動(dòng)物藥現(xiàn)代研究方法學(xué)進(jìn)展與展望

劉睿,武文星,朱悅,郭盛,趙明,曹鵬,段金廒

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心/國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點(diǎn)研究室,江蘇 南京 210023;2.動(dòng)物類中藥與功能肽國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

1 動(dòng)物藥現(xiàn)代研究背景

動(dòng)物藥是指源于動(dòng)物全體、器官、組織、生理或病理產(chǎn)物、提取物或加工品的中藥材,自古被稱為“血肉有情之品”,多有“行走通竄之功”,是傳統(tǒng)中藥重要組成部分。動(dòng)物藥在歷代本草均有記載,如《五十二病方》記載動(dòng)物藥57種,《神農(nóng)本草經(jīng)》記載動(dòng)物藥67種,唐代《新修本草》收載動(dòng)物藥128種,《本草綱目》記載動(dòng)物藥462種[1],動(dòng)物藥資源分布廣、活性強(qiáng)、療效高等特點(diǎn),在臨床上具有不可替代的作用與地位。

1.1 動(dòng)物藥的特點(diǎn)與重要性

動(dòng)物藥資源廣泛,除了陸地動(dòng)物外,海洋動(dòng)物資源儲(chǔ)量巨大,占地球生物總量80%[2],加之海洋生物生長(zhǎng)環(huán)境與陸地不同,因此其體內(nèi)所含物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)特殊,是藥物的重要來(lái)源,如傳統(tǒng)中藥海龍、海馬、牡蠣、昆布等,均來(lái)源于海洋生物。動(dòng)物藥化學(xué)物質(zhì)種類豐富,含有蛋白質(zhì)類、肽類、糖類、脂質(zhì)類、酶類等主要功效物質(zhì),藥用動(dòng)物所含有的毒素類物質(zhì),如蛇毒、蝎毒、蜂毒等,表現(xiàn)出極強(qiáng)的鎮(zhèn)痛、舒張血管等活性,是重要的先導(dǎo)化合物來(lái)源[3]。中醫(yī)認(rèn)為,動(dòng)物臟器氣味醇厚,為血肉有情之品,在調(diào)養(yǎng)、補(bǔ)益等方面效果明顯,如鹿茸具壯腎陽(yáng),補(bǔ)精髓,強(qiáng)筋骨等功效[4];犀角、羚羊角對(duì)高熱、驚厥作用顯著[5-6];熊膽清熱、平肝、利膽、明目等[7]。

1.2 動(dòng)物藥研究薄弱環(huán)節(jié)

動(dòng)物藥在中醫(yī)臨床、方劑組成、中藥制藥行業(yè)中不可或缺,可替代品種很少,療效獨(dú)特,地位非常重要。動(dòng)物藥成分復(fù)雜,多數(shù)動(dòng)物藥的功效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確,動(dòng)物藥生物效應(yīng)機(jī)制、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制等水平仍較低。目前動(dòng)物藥研究主要存在的問題包括:①動(dòng)物藥資源保護(hù)與資源可持續(xù)利用的矛盾亟待解決,如羚羊角、穿山甲、熊膽等資源保護(hù)與中醫(yī)臨床必要性之間的矛盾;②動(dòng)物藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究亟待開展;③客觀反映動(dòng)物藥傳統(tǒng)功效的現(xiàn)代生物效應(yīng)評(píng)價(jià)與效應(yīng)機(jī)制研究亟待開展;④動(dòng)物藥成分復(fù)雜,其體內(nèi)過程仍不明確,動(dòng)物藥體內(nèi)過程及PK/PD研究亟待開展;⑤動(dòng)物藥生產(chǎn)加工溯源及過程精準(zhǔn)質(zhì)控方法與評(píng)價(jià)體系亟待建立。

2 動(dòng)物藥現(xiàn)代研究方法學(xué)

