貽貝活性肽類研究與展望

蔣鑫怡,楊大鵬,韋源青,王欣之,林彬燕,劉睿,2,吳皓,2

(1.南京中醫(yī)藥大學/江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點實驗室,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學/江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心,江蘇 南京 210023)

2021年3月11日,十三屆全國人大四次會議審議通過了《國民經濟和社會發(fā)展第十四個五年規(guī)劃和2035年遠景目標綱要》,其中用“積極拓展海洋經濟發(fā)展空間”專章部署了海洋經濟工作,明確了“十四五”時期海洋經濟工作的方向和重點任務?！笆奈濉逼陂g,海洋生物醫(yī)藥產業(yè)發(fā)展需重點圍繞建設現(xiàn)代海洋產業(yè)體系、突破關鍵核心技術、培育壯大海洋生物醫(yī)藥產業(yè)、提升海洋漁業(yè)發(fā)展方式、深化海洋經濟示范等方向[1]。

“海洋中藥”指在中醫(yī)藥理論指導下,用于預防、治療、診斷疾病的來源于海洋的藥物[2]。海洋中藥的開發(fā)利用符合海洋生物醫(yī)藥產業(yè)發(fā)展要求,作者所在課題組最早提出在中醫(yī)藥理論指導下開發(fā)海洋中藥的研究思路,近20年圍繞江蘇特色海洋生物資源的開發(fā)利用,創(chuàng)制形成了標志性成果,研發(fā)形成復方海藻消癭顆粒、丹鹿膠囊、伸筋接骨膠囊、鯊魚軟骨膠囊、康貝膠囊等海洋中藥新藥及健康產品[3]。我國的貝類資源種類多、儲量大,功效特點突出,營養(yǎng)價值高,在沿海各海域均有分布。2020年版《中國藥典》收錄海洋中藥11種,其中源于貝類的海洋中藥占6種(牡蠣、石決明、瓦楞子、蛤殼、珍珠母、珍珠)。

貽貝(Mussel)又名淡菜、海紅、青口、殼菜等,屬軟體動物門(Mollusca),雙殼綱(Bivalvia),貽貝目(Mytiloida),貽貝科(Mytilidae),是用足絲附著生活的雙殼軟體動物,廣泛分布在山東、浙江、福建、廣東、江蘇、遼寧、廣西等省份,是一類重要的經濟貝類,也是一味中藥。貽貝有“東海夫人”的美稱[4],《本草拾遺》記載:“東海夫人生南海,似珠母,一頭尖,中銜少毛?！盵5]《本草綱目》記載:“淡以味,殼似形,夫人以似名也?！盵6]《嘉祐本草》記載貽貝“治虛勞傷憊,精血少者,及吐血,婦人帶下、漏下,丈夫久痢,并煮食之。”[7]

貽貝是我國沿海經濟貝類重要的養(yǎng)殖品種,主要包括紫貽貝(MytilusedulisLinnaeus)、厚殼貽貝(MytiluscoruscusGould)、翡翠貽貝(PernaviridisLinnaeus)等[8],其中以紫貽貝產量最大。紫貽貝盛產于黃海、渤海,人工養(yǎng)殖南移后東海和南海海域也可作為紫貽貝的適宜養(yǎng)殖區(qū)域;翡翠貽貝主要分布在我國的南海、東海南部、臺灣海峽及東南亞等地;厚殼貽貝主要分布于黃海、渤海和東海沿岸,其產業(yè)中心位于浙江舟山嵊泗地區(qū)[9],嵊泗亦被稱為“貽貝之鄉(xiāng)”。近10年我國貽貝養(yǎng)殖量如圖1所示。

1 貽貝本草記載及傳統(tǒng)功效

貽貝性溫,味甘、咸,歸肝、腎經,具補肝益腎,滋陰息風,養(yǎng)血調經,益精填髓,軟堅散結,止血止瀉之功效[10]?！侗静菔斑z》《嘉祐本草》《日華子本草》《本草綱目》等本草書籍均有記載,如表1所示[11-18]。

