2019年浙江省部分地區(qū)小麥赤霉病菌種群組成及其對殺菌劑的敏感性調(diào)查

趙心雨，郭宇燕，張 璐，賴朝暉，黃福旦，胡東維，梁五生

(1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部作物病蟲分子生物學(xué)重點實驗室/浙江省作物病蟲生物學(xué)重點實驗室，浙江杭州 310058；2.浙江省象山縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江象山 315700；3.浙江省杭州市蕭山區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江杭州 311203)

赤霉病(Fusarium head blight)是由赤霉病菌侵染小麥引起的一種常見真菌性病害，可導(dǎo)致麥穗枯萎，在世界范圍內(nèi)各麥區(qū)廣泛發(fā)生，可造成小麥嚴(yán)重減產(chǎn)。赤霉病菌為一類鐮孢菌復(fù)合種，包含禾谷鐮孢菌()、亞洲鐮孢菌()、梨孢鐮孢菌()等多種鐮孢菌，目前已鑒定出23種鐮孢菌。不同的鐮孢菌產(chǎn)生不同的毒素，不同的毒素具有不同的毒性，根據(jù)產(chǎn)毒類型可將鐮孢菌產(chǎn)生的毒素分為不同的毒素化學(xué)型。此外，不同鐮孢菌的侵染方式、產(chǎn)孢作用以及對殺菌劑的敏感性等均存在差異。由于氣候條件、耕種方式等方面的影響，不同地區(qū)赤霉病菌的種群組成可能不同，鑒定不同麥區(qū)赤霉病菌菌株的種群組成，可為在氣候變化大背景下調(diào)整輪作方式、預(yù)測評估風(fēng)險等提供依據(jù)。

小麥?zhǔn)钦憬〉诙蠹Z食作物，赤霉病一直嚴(yán)重影響浙江省的小麥生產(chǎn)。1954―1977年中，小麥赤霉病中、重病年份占70%以上。2006―2015年間的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，小麥赤霉病在浙江省偏重流行，其中2012、2014和2016年浙江省發(fā)生較為嚴(yán)重。因此，該病在浙江省長期偏重流行的原因值得深入研究。

對于浙江省小麥赤霉病菌的種群組成，雖然目前已有研究報道，但鑒定時間較早。因此，本研究于2019年對浙江省部分地區(qū)小麥赤霉病菌的種群組成進(jìn)行分析，并調(diào)查其對殺菌劑的敏感性，以期為科學(xué)防病控病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 田間稻樁赤霉病菌子囊殼陽性率的調(diào)查及其孢子萌發(fā)活性的檢測

于2019年3月份，在浙江省3個地區(qū)(杭州市蕭山區(qū)、杭州市桐廬縣、寧波市象山縣)的麥田，隨機拔取一定數(shù)量上一年種植水稻收割后遺留的稻樁，逐一檢查稻樁上是否存在赤霉病菌子囊殼，統(tǒng)計陽性稻樁的數(shù)量并計算陽性率。隨機抽取部分陽性稻樁，帶回實驗室，用鑷子夾取若干子囊殼置于載玻片上，擠壓使其破裂，加無菌水懸浮，吸取部分懸浮液涂布于PDA培養(yǎng)基平板上。將載有子囊殼懸浮液的載玻片和涂布子囊殼懸浮液的PDA平板均靜置于25 ℃培養(yǎng)箱中，每隔2 h觀察PDA平板上的菌落生長情況，并用光學(xué)顯微鏡觀察載玻片上孢子的萌發(fā)情況，檢測子囊殼中孢子的萌發(fā)活性。

