冬小麥lncRNA1808調(diào)控PPP限速酶(Ta6PGDH)抗寒應(yīng)答研究

李沅珊，彭瞰看，田 宇，任治鵬，蒼 晶，徐慶華，王軍虹

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

戊糖磷酸途徑(pentose phosphate pathway，PPP)是植物中糖代謝的重要途徑之一，其主要生理功能是產(chǎn)生還原性NADPH以及生成磷酸戊糖參與核酸代謝，該途徑的中間產(chǎn)物參與脂肪酸和氨基酸等合成，其中6磷酸葡萄糖脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH，EC1.1.1.49)和6磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH，EC1.1.1.44)為PPP限速酶。目前，已經(jīng)分離了一些植物胞質(zhì)或質(zhì)體G6PDH、6PGDH的cDNA克隆，為分子水平解析PPP及G6PDH和6PGDH提供了研究材料。研究表明，PPP與植物的生長發(fā)育和應(yīng)答多種環(huán)境脅迫有關(guān)?！昂弧碧O果腋花芽處于-30 ℃以下低溫時(shí)，呼吸代謝中PPP所占比例增多(即PPP活性增強(qiáng))，而頂花芽在-25 ℃以下低溫時(shí)，PPP活性逐漸減弱；隨低溫處理時(shí)間延長，東方百合鱗片PPP被激活，G6PDH活性先減弱后增強(qiáng)。

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一種長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，根據(jù)其在基因組上的位置分為三類：內(nèi)含子長鏈非編碼RNA(intronic long noncoding RNA)、天然反向轉(zhuǎn)錄本(natural antisense transcript, NAT)和基因間長鏈非編碼RNA(long intergenetic noncoding RNA,lincRNA)。由于lncRNA不具有明顯編碼序列(coding sequence,CDS)，所以沒有編碼蛋白質(zhì)的能力。目前已經(jīng)在玉米、胡楊和小麥中鑒定出許多l(xiāng)ncRNAs。研究表明，lncRNAs作為功能調(diào)控元件是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的重要調(diào)控元件，并參與逆境響應(yīng)過程。例如；甘藍(lán)中的lncRNA(BoNR8)在非生物脅迫和ABA誘導(dǎo)下，在萌發(fā)種子根伸長區(qū)的表皮組織中大量表達(dá)；水稻的lncRNA(LAIR)使多個(gè)LRK基因上調(diào)表達(dá)，其高表達(dá)可提高水稻籽粒產(chǎn)量；植物開花途徑中的關(guān)鍵調(diào)控基因FLC(flowering lous C)的mRNA轉(zhuǎn)錄受兩個(gè)lncRNA(COOLAIR和COLDAIR)調(diào)控。目前有關(guān)lncRNA調(diào)控PPP關(guān)鍵酶基因表達(dá)及活性的研究未見報(bào)道。

小麥?zhǔn)侨祟愔饕Z食作物，低溫(寒)脅迫嚴(yán)重影響小麥的生長和產(chǎn)量。東農(nóng)冬麥1號(hào)(Dn1)是東北農(nóng)業(yè)大學(xué)培育、能在黑龍江省高寒地區(qū)安全越冬的首個(gè)冬小麥品種，大田自然條件下，可耐-30 ℃低溫，返青率高達(dá)85%，是耐寒研究的珍貴材料。前期研究發(fā)現(xiàn)，Dn1的Ta6PGDH積極響應(yīng)寒脅迫，其活性和相應(yīng)基因表達(dá)水平上調(diào)。高表達(dá)Ta6PGDH的擬南芥表現(xiàn)出更好的耐寒性，植株存活率升高、清除ROS能力增強(qiáng)、細(xì)胞質(zhì)和過氧化物酶體中的PPP增強(qiáng)。已經(jīng)構(gòu)建了3個(gè)Dn1抗寒應(yīng)答lncRNA庫(5 ℃庫、-10 ℃庫和-25 ℃庫)，從中篩選出7 098個(gè)表達(dá)差異顯著的抗寒應(yīng)答lncRNAs，參與不同的代謝途徑。但哪一條lncRNA調(diào)控Ta6PGDH還未可知。