表1 貽貝的傳統(tǒng)功效

貽貝除單用外,亦可入方制成湯劑、丸劑、散劑等,用于治療腎陽虛弱、肝腎不足、眩暈盜汗、精氣不固等病證均有一定療效。如,淡菜30 g,狗腎1具,煎煮至熟爛,飲汁食肉,連服1周,用于治療腰肌勞損、腎虛腰痛及陽痿等疾病;用淡菜50 g,熟地10 g,黃芪50 g,當歸10 g,水煎服,每日1劑,日服2次,可治貧血和氣血雙虛;淡菜(干)150 g,陳皮100 g,分別研細末和勻,加蜂蜜和為丸,每日3次,每次服6 g,治老人頭暈和睡中盜汗;淡菜30 g,昆布15 g,煎煮熟爛,連藥帶汁1次服,日服2次,連服2周,治療地方性甲狀腺腫。

除經典的治療方外,貽貝食療方效果亦佳。如,淡菜50 g,冬瓜250 g,同煎湯服用,治療濕熱型腎結石;淡菜30～60 g,豬肉15～30 g,共同煎煮,酌加作料,治療血熱性月經過多;淡菜用黃酒洗過,并同韭菜煮食,可治療腎虛腰痛、頭暈耳鳴等;每天用淡菜60 g,何首烏片6 g,水煮后趁熱飲汁,連服1～2月,可治須發(fā)早白；貽貝250 g,水鴨1只,加入冰糖適量,共燉,食肉飲湯,每日1次,連用1～2周后對肺結核有良好療效;將淡菜用黃酒洗過,并同韭菜煮食,可治療腎虛腰痛、頭暈耳鳴等。

2 貽貝活性肽類物質研究

2.1 貽貝活性肽現(xiàn)代藥理作用

貽貝富含蛋白質、肽類成分,對近年來發(fā)現(xiàn)的貽貝活性肽的序列、藥理活性、效應機制進行總結梳理,發(fā)現(xiàn)貽貝活性肽現(xiàn)代藥理作用主要包括抗菌、抗氧化、促成骨、抗凝、降壓(ACE抑制)、抗炎、抗腫瘤等。如Xu等[19]提取分離貽貝蛋白質,對其進行體外模擬消化,并將不同處理的水解產物孵育小鼠前成骨細胞MC3T3-E1,發(fā)現(xiàn)這些水解蛋白具有高度的促成骨活性;貽貝中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽是一種免疫肽,富含半胱氨酸,可以分為貽貝防御素(MGD)、貽貝素(Mytilin)、貽貝肽(Myticin)和貽貝霉素(Mytimycin)4類,具有不同的抗菌活性[20]；從貽貝分離獲得的活性肽具有誘導前列腺、乳腺癌和肺癌細胞的細胞死亡的作用[21]。見表2[22-47]。

表2 貽貝中的活性肽類成分

中醫(yī)認為腎主骨,肝主筋,調補肝腎可強筋健骨,補益精血可充盈骨質,貽貝補肝益腎、益精填髓之功效與其活性肽促成骨作用相關;而貽貝肽抗腫瘤、抗炎活性可與其“軟堅散結”之功效存在關聯(lián)。貽貝為重要的海洋中藥,其中蛋白質、肽類成分的基礎與應用研究近年來廣受關注,將貽貝傳統(tǒng)功效與現(xiàn)代藥理活性的關聯(lián)比較,有助于針對性的篩選貽貝活性肽類分子或肽類先導化合物,促進貽貝資源的開發(fā)利用及健康產品的創(chuàng)制。