盡管我國(guó)動(dòng)物藥研究起步晚,研究基礎(chǔ)薄弱,但是近20年來(lái),隨著藥物化學(xué)、分析化學(xué)、生物學(xué)、藥理學(xué)、材料學(xué)、生態(tài)學(xué)等多學(xué)科的發(fā)展,技術(shù)手段與儀器設(shè)備的不斷提升,醫(yī)藥工作者圍繞動(dòng)物藥領(lǐng)域科學(xué)問題開展學(xué)科交叉、協(xié)同攻關(guān),建立了一系列動(dòng)物藥現(xiàn)代研究方法學(xué),并突破了一些關(guān)鍵技術(shù),我國(guó)動(dòng)物藥研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)步。本文梳理了近年來(lái)在中藥學(xué)、藥物化學(xué)、生命科學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、材料學(xué)等研究領(lǐng)域形成的技術(shù)手段,已經(jīng)或即將應(yīng)用于動(dòng)物藥基礎(chǔ)研究的方法體系,為后續(xù)動(dòng)物藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究,及動(dòng)物藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供借鑒(圖1)。

2.1 動(dòng)物藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究

動(dòng)物藥的物質(zhì)組成以蛋白質(zhì)類、肽類、氨基酸類、糖類等初生代謝產(chǎn)物為主,此外還含有脂肪酸類、核苷類、宏微量元素等。動(dòng)物藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究方法不同于植物類中藥的次生代謝產(chǎn)物研究方法,需采用適用于動(dòng)物藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究的方法手段。

2.1.1 動(dòng)物藥大分子類成分的分離、純化與鑒定 植物類中藥次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,穩(wěn)定性好,容易分離純化;而動(dòng)物藥初生代謝產(chǎn)物的分離、純化、鑒定采用的方法需適合于如蛋白質(zhì)、多糖、多肽、氨基酸等的分離純化?；诘鞍踪|(zhì)類、肽類、多糖類等生物大分子物質(zhì)的理化性質(zhì),通常采用多維色譜聯(lián)用的手段,基于活性導(dǎo)向進(jìn)行分離純化,課題組前期研究采用凝膠柱層析(Sephadex G-25)、離子交換層析(DEAE Sepharose)與反相柱層析(C18)聯(lián)用的方法,從水牛角提取物中分離純化獲得3個(gè)活性肽類成分[8];Cao等[9]采用凝膠柱層析(Sephadex G-50)、陽(yáng)離子交換層析(CM Sepharose)及反相柱層析(C18)聯(lián)用,從東亞鉗蝎中分離、純化獲得活性多肽Martentoxin I、BmK AngM1等。Wang等[10]采用離子交換層析(DEAE Cellulose)方法從蛤蜊提取物中分離純化制備3個(gè)均質(zhì)多糖,其中1個(gè)均質(zhì)多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)為[→4Glc1→4Glc1→4Glc1→2Glc1→4Glc1→4Glc1→4Glc1]n?；诨钚詫?dǎo)向分離的多維色譜聯(lián)用技術(shù)是動(dòng)物藥功效物質(zhì)分離、純化的經(jīng)典方法,也是動(dòng)物藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究的主要方法之一,但存在耗時(shí)費(fèi)力、純化制備量少等缺點(diǎn)。