基于以上結(jié)果，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)軟件，從Dn1抗寒應(yīng)答lncRNAs庫中篩選調(diào)控PPP關(guān)鍵酶基因表達(dá)差異顯著的lncRNAs，分析篩選出的lncRNAs與靶基因的互作共表達(dá)；用real-time PCR鑒定lncRNA及其靶基因協(xié)同共表達(dá)、應(yīng)答寒脅迫的表達(dá)譜，初步解析lncRNA1808在PPP中應(yīng)答寒脅迫的生物學(xué)功能，闡明lncRNA1808調(diào)控PPP限速酶(Ta6PGDH)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材 料

(1)東農(nóng)冬麥1號(hào)(Dn1) 由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥育種實(shí)驗(yàn)室提供。將Dn1種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田(行長4 m；行距0.2 m；播種深度5 cm；每行播種50粒)，田間常規(guī)水肥管理。大田自然降溫條件下，連續(xù)10 d最低溫度達(dá)5 ℃(2018年10月15日)、0 ℃(2018年11月02日)、-10 ℃(2018年11月23日)和-25 ℃(2019年01月14日)為取樣時(shí)間點(diǎn)，隨機(jī)選取長勢一致的小麥苗，9:00-11:00間取樣葉片和分蘗節(jié)，蒸餾水清洗、濾紙擦干后，剪成1 cm小段，錫紙包裹、液氮速凍后-80 ℃冰箱凍存。

(2)Dn1抗寒應(yīng)答lncRNAs庫 Dn1分蘗節(jié)抗寒應(yīng)答lncRNAs庫(對照組：5 ℃庫；實(shí)驗(yàn)組：-10 ℃庫和-25 ℃庫)，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生理與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室建庫。

1.2 方 法

1.2.1 調(diào)控PPP關(guān)鍵酶的表達(dá)差異顯著lncRNAs的篩選及生物信息分析

以構(gòu)建的3個(gè)Dn1抗寒應(yīng)答lncRNAs庫為研究對象，進(jìn)行生物信息學(xué)分析及功能預(yù)測：(1)KEGG分析并篩選調(diào)控PPP關(guān)鍵酶的表達(dá)差異顯著lncRNAs；(2)Cytoscop分析篩選出的lncRNAs及PPP關(guān)鍵酶互作關(guān)系，聚焦于lncRNA1808及Ta6PGDH；(3)ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)和CPC(http://cpc2.gao-lab.org/)在線軟件分析lncRNA1808序列，驗(yàn)證其遺傳功能；(4)RNAfoldWebSever在線軟件(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)預(yù)測lncRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)；(5)ProtParam在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測Ta6PGDH的一級(jí)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)，ProtScale在線軟件(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)和SWISS-MODEL在線軟件(https://swissmodel.expasy.org/interactive)預(yù)測Ta6PGDH的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)；(6)PlantCARE在線軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測lncRNA1808(TCONS-00021808)和Ta6PGDH(Traes1DLB4E0DFCC9)順式作用元件；(7)Cytoscop繪制lncRNA1808-mRNA(Ta6PGDH)協(xié)同共表達(dá)的表達(dá)譜。

1.2.2 Real-time PCR鑒定lncRNA1808和Ta6PGDH應(yīng)答寒脅迫的表達(dá)譜

用Trizol(康為世紀(jì)Ultrapure RNA Kit)方法提取Dn1葉片及分蘗節(jié)總RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(VazymeR233-01)合成cDNA第一鏈。

使用SYBR試劑盒(ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix)、熒光定量PCR儀(MYCYCLER，美國 BIO-RAD)進(jìn)行real-time PCR，小麥為內(nèi)參基因，具體引物見表1。反應(yīng)體系：2×ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，cDNA模板 2 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddHO 補(bǔ)足至20 μL)，反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s;95 ℃ 15 s,60 ℃ 34 s,40個(gè)循環(huán)；4 ℃∞。采用2法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