1.2 田間空氣中赤霉病菌游動孢子數(shù)量的調(diào)查

于2019年3-5月，在3個地區(qū)麥田，取滅過菌的直徑為9.0 cm的培養(yǎng)皿，加適量滅菌水(約7 mL，以淹沒培養(yǎng)皿底部為標(biāo)準(zhǔn))，開蓋后置于離麥田地面約1.5 m的高度處，捕獲空氣中的赤霉病菌游動孢子。每月調(diào)查一次，三次調(diào)查中每個地點隨機放置10套培養(yǎng)皿，記錄捕獲時間，2～4 h后蓋好皿蓋，帶回實驗室，在無菌操作臺上先加入適量鏈霉素以防止細(xì)菌污染，再加入10 mL PDA固體培養(yǎng)基，然后置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，3 d后觀察PDA平板并統(tǒng)計各平板上具有莧菜紅特征的菌落數(shù)量，即為捕獲的空氣中赤霉病菌游動孢子數(shù)量。

1.3 田間小麥赤霉病病穗率的調(diào)查

于2019年4月上旬(4月10日)、中旬(4月16日)和下旬(4月27日)，調(diào)查3個地區(qū)麥田小麥(以揚麥20、揚麥24為主導(dǎo)品種)的赤霉病病穗率，病穗的判定標(biāo)準(zhǔn)為麥穗上至少有1個麥粒的外殼被明顯漂白。每個地區(qū)每次至少調(diào)查3個不同田塊，每個田塊至少隨機調(diào)查100個麥穗。

1.4 赤霉病菌菌株的分離

于2019年4月，從3個地區(qū)的麥田隨機采集小麥病穗，帶回實驗室，參考史文琦等的單孢分離方法，獲得純化菌株，逐一編號、保存。

1.5 赤霉病菌種群組成的鑒定

從分離的小麥赤霉病菌菌株中隨機選擇32個，參考Geiser等的方法，通過比對()基因的序列來鑒定分離到的赤霉病菌菌株的種名。具體方法：先用基因組提取試劑盒(上海生工生物科技有限公司)提取菌株的基因組DNA。然后以基因組DNA為模板，用引物EF-1[5′-ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC-3′]和EF-2[5′-GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT-3′]進(jìn)行擴增。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包含DNA模板1 μL， 2×HieffPCR Master Mix(with Dye)(上海翌圣生物科技有限公司)10 μL，EF-1(10 μmmol·L) 1 μL，EF-2(10 μmmol·L) 1 μL，ddHO 7 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收并純化目的片段，送北京擎科生物科技有限公司杭州分公司測序。將所得到的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，確定分離到的赤霉病菌菌株的種名。

1.6 赤霉病菌對多菌靈抗性的檢測

參考王建新等的方法，分別配制不含多菌靈和含10 mg·L多菌靈的PDA培養(yǎng)基平板，先用不含多菌靈的PDA平板培養(yǎng)赤霉病菌，然后從菌落邊緣切取菌碟，接種于含多菌靈的PDA培養(yǎng)基平板中央，置于培養(yǎng)箱中在25 ℃下培養(yǎng) 3 d，每個菌株平行重復(fù)3皿，在含多菌靈的PDA平板上均能生長的菌株被認(rèn)定為多菌靈的抗性菌株。

1.7 四種殺菌藥劑有效抑制赤霉病菌中濃度(EC50)的測定

測定的四種殺菌藥劑分別為75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑(拜耳股份有限公司)、40%戊唑·咪鮮胺水乳劑(佛山市盈輝作物科學(xué)有限公司)、30%唑醚·戊唑醇懸浮劑(江蘇生久農(nóng)化有限公司)和25%氰烯菌酯懸浮劑(江蘇省農(nóng)藥研究所股份有限公司)。參考王建新等的菌落直徑法，測定上述4種殺菌藥劑對分離到的赤霉病菌菌株的EC。每種殺菌藥劑均測定16個分離菌株，包括前期試驗鑒定到的8個多菌靈抗性菌株和8個非抗性菌株。