經(jīng)典分離純化方法適用于動(dòng)物藥中高豐度功效物質(zhì)研究,但不適用于低豐度成分的分析鑒定。對(duì)于動(dòng)物藥中低豐度、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)肽類成分分析,可采用制備特異性材料,對(duì)目標(biāo)成分進(jìn)行親和富集的策略[11-12]?；诖?課題組通過制備核殼型磁性納米材料,在最外層包裹金(Au)納米層,通過形成穩(wěn)定的硫金鍵(Au-S)對(duì)含巰基(-SH)或二硫鍵(-S-S-)的蛋白質(zhì)、肽類成分進(jìn)行富集,最終通過nanoLC-MS/MS對(duì)富集的目標(biāo)物質(zhì)分析鑒定。課題組制備的Fe3O4@PDA@Au納米材料,富集了水牛角提取液中含-SH肽類成分,且富集的含-SH肽類成分相較于水牛角提取液,抗炎、抗氧化活性顯著提升[13]。課題組進(jìn)一步制備了Fe3O4@PEI@Au納米材料,對(duì)眼鏡蛇蛇毒中含-S-S-的毒素類成分進(jìn)行富集分析,共鑒定了96個(gè)蛇毒蛋白,與傳統(tǒng)蛇毒蛋白分析鑒定方法相比,該方法顯著提升了含-S-S-蛇毒的鑒定通量,大大縮短分析時(shí)間[14]。Lu等[15]采用多克隆抗體親和層析方法,將蝎毒肽Makatoxin-3(MkTx-3)的多克隆抗體耦合至Sepharose 4B層析柱上,根據(jù)MkTx-3抗體的專屬性,富集純化MkTx-3毒素,并測(cè)定其氨基酸序列。

2.1.2 多組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究

2.1.2.1 轉(zhuǎn)錄組(Transcriptomics) 轉(zhuǎn)錄組通常指特定生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,包括蛋白質(zhì)編碼RNA到非編碼RNA的所有RNA分子的集合。近年來(lái),轉(zhuǎn)錄組技術(shù)手段被應(yīng)用于動(dòng)物藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究,方法主要包括:將活體藥用動(dòng)物、動(dòng)物器官或分泌物采用適當(dāng)方法提取mRNA后,以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,通過PCR擴(kuò)增制備cDNA文庫(kù)并進(jìn)行RNA-seq測(cè)序,組裝、翻譯獲得蛋白質(zhì)或肽類功效物質(zhì)的序列信息,表達(dá)或固相合成制備功效物質(zhì),進(jìn)一步驗(yàn)證生物活性[16]。研究人員采用轉(zhuǎn)錄組方法,從芋螺毒腺中發(fā)現(xiàn)不同家族的芋螺毒素,甚至發(fā)現(xiàn)新型胰島素類似物[17];從不同蛙皮分泌物中發(fā)現(xiàn)一系列抗菌肽[18-19];從蝎毒腺中發(fā)現(xiàn)大量Na+通道、K+通道毒素,酶,宿主防御肽等毒素類成分[20]。

2.1.2.2 蛋白質(zhì)組(Proteomics)與多肽組(Peptidomics) 近年來(lái),越來(lái)越多科研工作者將蛋白質(zhì)組、多肽組技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究,目前蛋白質(zhì)肽類成分分析主要采用的是自下而上(Bottom-up)質(zhì)譜鑒定方法,通過特異性蛋白酶(以胰蛋白酶為主)酶切,以高分辨質(zhì)譜分析獲得MS/MS圖譜,將二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)匹配,鑒定蛋白質(zhì)類、肽類成分[21]。Zhang等[22]采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較分析不同發(fā)育時(shí)期的鹿茸尖部蛋白質(zhì)組成,明確鹿茸物質(zhì)基礎(chǔ)的同時(shí),也為鹿茸快速生長(zhǎng)和骨化的分子調(diào)控機(jī)制的研究提供了有力的支持。Liu等[23]通過RP-HPLC對(duì)蛇毒蛋白組分分級(jí),以SDS-PAGE進(jìn)行分離,對(duì)每個(gè)蛋白條帶采用切膠鑒定的方法獲得蛇毒蛋白類物質(zhì)信息。課題組采用定性/定量蛋白質(zhì)組方法對(duì)犀角、羚羊角、水牛角、牦牛角等角類動(dòng)物藥蛋白質(zhì)類成分進(jìn)行比較與歸類,為珍稀瀕危動(dòng)物藥替代資源尋找與評(píng)價(jià)提供方法與思路[24-25]。