表1 PCR所用引物

1.2.3 同源克隆lncRNA1808序列全長

采用CTAB法提取Dn1分蘗節(jié)的基因組DNA，用RNase(康為世紀(jì)生物科技有限公司)純化DNA樣品。

用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)特異性引物(表1)：上游引物為lncRNA1808-F，5′端插入GGCTTAAU(PacI酶切位點(diǎn))特定序列；下游引物為lncRNA1808-R，5′端插入GGTTTAAU(PacI酶切位點(diǎn))特定序列；合成引物(博仕生物)。

以提取的總DNA為模板，以lncRNA1808-F/lncRNA1808-R為特異性引物，使用2×Taq Plus MasterMix(Dye)Kit(康為世紀(jì)生物科技有限公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增的特異性片段，插入pClone007載體，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5α，獲得陽性菌株(pClone 007-lncRNA1808)經(jīng)鑒定后，送生化公司測序并鑒定。

1.2.4 構(gòu)建過表達(dá)lncRNA1808載體

將鑒定序列正確的pClone007-lncRNA1808質(zhì)粒經(jīng)USERTM酶切消化后，回收lncRNA1808特異性片段，插入經(jīng)和雙酶切的pCAMBIA230035Su線性載體，連接液轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5α，經(jīng)鑒定后，獲得含過表達(dá)載體pCAMBIA230035sU-lncRNA1808的陽性菌株，送生化公司測序并鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，圖表制作由SPSS 22軟件完成，用Prism 6.0進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 lncRNA1808的功能預(yù)測及鑒定

2.1.1 鑒定TCONS-00021808(lncRNA1808)的編碼潛能

TCONS-00021808的序列全長495 bp，位于小麥 1D染色體444 147 161～444 147 655 bp處，命名其為lncRNA1808。用ORF finder在線軟件分析lncRNA1808序列全長發(fā)現(xiàn)，lncRNA1808潛在最長ORF為85個(gè)氨基酸，最短ORF為25個(gè)氨基酸(表2)。將上述預(yù)測的短ORF經(jīng)NCBI Blastp在線軟件比對后未找到有效的匹配，說明潛在編碼的ORF未知或不存在；用CPC在線軟件分析lncRNA1808序列全長后得知，其編碼能力得分為0.043 954 2，是不完整性O(shè)RF，屬于非編碼類型，不具備編碼能力(圖1)。綜上，確定TCONS-00021808為lncRNA，將其命名為lncRNA1808。

A:Blastp分析結(jié)果；B:CPC分析結(jié)果。

表2 ORF finder分析lncRNA1808的ORF

2.1.2 lncRNA1808二級(jí)結(jié)構(gòu)

應(yīng)用RNAfold在線軟件預(yù)測lncRNA1808的最小自由能(minimum free energy，MFE)結(jié)構(gòu)，lncRNA1808的最佳二級(jí)結(jié)構(gòu)的MFE為-55.80 kcal·mol；富含穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且“大環(huán)”較多(圖2)。莖環(huán)結(jié)構(gòu)在RNA與RBPs(RNA結(jié)合蛋白)互作中發(fā)揮重要作用。推測，lncRNA1808在調(diào)控靶基因表達(dá)的過程中，可能通過“大環(huán)”結(jié)合某些RBPs與“l(fā)ncRNA-靶基因”共同形成復(fù)合物，在Dn1應(yīng)答寒脅迫中發(fā)揮重要作用，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。lncRNA1808二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測，為解析其生物學(xué)功能和揭示其參與的調(diào)控機(jī)制提供重要理論 依據(jù)。

圖2 lncRNA1808最佳二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

2.1.3 lncRNA1808靶基因預(yù)測及鑒定

從已構(gòu)建的3個(gè)lncRNAs庫(5 ℃庫、-10 ℃庫和-25 ℃庫)中共檢測到7 098個(gè)抗寒應(yīng)答lncRNAs，通過KEGG分析篩選到20條lncRNAs調(diào)控PPP關(guān)鍵酶基因的表達(dá)差異顯著(表3)。通過Cytoscape軟件預(yù)測并繪制lncRNA1808-靶mRNA(Ta6PGDH)互作關(guān)系如圖3。初步確定：Ta6PGDH是lncRNA1808的靶基因。

表3 KEGG分析差異表達(dá)lncRNA1808及其靶基因(PPP關(guān)鍵酶)