1.8 殺菌藥劑按不同方案混配后對赤霉病菌抑制效果的比較

利用已測定的EC濃度數(shù)值，分別配制含上述4種殺菌藥劑中任意2種的PDA培養(yǎng)基平板，每種殺菌藥劑的濃度是其EC值的50%，共得到6種殺菌藥劑混配PDA培養(yǎng)基平板。然后參考王建新等報道的殺菌藥劑EC值測定方法，并取其所用的16個分離菌株，測定各混配方案對病菌生長的抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間稻樁的赤霉病菌子囊殼攜帶率及子囊孢子的萌發(fā)活性

2019年3月，小麥拔節(jié)期3個地區(qū)麥田均可見到稻樁殘留，抽樣調(diào)查的結(jié)果(表1)顯示，3個地區(qū)麥田稻樁的赤霉病菌子囊殼攜帶率有一定差異，變化范圍為26.4%～55.4%，平均值為43.9%。

表1 田間檢出赤霉病菌子囊殼的稻樁百分率Table 1 Percentages of rice stubbles with perithecia of Fusarium spp. in the fields

將稻樁上的赤霉病菌子囊殼擠壓破裂后制備懸浮液，吸取部分懸浮液涂布于載玻片上，用光學(xué)顯微鏡可觀察到紡錘形子囊孢子，無色，隔膜為 1～3個，未萌發(fā)子囊孢子的長度可達(dá)約30 μm(圖1A)。將涂布子囊殼懸浮液的載玻片置于 25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，可觀察到部分子囊孢子已長出芽管，表明部分孢子已經(jīng)開始萌發(fā)(圖1B)；培養(yǎng)6 h后，部分芽管伸長成菌絲(圖1C)；繼續(xù)培養(yǎng)14和18 h，可觀察到從子囊孢子上長出的菌絲進(jìn)一步伸長(圖1D、1E)。取部分子囊殼制備的懸浮液涂布于PDA平板上，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，可觀察到具有莧菜紅特征的赤霉病菌菌落(圖1F、1G)。上述孢子萌發(fā)試驗結(jié)果表明，在合適的條件下，田間稻樁赤霉病菌子囊殼中的子囊孢子能夠正常萌發(fā)長出菌絲，菌絲可快速生長形成菌落。

A～E分別為子囊孢子在載玻片上培養(yǎng)0、2、6、14和18 h后的圖片。F和G分別為子囊孢子在PDA平板上培養(yǎng)2 d后形成的菌落正面照片和背面照片。

2.2 田間空氣中赤霉病菌的游動孢子數(shù)

2019年3月，每個培養(yǎng)皿平均每小時從3個地區(qū)的麥田空氣中捕獲到的赤霉病菌游動孢子數(shù)平均值為6.7個；2019年4月和5月捕獲到的赤霉病菌游動孢子數(shù)平均值均為1.6個，顯著少于3月(表2)。

2.3 田間小麥的赤霉病病穗率

2019年4月上、中、下旬，調(diào)查3個地區(qū)田間小麥的赤霉病病穗率，結(jié)果(表3)顯示，4月中旬田間小麥開始出現(xiàn)病穗，然后病穗率快速攀升，4月下旬有12.3%的麥穗表現(xiàn)出赤霉病癥狀。

2.4 赤霉病菌的種群組成

從3個地區(qū)的小麥病穗中共分離到386個赤霉病菌菌株，隨機選擇32個菌株進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，32個菌株均可擴增到大小約700 bp的目的片段，其中16個菌株P(guān)CR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。將上述目的片段回收純化后，送北京擎科生物科技有限公司杭州分公司進(jìn)行測序，結(jié)果顯示，檢測的32個分離菌株均為亞洲鐮孢菌()，序列相似度均為100%，表明是3個地區(qū)赤霉病菌的優(yōu)勢種。

2.5 赤霉病菌分離菌株對多菌靈的抗性

對分離到的386個赤霉病菌菌株的多菌靈抗性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)菌株在含10 mg·L多菌靈的PDA平板培養(yǎng)3 d后，314個菌株的菌落未見任何擴展，為非抗性菌株，如圖3中的菌株1、2、3，占所有分離菌株的81.35%；另外72個菌株的菌落有所擴展，為抗性菌株，如圖3中的菌株4、5、6，占所有分離菌株的18.65%。