動(dòng)物藥提取物或體內(nèi)降解后釋放多肽類成分,以及在分離、分析過程中,制備的多肽部位,均是一個(gè)復(fù)雜的多肽混合體系,依賴經(jīng)典的多肽分離純化技術(shù)手段,無(wú)法快速全面獲知混合多肽部位中的物質(zhì)組成,而基于高分辨nanoLC MS/MS的多肽組學(xué)技術(shù),可實(shí)現(xiàn)動(dòng)物藥多肽類成分的快速定性分析[21]。課題組前期采用多肽組學(xué)方法對(duì)水牛角解熱活性部位的多肽組成進(jìn)行了分析鑒定,并對(duì)肽類成分的前體蛋白及釋放規(guī)律進(jìn)行整理,發(fā)現(xiàn)這些肽類主要由水牛角角蛋白的N-端、C-端序列釋放而來(lái);進(jìn)一步采用仿生提取方法對(duì)羚羊角、山羊角進(jìn)行處理,分析消化液中釋放的肽類成分及組成規(guī)律,結(jié)果表明,羚羊角與山羊角釋放的肽類成分來(lái)源蛋白、多肽序列與氨基酸組成均相似,這些肽段主要源于Ⅱ型角蛋白(KRT)、KRT14、KRT5、KRT34與KRT84的4個(gè)結(jié)構(gòu)域[26]。

動(dòng)物藥通常直接粉碎或煎煮后入藥,多數(shù)以口服為主,口服后其主要的蛋白質(zhì)、肽類成分在胃腸液、腸道微生物等的共同作用下,發(fā)生特異性或非特異性降解,一些多肽、小肽或寡肽類成分釋放出來(lái),基于多肽組學(xué)研究這些肽類成分的組成與釋放規(guī)律,對(duì)動(dòng)物藥功效物質(zhì)的闡明具有指導(dǎo)作用。

2.1.2.3 修飾組學(xué)(PTMomics) 蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(Post-translational modifications,PTMs)是指對(duì)翻譯后的蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾,以改變蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),從而影響蛋白質(zhì)在體內(nèi)的生物活性,干預(yù)細(xì)胞信號(hào)通路等[27]。在中藥動(dòng)物藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究過程中,我們留意到一些動(dòng)物藥在生產(chǎn)加工、煎煮熬制、生物體內(nèi)消化液作用等過程中,部分氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了化學(xué)變化,因而我們?cè)诘鞍踪|(zhì)組、多肽組應(yīng)用于動(dòng)物藥研究的基礎(chǔ)上,提出“動(dòng)物藥修飾組”的概念,即圍繞動(dòng)物藥蛋白質(zhì)、肽類成分在炮制加工、提取熬制及體內(nèi)消化液作用等過程發(fā)生的化學(xué)修飾、修飾類別、修飾位點(diǎn)、修飾數(shù)量等開展定性與定量研究,并進(jìn)一步關(guān)聯(lián)動(dòng)物藥傳統(tǒng)功效特點(diǎn)與修飾組的相關(guān)性與規(guī)律研究,對(duì)角類、膠類動(dòng)物藥蛋白質(zhì)、肽類物質(zhì)與功效相關(guān)性規(guī)律進(jìn)行探討,提出可行的研究思路與解決方法,以系統(tǒng)闡明其功效物質(zhì)基礎(chǔ)[21]。

課題組以鹿皮膠為例,比較了鹿皮熬制加工前后膠原蛋白類成分的羥基化修飾(Hydroxylation)、脫酰胺修飾(Deamidation)變化,發(fā)現(xiàn)熬制后的鹿皮膠較鹿皮的羥基化、脫酰胺修飾均顯著增加。膠類動(dòng)物藥的加工熬制過程是膠原蛋白溶解的過程,羥基化、脫酰胺修飾的共同特點(diǎn)都是形成-OH基團(tuán),如Asn脫酰胺后形成Asp,-NH2轉(zhuǎn)變?yōu)?OH,而Pro發(fā)生羥基化后變?yōu)镠yp,即在Pro的五元環(huán)3-或4-位上引入-OH,-OH的形成一定程度上增加了膠原蛋白、肽類與水形成氫鍵的趨勢(shì),有利于膠原蛋白、膠原肽的溶出[28]。

