耐受性。

1 CCA微環(huán)境特點(diǎn)

CCA的微環(huán)境特征是具有高度纖維化和低血管化的環(huán)境，微觀下呈現(xiàn)豐富的間質(zhì)纖維化特征，并且具有大量的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts，CAF)并伴有促腫瘤和促炎癥免疫細(xì)胞浸潤(rùn)[8-9]。CAF通過產(chǎn)生成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1、成纖維細(xì)胞活化蛋白來誘導(dǎo)CCA細(xì)胞的增殖和侵襲，可直接促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，也可以表達(dá)多種表型標(biāo)志物，如平滑肌肌動(dòng)蛋白，是CCA間質(zhì)纖維化的主要細(xì)胞[10]。CAF釋放多種旁分泌介質(zhì)，包括TGFβ1、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1 (stromal derived factor-1，SDF-1)和細(xì)胞外基質(zhì)成分，如骨膜素、生腱蛋白-C和骨橋蛋白，以及多種基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，如MMP1、MMP2、MMP3和 MMP9[11]。其中，骨膜素的過表達(dá)將激活胞膜上的ITGα5β1受體，從而通過PI3K/AKT通路促進(jìn)CCA的侵襲[12]。此外，SDF-1因子也能夠通過與SDF-1/CXCR4蛋白相互作用來促進(jìn)CCA的侵襲和轉(zhuǎn)移，MMP也可參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解與重塑。因此，CAF通過這些介質(zhì)動(dòng)態(tài)的重塑微環(huán)境以支持腫瘤生長(zhǎng)和侵襲。此外，有研究[13-14]表明，CAF還可以通過影響抗腫瘤免疫細(xì)胞的活性和生存來介導(dǎo)TME的免疫抑制，極大的改變CCA患者預(yù)后。此外，大量證據(jù)表明CAF在調(diào)節(jié)TME在適應(yīng)性免疫中的關(guān)鍵作用，其分泌大量的細(xì)胞因子、趨化因子和促血管生成因子被認(rèn)為是主要產(chǎn)生免疫抑制的微環(huán)境[15]。CAF也表達(dá)高水平的纖維母細(xì)胞活化蛋白(fibroblastactivation protein，F(xiàn)AP)，這是一種膜結(jié)合的絲氨酸蛋白酶，參與細(xì)胞外基質(zhì)的重塑，并且在高侵襲性上皮癌的腫瘤間質(zhì)中也有FAP高表達(dá)[16]。有研究[17]報(bào)道，F(xiàn)AP表達(dá)確定了一部分CAF具有促炎癥基因上調(diào)表達(dá)，通過STAT3-CCL2信號(hào)通道在TME中募集髓系來源的基質(zhì)細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)來促進(jìn)免疫抑制。MDSC不僅可以通過表達(dá)精氨酸酶-1(Arginase-1，Arg-1)和一氧化氮合酶2抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞活化，還通過免疫抑制細(xì)胞因子(如IL-6和IL-10)與調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)行交互作用，從而促進(jìn)腫瘤免疫逃避和免疫治療抵抗[18-19]。除此之外，CCA的TME中還包含有一種特異性的基質(zhì)細(xì)胞充質(zhì)干細(xì)胞，其不僅可以激活Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)途徑來促進(jìn)CCA細(xì)胞的增殖與侵襲性，還可以產(chǎn)生誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、Arg-1和活性氧，通過阻礙干擾素γ信號(hào)傳導(dǎo)途徑來削弱和抑制免疫細(xì)胞的抗腫瘤活性。

缺氧是腫瘤常見的生存環(huán)境。在無氧條件下，腫瘤細(xì)胞利用糖酵解途徑產(chǎn)生大量乳酸并提供能量供給腫瘤細(xì)胞，使其生存，這一過程也被成為Warburg效應(yīng)。對(duì)于CCA來說，缺氧條件能夠通過上調(diào)三葉因子1、去整合素金屬蛋白酶12、整合素A5和BIRC5等腫瘤增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)，下調(diào)UMPS和S100P等腫瘤黏附蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)CCA的侵襲和增殖[20]。缺氧還可以通過肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體/細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路來增強(qiáng)CCA的侵襲性[21]。