2.6 赤霉病菌分離菌株對殺菌藥劑的敏感性

選取目前市場主推的4種殺菌藥劑(75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑、40%戊唑·咪鮮胺微乳劑、30%唑醚·戊唑醇懸浮劑、25%氰烯菌酯懸浮劑)對分離到的16個赤霉病菌菌株(8個抗性菌株和8個非抗性菌株)的EC值進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)8個抗性菌株和8個非抗性菌株的EC值無統(tǒng)計學(xué)差異，因此取所有16個分離菌株的EC值平均值作為各殺菌藥劑的EC值。從表4可以看出，75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑和30%唑醚·戊唑醇懸浮劑對分離到的16個赤霉病菌菌株的EC值均低于5.0 mg·L，40%戊唑·咪鮮胺微乳劑和25%氰烯菌酯懸浮劑對分離到的16個赤霉病菌菌株的EC值均低于2.0 μL·L，表明上述4種殺菌藥劑對浙江赤霉病菌株均具有良好的抑菌效果。

表2 不同時期從麥田空氣中捕獲到的赤霉病菌的游動孢子數(shù)(2019)Table 2 Number of zoospores of Fusarium spp. trapped from the wheat fields air at different stages(2019)

進(jìn)一步將上述4種殺菌藥劑進(jìn)行兩兩混配，然后測定16個赤霉病菌菌株的抑菌效果，結(jié)果(表5)顯示，混配方案“75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑”+“30%唑醚·戊唑醇懸浮劑”的抑菌率最高。

表3 不同時期田間小麥的赤霉病病穗率(2019)Table 3 Percentage of diseased spikes with Fusarium head blight in the fields at different stages(2019)

M:DL1500；W：H2O(陰性對照)；1～16：16個分離菌株。

表4 四種殺菌藥劑對赤霉病菌分離菌株的EC50值Table 4 EC50 values of four fungicidal agents to the isolated strains of Fusarium spp.

圖3 分離到的赤霉病菌菌株對多菌靈的抗性表現(xiàn)

表5 四種殺菌劑兩兩混配方案對赤霉病菌菌絲生長的抑制率Table 5 Inhibition rates of pairwise mixing four tested fungicidal agents on the mycelial growth of the isolated strains of Fusarium spp. %

3 討 論

3.1 田間的赤霉病菌子囊孢子的釋放

Karlsson等研究證實，農(nóng)田殘留物上的孢子是小麥赤霉病重要的侵染源。本研究結(jié)果表明，3月份浙江省田間大部分稻樁都攜帶赤霉病菌子囊殼，其釋放的子囊孢子在合適的條件下能快速萌發(fā)長成菌落。浙江省地處典型的亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，四季分明，冬季氣溫偏低，赤霉病菌以子囊殼越冬。到了3月份，浙江省氣溫快速回升，降雨量也比冬季明顯增多，因此子囊殼開始釋放孢子。浙江省屬冬小麥產(chǎn)區(qū)，大部分小麥于4月上旬開始抽穗，此時病穗率為零，表明新穗不帶病原菌。小麥從齊穗期至灌漿初期，尤其是盛花末期，是赤霉病菌最易侵染麥穗的時期。本研究結(jié)果表明，4月中旬開始出現(xiàn)病穗，隨后病穗率快速攀升，推測這些病穗是由4月份田間稻樁赤霉病子囊殼釋放的孢子侵染麥穗后產(chǎn)生的。捕獲結(jié)果顯示，3月份浙江省麥田空氣中赤霉病菌游動孢子數(shù)約是4月份和5月份的4倍，表明赤霉病菌子囊孢子主要在3月份釋放。3月份釋放的赤霉病菌孢子是否可侵染小麥或其他寄主而產(chǎn)生次生孢子，繼而在4-5月份參與侵染麥穗，尚不 清楚。