2.2 貽貝肽類成分的提取與制備

活性肽分為兩類,一類屬于天然存在,可以從自然界的生物體中直接提取,另一類是需要通過蛋白質降解途徑得到或利用合成方法進行制備。根據(jù)提取目標的活性肽類型，可選擇一種或多種合適的制備工藝。常見的活性肽制備方法有化學水解法、直接提取法、酶解法、基因重組合成法、微生物發(fā)酵法以及已知氨基酸序列的化學合成法等。貝類軟體中含有的蛋白質以細胞骨架蛋白為主,如微管蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白、肌球蛋白及組蛋白等,此外還有核糖體蛋白、精氨酸激酶、ATP合成酶、延伸因子、熱休克蛋白等[48]。蛋白質類成分在煎煮、消化液處理后,易于釋放肽類成分,通常這些肽類成分才是發(fā)揮生物效應的關鍵物質。

2.2.1 酶解法 通過生物酶的水解作用可將海洋貝類蛋白序列中的肽釋放出來,從而得到多種具有生物功能或生理效應的活性肽,又因為酶解法作用條件溫和、安全穩(wěn)定,同時對一些肽鍵的水解有高度選擇性,目前已經成為提取制備活性肽的一種主流方法。該方法中常用的水解酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶等[49]。Yunok等[50]研究發(fā)現(xiàn)紫貽貝-α-糜蛋白酶水解產物(BMCH)在DPPH自由基清除、ABTS+自由基清除方面表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性。優(yōu)化酶的水解條件(種類、溫度、pH、加酶量、底物濃度、水解時間等)十分重要[51]，優(yōu)化這些條件可以提高活性肽的產率及活性。于瑩等[52]研究了5種蛋白酶對紫貽貝免疫活性肽進行制備,篩選出胰蛋白酶為最佳酶,采用響應面法(RSM)優(yōu)化酶解條件后(酶解溫度43.7 ℃,pH 8.9,時間3.2 h,加酶量3 000 U·g-1),所制備的活性肽能夠顯著促進RAW264.7細胞增殖,具有良好的免疫調節(jié)活性。

2.2.2 化學合成法 對于已知目標肽段中氨基酸序列的活性肽的制備通常采用化學合成法,即通過氨基酸在液相或固相體系中在縮合劑的作用下組合形成目標生物活性肽。有機合成通常選擇固相合成法,固相合成法是一個從C端向N端重復添加氨基酸的過程,利用一系列化學溶劑和合成路線可得到包含10～100個殘基的多肽序列[53]。因此,對于從貽貝中發(fā)現(xiàn)的活性肽,可以通過化學合成法來合成目標多肽,然后通過質譜鑒定粗品,檢測是否與理論分子量相符,最后進一步驗證合成多肽的生物活性。有機合成的優(yōu)勢在于能夠實現(xiàn)目標肽的大批量生產,除此以外,如果通過化學合成法著眼研究非自然存在的氨基酸及其殘基的定點突變與肽段活性位點轉移,那么將助于加快構造出高活性貽貝活性肽。

2.3 貽貝活性肽的分離與純化

為了更好地研究生物活性肽的生理功能,實現(xiàn)多肽的分離純化對獲得較純的活性肽顯得至關重要。海洋生物活性肽的分離純化通常是由其蛋白分子量及極性決定的,主要的分離方法包括膜分離、色譜分離、毛細管分離等。課題組前期通過柱層析、超濾分離、C18制備液相等方法從蛤蜊軟體中提取、制備具有抗氧化、ACE抑制及DPP-4抑制活性肽[54-56]。

2.3.1 膜分離技術 超濾膜法可以按照膜的截留相對分子質量(MWCO)對物料進行分離,再根據(jù)要得到的目標蛋白或多肽確定最佳的純化工藝[57]。采用超濾可以實現(xiàn)ACE抑制肽的分離和濃縮,有效提高肽的ACE抑制活性,張艷萍等[58]采用超濾法對紫貽貝酶解物中的降血壓肽進行分離,結果表明,截留分子量為10 ku的超濾膜能將紫貽貝酶解物的ACE抑制率提高到89.42%。