2 CCA免疫治療與微環(huán)境

CCA是高度異質(zhì)性腫瘤，目前可用的標(biāo)準(zhǔn)化系統(tǒng)治療選擇極其有限，免疫轉(zhuǎn)化治療是近年來新興療法，尤其是程序性死亡受體1(programmed death-1，PD-1)的免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitor，ICI)、程序性死亡受體-配體1(PD-L1)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4型(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)、癌癥疫苗和過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移組成的免疫療法，在過去10年中蓬勃發(fā)展，在癌癥治療中取得了巨大進(jìn)步[22]。使免疫治療成為繼外科手術(shù)、化學(xué)治療、放射治療之后的又一大支柱。然而，免疫治療的目的是增強(qiáng)自然的抗腫瘤免疫反應(yīng)，包括先天性細(xì)胞[中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)、NK細(xì)胞等]和適應(yīng)性細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞)浸潤(rùn)進(jìn)入TME[23]。在TME中，經(jīng)過改善的免疫環(huán)境和免疫功能的塑造在預(yù)測(cè)免疫治療的反應(yīng)性和確定新的治療策略方面具有巨大的臨床潛力。

圖1 CCA微環(huán)境特點(diǎn)

2.1 靶向治療TME 通過抑制腫瘤的進(jìn)展和侵襲，靶向TME及相關(guān)細(xì)胞治療CCA具有巨大的臨床應(yīng)用前景。與靜止的CAF相比，活化的CAF表達(dá)高水平的B淋巴細(xì)胞瘤-2基因，并且對(duì)該基因抑制劑Navitoclax(ABT-263)更敏感。小鼠動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)證明，Navitoclax可誘導(dǎo)CAF的凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積、基質(zhì)面積減少和腫瘤大小減少[24]。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體是一種酪氨酸激酶受體，參與細(xì)胞增殖和血管生成，多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2異常(包括融合、擴(kuò)增、突變)，并在腫瘤發(fā)生過程中起驅(qū)動(dòng)作用[25]。而CCA(尤其是肝內(nèi)膽管癌)中，發(fā)現(xiàn)存在高頻成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2融合[26]。目前，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體抑制劑的Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示：Infigratinib(BGJ398)、Derazantinib(ARQ087)、Pemigatinib(INCB054828)藥物在發(fā)生成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體融合突變的CCA患者中獲得較高疾病控制率[27-28]。TGFβ1是一種細(xì)胞因子，可激活造血干細(xì)胞和CAF，導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。硫代乙酰胺 (thioacetamide，TAA)會(huì)導(dǎo)致肝纖維化，長(zhǎng)期的TAA治療會(huì)誘發(fā)小鼠的CCA發(fā)生。給予一種抗TGFβ的單克隆抗體1D11，能夠中和3種TGFβ異構(gòu)體，因此減少了TAA誘導(dǎo)的肝纖維化和小鼠CCA的發(fā)展,由此說明，通過抑制纖維生成和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，以造血干細(xì)胞或CAF為靶點(diǎn)可能預(yù)防或治療CCA[29]。除此之外，有研究[30]表明，采用從CCA腫瘤組織中分離出來的CAF培養(yǎng)基處理人CCA細(xì)胞系KKU-213和KKU-100細(xì)胞，可誘導(dǎo)CCA細(xì)胞分泌IL-6，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，表明CCA細(xì)胞和CAF之間存在一定關(guān)聯(lián)。然而，使用白藜蘆醇(一種天然的多酚化合物)預(yù)處理的CAF的培養(yǎng)基可以減少IL-6的分泌和腫瘤細(xì)胞的增殖以及遷移。由此表明，CAF可以作為治療靶點(diǎn)，以開發(fā)CCA的新療法。

已有研究[9]證明腫瘤相關(guān)浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage，TAM)浸潤(rùn)增加影響CCA預(yù)后，在CCA TME中，TAM由趨化因子cc配體2和集落刺激因子1從循環(huán)單核細(xì)胞中募集。TAM通過釋放TNFα和IL-6來調(diào)節(jié)TME以促進(jìn)CCA生長(zhǎng)[32]。由于TAM的促腫瘤作用，選擇性的靶向TAM抑制治療CCA擁有巨大的潛力。

