單增李斯特氏菌能力驗證結(jié)果與分析

文 白雯靜 王艷煒 王海峰 . 蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院；.甘肅省隴神戎發(fā)醫(yī)藥股份有限公司

引言

單核細胞增生李斯特氏菌是普遍存在于自然環(huán)境中的革蘭氏陽性、嗜冷、兼性厭氧細菌。同時，也是一種食源性的人畜共患病的病原菌，歐美國家曾多次暴發(fā)由于食用了受單增李斯特氏菌污染的肉制品、奶制品、蔬菜及水果等而引發(fā)的嚴(yán)重的食物中毒事件。在《GB 29921-2021 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量》中，對乳制品、肉制品（包括熟肉制品和即食生肉制品）、水產(chǎn)制品、即食果蔬制品、冷凍飲品均有五份樣品中均不得檢出單增李斯特氏菌（n=5，c=0，m=0）的規(guī)定；同樣，在2022年3月7日實施的《GB 31607-2021 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 散裝即食食品中致病菌限量》中“部分或未經(jīng)熱處理散裝即食食品”：單核細胞增生李斯特氏菌限量為0/25g（mL）。由此類標(biāo)準(zhǔn)可見，國家對于食品中“單核細胞增生李斯特氏菌”的管理是十分嚴(yán)格的。

目前，國內(nèi)單核增生李斯特氏菌的檢驗方法主要有：分子生物學(xué)檢測技術(shù)（結(jié)合等溫擴增技術(shù)、結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)）、免疫學(xué)檢測技術(shù)、生物傳感器檢測技術(shù)、光譜學(xué)檢測技術(shù)、其它檢測技術(shù)（除了基于核酸檢測、特有蛋白檢測之外，還可以與色譜、核磁等多項技術(shù)技術(shù)相結(jié)合對單增李斯特氏菌進行檢測）?！禛B 4789. 30-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌》與舊版標(biāo)準(zhǔn)相比較，主要增加了“第二法 單核細胞增生李斯特氏菌平板計數(shù)法”和“第三法 單核細胞增生李斯特氏菌MPN計數(shù)法”。目前，對單核細胞增生李斯特氏菌的檢驗方法是比較成熟的。而且，隨著檢驗檢測技術(shù)日新月異的發(fā)展，使得較短時間內(nèi)完成精準(zhǔn)檢測成為可能。

另外，對于實驗室而言，質(zhì)量控制具有十分重要的意義。質(zhì)量控制的工作包括很多方面。比如，實驗室內(nèi)部控制和實驗室間控制等等。實驗室內(nèi)部控制工作可通過多種工作方式來展開。比如，內(nèi)部質(zhì)量監(jiān)督以及通過購買質(zhì)控樣品開展相關(guān)檢驗檢測工作等等。但是，由于其實施的環(huán)境和主觀等多種因素受限，僅有內(nèi)部控制是遠遠達不到質(zhì)量控制的要求。這時候，實驗室可以通過多種方式來達到實驗室間控制的目的。比如，參加外部能力驗證就是一種十分常見且有效的形式。尤其針對微生物實驗室，此項工作十分重要。微生物實驗室可以通過參加能力驗證、盲樣測定以及比對試驗等等。一方面，可以較大程度針對新入職人員提高其檢驗檢測能力；另一方面，在一定程度上也反應(yīng)了該實驗室對“陽性樣品”的檢出能力。即保證“陽性”不漏檢、陰性不得出現(xiàn)“假陽性”的結(jié)果。一旦實驗室出現(xiàn)“假陽性”“假陰性”“與參考值范圍不符”等情況時，實驗室的負(fù)責(zé)人員應(yīng)該針對整個實驗室進行溯源。從人員、環(huán)境、設(shè)備、培養(yǎng)基和試劑等各個方面進行詳細地追溯和分析，從而糾正不利因素，確保檢驗結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。

我院于2020年5月底參加了由中國食品藥品檢定研究院組織的“NIFDCPT-248 食品中單增李斯特氏菌檢出能力驗證”試驗，按照后期返回的結(jié)果來看，檢驗結(jié)果為“滿意”，現(xiàn)將具體試驗情況匯報如下。

1.材料與方法

1.1 樣品

實驗室共收到2份單增李斯特氏菌樣品，樣品為白色球狀、真空包裝于西林瓶，樣品編號分別為FC02220011、FC02220030；2袋奶粉樣品，每袋重量為25g，編碼與菌球編碼對應(yīng)。

1.2 儀器與材料

AC2-6S1型ESCO生物安全柜（新加坡藝思高公司）；GR-85致微高壓滅菌器（廈門致微公司）；MJ-250-Ⅲ型霉菌培養(yǎng)箱（上海躍進）；HH.B11.600BY型恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進）；VITEK2 Compact 30型全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（法國梅里埃）；mini VIDAS（全自動熒光免疫分析儀）（法國梅里埃）。

李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基（批號：200309）、李氏增菌肉湯（批號：190401）、PALCAM培養(yǎng)基基礎(chǔ)（批號：180425）均購于北京陸橋股份有限公司，所使用培養(yǎng)基均按照《GB 4789.28-2013 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》以及內(nèi)部質(zhì)控的要求進行驗收與質(zhì)控，并符合相關(guān)要求。VIDAS單增李斯特試劑盒（法國梅里埃）；VITEK2革蘭氏陰性細菌鑒定卡（20卡）（法國梅里埃）。