2.3.2 色譜分離技術 色譜技術是分離海洋生物活性肽最常用的技術之一,基于樣品與流動相和固定相之間的相互作用,能有效分離和純化多種所需特定海洋生物活性肽段。常用的HPLC多肽分離技術有凝膠過濾色譜、反相高效液相色譜(RP-HPLC)[59]、離子交換色譜[60]以及多種色譜技術結合。孫敬敬等[61]以厚殼貽貝為原料制備抗菌肽,首先利用半制備型反相高效液相色譜分離,然后以分析型反相高效液相色譜進行純化,結果表明,乙腈濃度為25%的洗脫成分具有較強的抗菌活性。

2.4 貽貝活性肽篩選的新方法

活性肽類的尋找發(fā)現(xiàn)通常基于活性導向的分離純化這一經典思路,然而存在耗時費力、純化制備量少等缺點[62]。近年來,基于生物化學、分子生物學、生物信息學等技術手段應用于貝類活性肽研究,取得了較好效果。課題組采用串聯(lián)質譜與分子對接技術,從蛤蜊軟體酶解液中快速篩選具有抑制ACE、DPP-4活性的肽類成分[63,55-56]。

2.4.1 計算機輔助篩選貽貝活性肽 生物信息學技術的快速發(fā)展,使得計算機輔助篩選藥物和設計結構日趨成熟,越來越多的研究者也將此項技術應用于反向篩選活性肽的領域。對于作用未知活性肽的篩選,通常運用相關模擬軟件構建該肽段的三維結構,然后運用分子對接技術將肽段的三維結構與目標靶點蛋白的三維結構進行對接,選取對接分值較高的幾個肽段進行后續(xù)的驗證[64]。Qiao等[25]對從貽貝中提取的抗凝肽與凝血酶進行分子對接,使用Discovery Studio軟件分析來自內收肌的3種肽VQQELEDAEERADSAEGSLQK、RMEADIAAMQSDLDDALNGQR和AAFLLGVNSNDLLK的活性機制,并根據(jù)得分和結合能值獲得肽在凝血酶活性位點的最佳對接狀態(tài)。

2.4.2 基于轉錄組學技術篩選貽貝活性肽 隨著轉錄組測序水平的不斷提高,使用轉錄組測序技術進行藥物篩選可以同時靈敏地檢測出上調和下調的基因,全面地檢測出多靶點、多成分藥物的藥效作用,客觀地評價多成分藥物的增效或減效作用,并且預測藥物的未知活性或潛在毒副作用,可以應用于活性成分的篩選。Rey-Campos等[65]研究了Myticin C處理后血細胞的轉錄組反應,以了解這種細胞因子樣分子誘導的分子變化。轉錄組分析揭示了與細胞運動相關的基因的調節(jié),例如與組織再生相關的基因和參與保護細胞外基質完整性的細胞外基質蛋白HSPG2的上調,這與功能測定的結果一致,證明了Myticin C在體外激活血細胞和遷移中的意義,顯示出良好的傷口愈合活性。轉錄組測序技術在活性成分篩選中的成功應用,使細胞系-轉錄組測序結合篩選方法有望應用在全面評估復雜結構活性肽的藥效信息,以及作用機制方面的研究中,從而提高篩選效率和成功率[64]。