MDSC是未成熟的髓系細(xì)胞，起源于骨髓，在外周血、淋巴組織并在TME中累積，具有強(qiáng)大的免疫抑制特性。此外，MDSC通過表達(dá)Arg-1和一氧化氮合酶2抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞活化，還可以通過免疫抑制性細(xì)胞因子(如IL-6和IL-10)與調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)和巨噬細(xì)胞進(jìn)行交互作用，從而促進(jìn)腫瘤免疫逃避和免疫治療抵抗[33-34]。有研究[35]表明，肝X受體(LXR)/E型載脂蛋白質(zhì)(Apoe)軸與MDSC的存活有關(guān)。同時(shí)，有小鼠模型實(shí)驗(yàn)[36]表明，通過注射LXR激動(dòng)劑(RGX-104/GW3965)，可以通過增強(qiáng)MDSC凋亡，顯著減緩黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和肺癌等幾種癌癥的生長(zhǎng)和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。有研究[37]表明，LXR激動(dòng)劑GW3965增強(qiáng)了PD-1的免疫檢查點(diǎn)抑制作用，達(dá)到治療性靶向TAM和MDSC的目的。目前，LXR激動(dòng)劑(RGX-104/GW3965)正在進(jìn)行Ⅰ期實(shí)體腫瘤患者的臨床試驗(yàn)(NCT02922764)，進(jìn)一步研究MDSC介導(dǎo)的免疫抑制的機(jī)制基礎(chǔ)，和靶向MDSC的藥物對(duì)CCA的治療潛力。

DC是可以激活T淋巴細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞。有研究[38]指出，從健康人中分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞，刺激其分化出DC與人CCA細(xì)胞株KKU-100細(xì)胞提取的蛋白裂解物或總RNA共同培育，與對(duì)照組相比，這些通過CCA細(xì)胞分離的DC可以誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞分化，并增加CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量，由CCA細(xì)胞分離出DC激活的淋巴細(xì)胞通過誘導(dǎo)KKU-213細(xì)胞的凋亡表現(xiàn)出抗癌作用，表明產(chǎn)生激活淋巴細(xì)胞的DC的治療潛力，因此靶向DC是一種十分有前景的免疫治療方法。

2.2 ICI 參與抗腫瘤免疫的T淋巴細(xì)胞活化后，其表面多種抑制性調(diào)節(jié)受體表達(dá)上調(diào)，與腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的相應(yīng)配體結(jié)合，對(duì)免疫反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，下調(diào)腫瘤相關(guān)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度，這些在免疫反應(yīng)中具有抑制性免疫調(diào)節(jié)作用的位點(diǎn)，被稱為免疫檢查點(diǎn)(immune checkpoint)。ICI是目前免疫療法研究熱點(diǎn)[39]，如PD-1的ICI、PD-L1、CTLA-4應(yīng)用十分廣泛。CTLA-4和 PD-1都是由活化T淋巴細(xì)胞表達(dá)的免疫檢查點(diǎn)，可以通過下調(diào)活化T淋巴細(xì)胞的功能來抑制免疫反應(yīng)，從而維持免疫平衡[40]。腫瘤細(xì)胞可以通過刺激這種負(fù)反應(yīng)來提高其生存能力，ICI是通過阻斷這種抑制性反應(yīng)，從而恢復(fù)免疫系統(tǒng)消滅癌細(xì)胞的功能。有研究[41-43]表明，在CCA腫瘤組織中，PD-1和PD-L1高表達(dá)與生存率呈負(fù)相關(guān)，以組織學(xué)分化差，TNM分期高為特點(diǎn)，且PD-L1高表達(dá)與腫瘤區(qū)域CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量增多有關(guān)。在批準(zhǔn)用于CCA的ICI Pembrolizumab(派姆單抗)，作用于PD-1靶點(diǎn)，正在進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗(yàn)，試驗(yàn)顯示可以顯著的改善患者總體生存率，并且可以改善客觀緩解錯(cuò)配修復(fù)缺陷患者的比率。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了派姆單抗可用于無法手術(shù)或轉(zhuǎn)移性實(shí)體腫瘤伴有客觀緩解錯(cuò)配修復(fù)缺陷或高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的患者，該試驗(yàn)包括4例壺腹癌和CCA患者[44-45]。在一項(xiàng)納入40例晚期難治性CCA的臨床研究中，派姆單抗用作二線治療的客觀有效率為10%，三線治療的客觀緩解率為12.5%，中位緩解時(shí)間為6.3個(gè)月；在進(jìn)展性疾病患者中，1例隨后獲得完全緩解，中位無進(jìn)展生存時(shí)間和總生存時(shí)間分別為1.5個(gè)月和4.3個(gè)月，每次接受治療的客觀應(yīng)答與無進(jìn)展生存時(shí)間和總生存時(shí)間顯著相關(guān)，可見派姆單抗檢查點(diǎn)抑制劑治療晚期CCA有一定的效果[46]。還有諸如納武單抗(Nivolumab)、德瓦魯單抗(Durvalumab)等ICI對(duì)于CCA等臨床試驗(yàn)研究正在進(jìn)行中，均證明了ICI對(duì)CCA的有效性[47-48]。