粉色：lncRNA；藍(lán)色：靶基因。

2.1.4 lncRNA1808-靶基因互作對分析

鑒于lncRNA的調(diào)控模式中，存在lncRNA與鄰近基因協(xié)同表達(dá)或調(diào)控其表達(dá)的模式，應(yīng)用Cytoscape軟件分析lncRNA1808及其上下游100 kb的mRNA進(jìn)行blast比對。結(jié)果表明，lncRNA1808與18個(gè)靶mRNA是共表達(dá)的互作對，包括11個(gè)正相關(guān)和7個(gè)負(fù)相關(guān)。lncRNA1808和mRNA(Ta6PGDH)為自由能小于-30的互作對(identity>95%; E value<1E-5)，lncRNA1808-mRNA(Ta6PGDH)正向共表達(dá)，同時(shí)mRNA(Ta6PGDH)間接通過lncRNA9163(TCONS_00199163)和lncRNA6323(TCONS_00226323)調(diào)控其靶mRNA——焦磷酸依賴性磷酸果糖激酶(pyrophosphate dependent phosphofructokinase,PPi-PFK,EC.2.7.2.90)的正表達(dá)(圖4)。

橙色和紅色方塊:mRNA;深和淺綠色:lncRNA;藍(lán)色實(shí)線:lncRNA和mRNA正相關(guān);藍(lán)色虛線:lncRNA和mRNA負(fù)相關(guān)。

2.1.5 Ta6PGDH和lncRAN1808順式作用元件分析及功能預(yù)測

順式作用元件(cis-acting element)存在于基因旁側(cè)序列中，影響基因的表達(dá)。順式作用元件包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、調(diào)控序列和可誘導(dǎo)元件等，參與基因表達(dá)的調(diào)控。應(yīng)用Plant CARE在線軟件自轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1.5 kb開始分析Ta6PGDH和lncRNA1808的順式作用元件，分析結(jié)果見表4和5。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)目的基因共同含有的順式作用元件包括：核心啟動(dòng)子元件(CAAT-box、TATA-box)、響應(yīng)環(huán)境因子元件(ARE、MBS)、光響應(yīng)元件(Box-4)和植物激素響應(yīng)元件(ABRE、AuxRR-core)。其中，CAAT-box和TATA-box是轉(zhuǎn)錄真核基因啟動(dòng)子序列中轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，CAAT-box是參與轉(zhuǎn)錄RNA基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，參與RNA轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控；在調(diào)節(jié)胭脂堿合酶啟動(dòng)子中起重要作用；TATA-box是參與轉(zhuǎn)錄組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。Ta6PGDH和lncRNA1808序列中均預(yù)測出這些元件，說明它們的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平被調(diào)控。ABRE是ABA響應(yīng)元件，AuxRR-core是AUX響應(yīng)元件，可見Ta6PGDH和lncRNA1808的表達(dá)被ABA和AUX信號(hào)通路調(diào)控。Box-4是光響應(yīng)元件，可見Ta6PGDH和lncRNA1808不但受溫度的調(diào)控也受到光的調(diào)控。Dn1的Ta6PGDH和lncRNA1808應(yīng)答寒脅迫的過程是細(xì)胞內(nèi)激素、光照、溫度、水分等綜合因素調(diào)控的過程，具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

表4 Ta6PGDH基因啟動(dòng)子元件

表5 lncRNA1808啟動(dòng)子元件

2.2 Ta6PGDH的理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)及親疏水性預(yù)測

小麥的CDS長592 bp，編碼178個(gè)氨基酸(圖5)。采用ProtParam在線網(wǎng)站分析其理化性質(zhì)表明，Ta6PGDH蛋白半衰期30 h；脂肪族指數(shù)89.89；有18個(gè)負(fù)電荷的氨基酸殘基，包含8個(gè)天冬氨酸(Asp)和10個(gè)谷氨酸(Glu)；有28個(gè)正電荷氨基酸殘基，包含19個(gè)精氨酸(Arg)和9個(gè)賴氨酸(Lys)；不穩(wěn)定指數(shù)(II)24.52，是一種穩(wěn)定蛋白，穩(wěn)定性相對較好；平均親水系數(shù)-0.278，為親水蛋白；等電點(diǎn)9.67，為堿性蛋白；相對分子質(zhì)量為20 351.52 Da，氨基酸化學(xué)式是CHNOS。氨基酸組成中含量最高的是精氨酸(Arg)，占10.7%,含量最低的是組氨酸(His)，占1.1%。