2.4.3 基于生物信息學研究貽貝活性肽 近年來,隨著信息技術研究的興起,涌現(xiàn)出BIOPEP、PeptideRanker活性肽數(shù)據(jù)庫、ExPASy、UniProtKB等蛋白數(shù)據(jù)庫[66]?；跀?shù)據(jù)庫中的大量信息,一方面可以應用人工智能預測蛋白/肽的結構,同時使用計算機輔助預測靶向活性肽;另一方面,使用化學方法從藥用動物中提取活性蛋白/肽,基于組學技術的高通量篩選出目標活性肽,與前面計算機輔助預測對比驗證后,接著進行目標肽段藥理活性及作用機制的研究,最終在大數(shù)據(jù)信息的支撐輔助下,進一步實現(xiàn)肽類新藥的研發(fā)[64]。陳艷楠等[67]對紫貽貝蛋白進行模擬消化獲得寡肽(二肽至五肽),通過PeptideRanker活性評分以及理化性質分析,從這些寡肽中篩選出9條具有潛在研究價值的多肽。通過ADMET分析和BIOPEP-UWM生物活性預測,發(fā)現(xiàn)其中7條寡肽具有ACE抑制活性,7條寡肽具有DPP-Ⅳ抑制活性。通過SwissDock和iDPPIV-SCM進一步篩選,確定QYGGR和HMR分別具有最優(yōu)的ACE和DPP-Ⅳ抑制活性。人工智能預測、高通量篩選和多組學數(shù)據(jù)庫信息的結合,使得活性蛋白及多肽的篩選正在向多評價指標、高通量的方向上快速發(fā)展,有助于建立不同中藥肽和不同作用靶點之間的聯(lián)系。

3 貽貝資源化利用研究與產業(yè)化展望

3.1 貽貝資源調查與品質評價研究

通過實地調研和數(shù)據(jù)采集,摸清我國貽貝資源品種種類、數(shù)量與區(qū)域分布特點、蘊藏量和產量;采用品種鑒別、外觀性狀、元素測定、主要功效物質測定等技術和方法,系統(tǒng)評價我國不同海域貽貝資源品質;比較不同采收季節(jié)貽貝資源,全面測定其功效物質含量、有害元素限度等指標,比較評價不同采收期貽貝資源質量,構建貽貝質量評價方法體系,形成貽貝原料質量標準,從而為貽貝資源產地、采收期的合理選擇提供依據(jù),亦為后續(xù)貽貝資源開發(fā)提供符合質量要求的原料。

3.2 基于傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論指導開發(fā)貽貝資源

來源于海洋動植物的傳統(tǒng)中藥有多種,如海洋藥用植物有昆布、海帶、羊棲菜、海蒿子、紫菜等,海洋藥用動物有蛤類、蟶類、海蜇、海螵蛸、瓦楞子、牡蠣、河鲀等,這些海洋藥用生物資源在傳統(tǒng)中醫(yī)藥本草文獻中均有記載。如《本草綱目》即記載貽貝可用于“虛勞傷憊,精血衰少,吐血久痢,腸鳴腰痛。”基于中醫(yī)藥典籍記載及數(shù)據(jù)挖掘等技術,從數(shù)據(jù)庫中有目的尋找與貽貝相關文獻,在中醫(yī)藥理論的指導下,輔以現(xiàn)代醫(yī)藥技術,包括功效物質基礎研究、高效提取分離技術、安全性與生物效應評價研究、質量控制等,從中提取分離功效成分,按照健康產品開發(fā)要求,形成貽貝健康產品,促進貽貝資源有針對性的、高效率的開發(fā)利用。