2.3 ICI聯(lián)合靶向藥物 有研究[49]表明，從肝內(nèi)或肝門周圍CCA患者切除的腫瘤組織中分離淋巴細(xì)胞，分析淋巴細(xì)胞亞群發(fā)現(xiàn)CCA腫瘤組織中含有較多的Treg，而NK細(xì)胞、NK T淋巴細(xì)胞和CD3+、CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量較正常肝組織低，同時(shí)，與無腫瘤肝臟的淋巴細(xì)胞相比，CCA組織中的淋巴細(xì)胞表達(dá)高水平的共刺激受體糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體和共抑制受體PD-1和CTLA-4。使用糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體激動(dòng)劑或PD-1、CTLA-4拮抗劑可增加CCA細(xì)胞衍生T淋巴細(xì)胞的增殖和功能。上述研究表明，靶向淋巴細(xì)胞聯(lián)合ICI，如PD-1、PD-L1軸，對(duì)CCA治療擁有巨大潛力，通過恢復(fù)巨噬細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞的功能和誘導(dǎo)CCA細(xì)胞死亡可能導(dǎo)致新的CCA治療方法的發(fā)展。目前，針對(duì) PD-1(NCT02703714、NCT02628067、NCT03111732)和針對(duì)PD-L1(NCT03201458、NCT03818997)的單克隆抗體阿特佐利珠單抗正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

在一項(xiàng)開放、單臂、多中心Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，CAF的生長(zhǎng)因子受體2抑制劑Pemigatinib(培米替尼)對(duì)存在生長(zhǎng)因子受體2融合或重排的107例晚期CCA患者效果顯著，其中3例達(dá)到完全緩解，35例達(dá)到部分緩解，客觀緩解率達(dá)到35.5%，88例患者為病情穩(wěn)定，反應(yīng)持續(xù)時(shí)間為7.5個(gè)月[50]。在一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，派姆單抗聯(lián)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2抗體Ramucirumab(雷莫蘆單孔)治療CCA，其中1例部分緩解，9例穩(wěn)定，中位無進(jìn)展生存時(shí)間和總生存時(shí)間分別為1.6個(gè)月和6.4個(gè)月[51]。透明質(zhì)酸酶可以分解細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸，可有效發(fā)揮抗癌藥物在癌細(xì)胞中治療作用，增強(qiáng)抗腫瘤免疫效應(yīng)，目前其正在臨床試驗(yàn)中。組蛋白脫乙酰酶抑制劑具有免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，可增加腫瘤細(xì)胞表達(dá)主要組織相容性抗原Ⅱ，抑制Treg和MDSC功能[52]，目前也正在進(jìn)行試驗(yàn)。

3 小結(jié)

CCA TME具有高度動(dòng)態(tài)變化性，且具有高度纖維化和低血管化的環(huán)境特點(diǎn)，且含有大量免疫抑制成分如TAM和MDSC，因此放化療對(duì)CCA治療極其有限。大量研究證據(jù)表明微環(huán)境在CCA侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖中發(fā)揮重要作用，其復(fù)雜多變的機(jī)制決定了CCA的異質(zhì)性與惡性程度，免疫治療通過靶向微環(huán)境中自身基質(zhì)和外基質(zhì)細(xì)胞分泌的介質(zhì)或腫瘤趨化因子抑制CCA的進(jìn)展，目前針對(duì)CCA微環(huán)境的免疫治療的研究正在進(jìn)行，并且已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)，其結(jié)果令人期待。CCA TME更全面和完整的機(jī)制有待于進(jìn)一步探索和完善，這將為更高效、更精確治療CCA患者帶來新的突破。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：陳順負(fù)責(zé)資料分析，撰寫論文；王俊負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。