圖5 Ta6PGDH的氨基酸序列

借助HNN方法分析的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，共含有105個(gè)α-螺旋(58.99%)、11個(gè)延伸鏈(6.18%)、9個(gè) β-轉(zhuǎn)角(5.06%)、53個(gè)無規(guī)卷曲(29.78%)，證明其二級(jí)結(jié)構(gòu)為混合型(圖6)。采用SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模(PyMOL視圖)，得到的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型如圖7，其中螺旋部位代表螺旋，箭頭部位代表折疊，線型部位代表無規(guī)則卷曲，從圖7可以看出，α-螺旋、無規(guī)則卷曲為主要的結(jié)構(gòu)原件，占據(jù)了很大一部分空間。ProtScale分析(圖8)表明，小麥6PGDH氨基酸殘基整體表現(xiàn)為親水性，與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致，因此推測其為親水性蛋白。

Ta6PGDH蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。藍(lán)線為α-螺旋，紅線為延伸鏈，綠線為 β-轉(zhuǎn)角，粉線為無規(guī)卷曲。

圖7 Ta6PGDH的三級(jí)結(jié)構(gòu)

分?jǐn)?shù)的正、負(fù)分別代表疏、親水性。

2.3 lncRNA1808-mRNA(Ta6PGDH)表達(dá)譜

由圖9可見，在分蘗節(jié)中，隨著溫度降低，lncRNA1808的表達(dá)量呈先降低后升高的變化規(guī)律，0 ℃時(shí)相對表達(dá)量最低，而后顯著升高，-25 ℃時(shí)達(dá)到峰值。lncRNA1808的靶基因的相對表達(dá)量也隨溫度降低而呈先降低后升高的變化規(guī)律，-10 ℃時(shí)相對表達(dá)量最低，-25 ℃時(shí)達(dá)到峰值。說明lncRNA1808對靶基因?yàn)檎蛘{(diào)控。

圖柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖10同。

由圖10可見，在葉片中，從整體上看lncRNA1808的相對表達(dá)量隨著溫度的降低呈持續(xù)降低的趨勢，-25 ℃時(shí)降到最低，但各溫度間差異不顯著。靶基因的表達(dá)量在0 ℃時(shí)達(dá)到峰值，隨后顯著下降，-25 ℃時(shí)表達(dá)量趨近于0。推測PPP中l(wèi)ncRNA1808正向調(diào)控靶基因主要在分蘗節(jié)中發(fā)揮抗寒作用。

圖10 Dn1葉片中l(wèi)ncRNA1808和 Ta6PGDH不同溫度下的相對表達(dá)量

2.4 lncRNA1808全長克隆及過表達(dá)載體構(gòu)建

用lncRNA1808-F/lncRNA1808-R(表1)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增lncRNA1808，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測得到約495 bp的特異性條帶(圖11)，與預(yù)期目的條帶大小一致。目的條帶回收后進(jìn)行載體連接(圖12)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，陽性菌株(pClone 007-lncRNA1808)，送測序(睿博興科)并與小麥數(shù)據(jù)庫中基因序列比對后，確定獲得lncRNA1808全長(圖13)。

M:2 000 bp DNA marker; 1:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖12 lncRNA1808重組質(zhì)粒示意圖

圖13 特異性片段序列與小麥基因組比對

3 討 論

近些年，糖代謝途徑在植物低溫脅迫中的反應(yīng)備受關(guān)注。相關(guān)研究表明，植物的生長發(fā)育和各種非生物脅迫都與PPP有緊密的聯(lián)系，在寒脅迫下植物中的可溶性糖含量發(fā)生變化，其糖代謝相關(guān)酶的活性同時(shí)受到影響；植物幼苗受低溫馴化時(shí)PPP效率提高，能增強(qiáng)植物的抗性。目前，對于PPP功能的研究主要是圍繞6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphate dehydrogenase，6PGDH,EC1.1.1.44)、6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯酶(6-phosphogluconolactonase，PGL,EC:3.1.1.31)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH/G6PD,EC:1.1.1.49)等有關(guān)酶展開。