研究還發(fā)現(xiàn)鹿皮膠中除了Pro羥基化修飾外,Lys也發(fā)生羥基化修飾,經(jīng)羥基化修飾后,Lys轉(zhuǎn)變?yōu)榱u賴氨酸(Hyl)。在此基礎(chǔ)上,一些特定位點(diǎn)的Hyl會(huì)進(jìn)一步發(fā)生糖基化(Glycosylation)修飾:半乳糖(Galactose, Gal)通過β糖苷鍵與Hyl的O連接形成半乳糖基化修飾(Galactosyl-Hyl),葡萄糖(Glucose,Glc)通過α1-2糖苷鍵與Gal連接完成二糖基化(Glucosyl-galactosyl-Hyl)。修飾組分析表明,鹿皮膠中Gal-Hyl單糖基化修飾的肽段占6.30%,含Glc-Gal-Hyl二糖基化修飾的肽段占6.32%[29-30]。

2.1.2.4 多組學(xué)整合關(guān)聯(lián) 楊彬等[16]提出基于“轉(zhuǎn)錄組學(xué)-蛋白質(zhì)組學(xué)-多肽組學(xué)”整合關(guān)聯(lián)研究動(dòng)物藥蛋白質(zhì)、多肽類成分的思路,首先基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)構(gòu)建動(dòng)物藥蛋白質(zhì)、肽類數(shù)據(jù)庫(kù),而后通過高分辨質(zhì)譜分析,蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配鑒定,獲得動(dòng)物藥的蛋白質(zhì)、多肽類成分信息,進(jìn)而采用分離純化、化學(xué)合成等手段獲得動(dòng)物藥蛋白質(zhì)類成分,關(guān)聯(lián)、驗(yàn)證動(dòng)物藥蛋白質(zhì)、肽類成分的活性,從而系統(tǒng)闡釋動(dòng)物藥蛋白質(zhì)、肽類功效物質(zhì)基礎(chǔ)本質(zhì)。

課題組前期通過系統(tǒng)鑒定表征動(dòng)物藥蛋白質(zhì)、肽類物質(zhì)組成,明確蛋白質(zhì)、肽類成分發(fā)生修飾的位點(diǎn)與數(shù)量,將肽段序列規(guī)律性、修飾位點(diǎn)與數(shù)量的規(guī)律性整合,提出基于“蛋白質(zhì)/肽組學(xué)-修飾組學(xué)”研究動(dòng)物藥功效物質(zhì)基礎(chǔ)的思路與方法[21],將動(dòng)物藥蛋白質(zhì)類、肽類物質(zhì)的氨基酸序列、修飾位點(diǎn)、修飾數(shù)量的規(guī)律性與傳統(tǒng)功效關(guān)聯(lián),以闡釋動(dòng)物藥功效物質(zhì)基礎(chǔ)與功效作用特點(diǎn)的科學(xué)內(nèi)涵,為解決中藥動(dòng)物藥物質(zhì)基礎(chǔ)、生物效應(yīng)及質(zhì)量控制等關(guān)鍵問題提出思路與方法。

2.1.3 生物信息學(xué)(Bioinformatics)與計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)