李斯特氏菌Listeria monocytogenes［ATCC 19115］購買于美國菌種保藏中心，并定期采用國標(biāo)的方法進行菌種鑒定和確認(rèn)。

1.3 試驗方法

在生物安全柜內(nèi)分別開啟西林瓶，將225 mL LB1增菌液加入到無菌均質(zhì)袋中，并將西林瓶內(nèi)小球加入到LB1增菌液中，充分溶解。然后將與西林瓶相同編碼的奶粉樣品加入到上述LB1增菌液中，充分均質(zhì)混勻。依此方法，分別對2件樣品進行平行處理。上述稀釋液，于30℃培養(yǎng)24h后，移取0.1mL，轉(zhuǎn)種于10mL LB2增菌液中，于30℃培養(yǎng)24h。取LB2二次增菌液劃線接種于PALCAM瓊脂平板和李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上，于36℃培養(yǎng)48h后,觀察各個平板上生長的菌落；如有可疑菌落（典型菌落在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷），自選擇性瓊脂平板上分別挑取3-5個典型或可疑菌落，進行初篩試驗和鑒定試驗。取LB1增菌液按照miniVIDAS（全自動熒光免疫分析儀）儀器操作規(guī)程和試劑盒說明書進行相關(guān)試驗。

2.結(jié)果與分析

2.1 mini VIDAS（全自動熒光免疫分析儀）快篩結(jié)果

按照VIDAS儀器要求：質(zhì)控1（control 1）的示值須在0.71-1.07的范圍內(nèi)，質(zhì)控2（Control 2）的示值須≤0.04；標(biāo)準(zhǔn)（standard）的示值須在2201-4801的范圍內(nèi)，方可進行后續(xù)樣品試驗，根據(jù)表1的試驗數(shù)值，滿足儀器要求，故可進行下部分樣品的試驗。

表1 VIDAS質(zhì)控結(jié)果

取LB1增菌液按照mini VIDAS儀器操作規(guī)程和試劑盒說明書進行相關(guān)試驗。結(jié)果如表2所示，根據(jù)表2結(jié)果，初步可判斷樣品FC02220030為陽性（檢出單核增生李斯特氏菌），樣品FC02220011為陰性（未檢出單核增生李斯特氏菌）。

表2 VIDAS試驗結(jié)果

2.2 PALCAM培養(yǎng)基和李斯特顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果

根據(jù)PALCAM培養(yǎng)結(jié)果和李斯特顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果來看，進一步確定樣品FC02220030為陽性，樣品FC02220011為陰性，結(jié)果如表3所示。

表3 PALCAM培養(yǎng)基和李斯特顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果

2.3 初篩/鑒定試驗結(jié)果

參照《GB 4789. 30-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌》，對樣品FC02220030進行初篩（接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管）和鑒定試驗（包括染色鏡檢、動力試驗、過氧化氫酶試驗等生化鑒定項目），確定FC02220030為陽性，具體結(jié)果如表4所示。

表4 FC02220030初篩/鑒定試驗結(jié)果

單增李斯特氏菌（ATCC 19115）為陽性對照，其初篩和鑒定試驗結(jié)果如表5所示。

表5 ATCC 19115（陽性對照）初篩/鑒定試驗結(jié)果

2.4 VITEK2（全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)）鑒定結(jié)果

表6為FC02220030 VITEK2鑒定結(jié)果：（99%概率），其置信度為極好的鑒定。

表6 FC02220030 VITEK2鑒定結(jié)果

3.討論

通過對不同檢驗方法的分析，mini VIDAS在第一步增菌培養(yǎng)（即LB 1增菌液培養(yǎng)24h）后，便可進行試驗，與常規(guī)檢驗方法結(jié)果一致，而且所需檢驗周期短，可在較短時間內(nèi)得到結(jié)果。因此，該方法可用于大批量檢品致病菌的快速篩查。另外，在李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基的制備過程中，應(yīng)注意要將添加劑進行充分混勻，混勻后在加入培養(yǎng)基（培養(yǎng)基在高壓滅菌121℃、15min后冷卻至50℃?zhèn)溆茫r，應(yīng)注意邊混勻邊加入，以保證添加劑均勻地混合在培養(yǎng)基中，從而確保顯色培養(yǎng)基質(zhì)量的穩(wěn)定性。另外，在配制操作時應(yīng)注意無菌操作，否則容易導(dǎo)致沒有白色暈圈或白色暈圈不明顯，從而影響判定結(jié)果，造成假陰性的出現(xiàn)。另外，為確保試驗結(jié)果，在配置顯色培養(yǎng)基時，可以選擇多個品牌的培養(yǎng)基進行對照和綜合判斷。最后，在試驗的同時應(yīng)注重陽性對照與陰性對照的使用，從而確保結(jié)果的可靠性與可追溯性。

在日常檢驗檢測工作中，實驗室應(yīng)該制定詳細的年度質(zhì)量控制計劃，通過能力驗證、人員比對、質(zhì)控樣測定等多種方式，確保整個實驗室正常、穩(wěn)定地運行。另外，在涉及微生物致病菌的檢驗時，應(yīng)采用多種儀器設(shè)備對結(jié)果進行比對和印證，進而確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確和可靠性。