從PPP代謝途徑相關(guān)的酶入手，通過KEGG分析篩選出能夠調(diào)控PPP關(guān)鍵酶基因表達(dá)的lncRNA，經(jīng)多種網(wǎng)絡(luò)途徑比對，篩選出共同作用的酶有：果糖-二磷酸醛縮酶、6-磷酸果糖激酶(PFK)、葡萄糖-6磷酸異構(gòu)酶(G6PI)和6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6PGDH)。6PGDH是PPP的與第二個(gè)脫氫酶，因?yàn)樗诖蠖鄶?shù)生物中是單向的，被認(rèn)為是氧化戊糖磷酸途徑中的關(guān)鍵步驟之一。近幾年已分別從水稻、擬南芥、金針菇等生物中克隆到該基因并進(jìn)行了功能研究。例如：在鹽脅迫下，水稻中的6PGDH在芽中上調(diào)，其有可能在鹽脅迫中起重要作用；6PGDH在蘋果果肉中表達(dá)量較高，且有助于愈傷組織的生長。本研究結(jié)果表明，對Dn1分蘗節(jié)抗寒有著重要作用，5 ℃、0 ℃和-10 ℃時(shí)，其分蘗節(jié)中的表達(dá)量逐漸降低；-25 ℃時(shí)，相對表達(dá)量急速升高，推測會(huì)使PPP增強(qiáng)，為植物生物合成提供原料和專一性供體，確保ATP的生成和利用。其代謝終產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖的積累也會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞滲透壓，并增強(qiáng)細(xì)胞抵御寒脅迫的傷害。

lncRNA在植物生長和脅迫響應(yīng)中起關(guān)鍵的調(diào)控作用，如花椒的干旱脅迫、大麥的低氮脅迫和木薯的低溫脅迫。相關(guān)研究表明，lncRNA響應(yīng)干旱脅迫，參與線粒體和葉綠體膜穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)，有助于維持光合作用和呼吸的正常運(yùn)行。本研究從Dn1寒脅迫相關(guān)的lncRNA1808入手，以PPP為背景，通過生物信息學(xué)分析確定lncRNA1808的ORF具有不完整性，不具備編碼能力，屬于非編碼RNA。共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)blast比對與RNAplex計(jì)算，確定結(jié)合自由能小于-30的lncRNA1808和lncRNA9332是PPP的正向調(diào)控因子，而lncRNA1808對調(diào)控限速酶Ta6PGDH發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。當(dāng)Dn1受到低溫脅迫時(shí)，葉片中的lncRNA1808的相對表達(dá)量在各溫度間差異不顯著，且與不存在正向調(diào)控關(guān)系，說明調(diào)控模式關(guān)系有組織差異性，推測其與啟動(dòng)子順式作用元件中包含分生組織表達(dá)的CAT-box元件有關(guān)。分蘗節(jié)中的lncRNA1808因響應(yīng)低溫環(huán)境表達(dá)量呈先降后升趨勢，它的升高增加了靶基因的表達(dá)量，同時(shí)增強(qiáng)PPP代謝途徑，從而為Dn1提供能量及代謝產(chǎn)物，增強(qiáng)其抗寒性。

綜上，低溫下Dn1的lncRNA1808可能正向調(diào)控其靶基因，進(jìn)而介導(dǎo)PPP代謝途徑響應(yīng)低溫脅迫。目前l(fā)ncRNA1808介導(dǎo)Dn1抗寒的分子機(jī)制尚不清楚，但本研究成功克隆lncRNA1808并構(gòu)建過表達(dá)載體，隨后將進(jìn)一步通過分析轉(zhuǎn)基因株系在低溫脅迫下的抗寒表型以及低溫脅迫前后各項(xiàng)生理指標(biāo)的變化初步確定了lncRNA1808的生物學(xué)功能，為從分子水平深入解析lncRNA調(diào)控冬小麥的抗寒應(yīng)答機(jī)制提供研究材料和思路。