3.3 基于資源循環(huán)利用理念開發(fā)貽貝資源

資源循環(huán)利用是通過改變資源利用方式,提升資源利用效率,開發(fā)藥用生物資源的多宜性與新用途,提升資源附加值的同時減少資源投入與消耗,逐步實現(xiàn)有限資源的多元化、精細化利用,促進資源節(jié)約型與環(huán)境友好型循環(huán)經濟發(fā)展目標的實現(xiàn)。以課題組前期開展江蘇沿海低值貝類的綜合開發(fā)利用研究為例,將四角蛤蜊、雜色蛤、文蛤等蛤類進行全值化綜合開發(fā)利用,通過現(xiàn)代提取分離、精制純化等工業(yè)技術對蛤蜊軟體、外殼及加工過程廢棄物綜合利用,開發(fā)形成包括飼料添加劑、食品、保健食品、生物功能材料等系列產品,形成了較成熟的貝類資源綜合開發(fā)利用范式[3,68]。因此,貽貝資源的綜合利用可基于資源循環(huán)利用理念開展,在中醫(yī)藥理論指導下,將貝類軟體開發(fā)成大健康中間體或產品,貝類外殼富含的鈣質可用于食品原料或生物材料等,加工過程中的廢棄資源或邊下角料可開發(fā)成具有誘食性的飼料添加劑。如此形成貽貝資源全值化綜合開發(fā)模式,形成環(huán)境友好型的貽貝資源可持續(xù)利用和海洋經濟綠色發(fā)展。

3.4 突破貽貝資源綜合利用的關鍵技術

海洋貝類資源的生產加工過程中面臨一些共性問題,如產地加工殼肉分離、提取濃縮后鹽分的脫除、重金屬有害元素的脫除等。課題組前期針對蛤蜊資源綜合開發(fā)利用形成了關鍵技術,研發(fā)了貝類自動分級及自動殼肉分離技術機械化設備,極大提升了蛤蜊產地加工的效率與工業(yè)化、規(guī)?；瘧门c發(fā)展的進程,貝類自動分級裝置按照蛤蜊大小進行自動分級處理,日處理量可達30噸;基于電滲析技術實現(xiàn)脫鹽、脫重金屬及有害元素,在保留80%以上功效物質的同時,脫除90%以上的鹽分、重金屬及有害元素;合成水氯鐵鎂石可用于脫除貝類中間體的有機砷As(Ⅲ)、As(Ⅴ)[69]。目前貽貝產地加工已實現(xiàn)機械化殼肉分離[70],而鹽分與重金屬脫除是貽貝資源開發(fā)利用過程中必須解決的問題,針對貽貝功效物質類型,開發(fā)適宜的脫鹽方法,形成符合產業(yè)化規(guī)模要求脫鹽關鍵技術,確保貽貝原料、中間體或產品符合行業(yè)標準。

3.5 產學研用合作促進貽貝資源綜合利用產業(yè)化

高校、科研院所對貽貝資源綜合利用開展基礎研究,企業(yè)發(fā)展方向與市場需求的導向下,有針對性地開發(fā)貽貝產品,產學研用緊密結合,研發(fā)形成符合市場定位與消費者需求的貽貝產品,促進貽貝綜合利用基礎研究向產業(yè)化發(fā)展,提升經濟效益。在研發(fā)形成的貽貝產品的導向下,進一步促進貽貝養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,并建立貽貝產地加工基地及中下游產品生產基地,貫通貽貝“養(yǎng)殖-產地加工-產品研發(fā)-產品產業(yè)化”的生產鏈,推進貽貝資源綜合利用的技術升級與產業(yè)化發(fā)展。

4 結語

我國貝類資源豐富,歷代本草均有關于貝類資源傳統(tǒng)功效與藥用價值的記載。課題組多年來基于中醫(yī)藥理論指導開展貝類資源綜合開發(fā)利用,形成了較為成熟的貝類資源綜合開發(fā)利用范式。我國貽貝資源儲量大、營養(yǎng)價值高、功效確切,有逾千年的應用歷史,其中所含的豐富的蛋白質、肽類成分為重要功效物質。本文以貽貝多肽類功效物質為切入點,從貽貝本草記載、肽類成分的分離純化、效應機制、新技術新方法應用等方面進行系統(tǒng)的回顧與梳理,并從資源品質評價、開發(fā)思路、關鍵技術突破、產學研合作等方面為貽貝資源的開發(fā)利用提出了思考與展望。通過本文的梳理總結,以期為貽貝資源綜合利用與產品開發(fā)提供思路與參考,促進貽貝資源的高質量、綠色、可持續(xù)發(fā)展。