3.2 赤霉病菌種群的組成

國內(nèi)外學(xué)者研究表明，不同地區(qū)小麥赤霉病菌的種群組成存在差異，國內(nèi)菌株主要為和，其中為北方地區(qū)的優(yōu)勢種，為南方地區(qū)的優(yōu)勢種。氣溫和耕作制度(包括輪作方式)是影響小麥赤霉病菌種群組成的重要因素。陳鴻逵等從浙江省采集到的500個赤霉病穗樣品中，發(fā)現(xiàn)478個病穗可鑒定到，占比93.9%，不過樣品包括大麥和小麥的病穗；Gale等從浙江省4個地區(qū)采集的病穗種共分離到225個菌株，鑒定結(jié)果全部為；Qu等從分離到的437個赤霉病菌菌株中，發(fā)現(xiàn)57個采自浙江省的菌株被鑒定為；Zhang等在分離到的469個菌株中，發(fā)現(xiàn)有30個采自浙江，其中26個被鑒定為，4個被鑒定為。本研究結(jié)果表明，是浙江省3個地區(qū)(杭州市蕭山區(qū)、桐廬縣以及寧波市象山縣)赤霉病菌的優(yōu)勢種。此結(jié)論與陳鴻逵等和Gale等的鑒定結(jié)論不一致，但與Qu等和Zhang等的鑒定結(jié)論一致。此觀點也與上述為中國南方地區(qū)優(yōu)勢種這一規(guī)律相符。

3.3 赤霉病菌菌株對多菌靈的抗性頻率

目前殺菌藥劑仍是生產(chǎn)實踐中防治小麥赤霉病的重要武器，其中多菌靈已被長期廣泛使用，這已導(dǎo)致田間多菌靈抗性菌株的產(chǎn)生。周明國等于1992年在浙江省海寧市采集的405個小麥病穗上分離到1個抗性菌株，抗性頻率約為0.25%；次年在該市采集的802個小麥病穗上分離到10個抗性菌株，抗性頻率約為1.25%。本研究測定了從浙江麥田分離到的386個赤霉病菌菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有72個抗性菌株，抗性頻率為18.65%。此抗性頻率低于近期江蘇樣品的檢測結(jié)果(26.3%～54.5%)，但明顯高于近期湖北樣品的檢測結(jié)果(3%)；與1993年浙江省海寧市樣品的抗性頻率(1.25%)相比，已增長近14倍。

3.4 赤霉病菌菌株對4種殺菌藥劑的敏感性

鑒于浙江省赤霉菌株對多菌靈的抗性頻率已近二成，在生產(chǎn)上應(yīng)減少多菌靈在小麥赤霉病防控中的應(yīng)用，應(yīng)選擇不含多菌靈的殺菌藥劑。為此本研究測試了目前市場主推的4種不含多菌靈的殺菌藥劑對浙江省赤霉病菌菌株的抑菌效果，結(jié)果表明，這4種藥劑的抑菌效果均良好。勞曉梅等和方志峰等應(yīng)用40%戊唑·咪鮮胺水乳劑分別在浙江省嘉興市和海寧市麥田，翁俊雄應(yīng)用30%唑醚·戊唑醇懸浮劑在浙江省紹興市麥田，均發(fā)現(xiàn)對防治小麥赤霉病有較好的抑菌效果，與本研究試驗得到的結(jié)論一致。

本研究還分析了殺菌藥劑兩兩混配對赤霉病菌菌株的抑菌效果，結(jié)果顯示，混配方案“75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑”+“30%唑醚·戊唑醇懸浮劑”的抑菌率最高。這兩種殺菌藥劑都含有戊唑醇，此外還分別含有肟菌酯和吡唑醚菌酯，肟菌酯和吡唑醚菌酯都是線粒體呼吸鏈抑制劑，推測這兩種殺菌藥劑可通過抑制細(xì)胞呼吸來抑制真菌生長。