2.1.3.1 基于生物信息學(xué)的數(shù)據(jù)挖掘與整理 生物信息學(xué)是生命科學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、數(shù)學(xué)、化學(xué)等學(xué)科交叉結(jié)合的新興學(xué)科,對(duì)生命科學(xué)的研究具有重要意義。通過在生物學(xué)中引入數(shù)學(xué)模型,將生物學(xué)理論研究應(yīng)用于指導(dǎo)、設(shè)計(jì)和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)生物學(xué),可顯著縮短實(shí)驗(yàn)周期[31]。當(dāng)今時(shí)代信息爆炸,基于大數(shù)據(jù)構(gòu)建及完善動(dòng)物藥數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)于信息挖掘、數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)、信息整合等意義重大,如構(gòu)建全基因庫(kù)、cDNA庫(kù)、蛋白質(zhì)、肽數(shù)據(jù)庫(kù)、質(zhì)譜MS/MS信息庫(kù)等,并不斷完善,從而保證動(dòng)物藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究的高通量、系統(tǒng)性與準(zhǔn)確性。高通量多組學(xué)研究形成了大量數(shù)據(jù)信息,特別是轉(zhuǎn)錄組學(xué)的巨大信息,需要借助生物信息學(xué)分析,充分挖掘數(shù)據(jù)信息。例如,基于轉(zhuǎn)錄組構(gòu)建芋螺毒素?cái)?shù)據(jù)庫(kù),平均而言,每個(gè)芋螺物種在基因序列水平上觀察到>100個(gè)芋螺毒素序列,在肽水平上觀察發(fā)現(xiàn)>1 000個(gè)芋螺毒素,這些需要借助生物信息學(xué)的方法對(duì)序列進(jìn)行整理、歸類,通過生物信息學(xué)識(shí)別芋螺毒素及其超家族分類[32]。

2.1.3.2 基于計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選的動(dòng)物藥活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn) 虛擬篩選技術(shù)是一個(gè)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)和高通量篩選的重要方法,是在已知藥物靶點(diǎn)生物結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)新的配體的過程,從而極大程度縮小人工方法進(jìn)行藥物篩選的研究范圍。虛擬篩選過程通常如下:選擇配體(目標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)或待篩選的化合物),選擇靶點(diǎn)(受體、離子通道、酶等),在分子對(duì)接軟件(Autodock、Discover Studio等)中進(jìn)行虛擬篩選,通過分析配體與靶點(diǎn)對(duì)接得分大小及結(jié)合效率檢測(cè)出最佳配體復(fù)合物的穩(wěn)定性,再針對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬或體外實(shí)驗(yàn)的藥物理論檢測(cè),從而篩選有效化合物[33-34]。

課題組前期通過膜分離、分級(jí)沉淀等方法制備不同蛤蜊酶解液部位,以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-4)抑制活性篩選確定活性部位,以LC-MS/MS鑒定活性部位全部多肽信息,將活性多肽與靶蛋白(ACE或DPP-4)進(jìn)行分子對(duì)接(Molecular docking),篩選確定活性肽類成分,通過化學(xué)合成多肽序列,驗(yàn)證并獲得ACE抑制肽(IC50=4.07 μmol·L-1)與DPP-4抑制肽(IC50=168.72 μmol·L-1),這一策略可顯著提高動(dòng)物藥活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究的效率[35-36]。李佳蕓等[37]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接方法篩選馬氏珍珠貝軟體來(lái)源的具有潛在降糖活性的肽類成分,首先基于蛋白組分析鑒定馬氏珍珠貝軟體中的主要蛋白質(zhì)類成分,通過Peptide Cutter在線工具模擬酶切獲得馬氏珍珠貝軟體可能的肽類成分,進(jìn)一步借助SYBYL-X 2.0軟件，Swiss Target、GeneCards、OMIM-GENE-MAP等數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行靶點(diǎn)篩選與分子對(duì)接,從模擬酶切肽段中篩選獲得28條潛在DPP-4抑制活性肽段及其對(duì)應(yīng)377個(gè)基因靶點(diǎn),進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確定其中最優(yōu)的DPP-4抑制活性肽。

隨著現(xiàn)代高效色譜分離、膜分離等技術(shù)的不斷發(fā)展,越來(lái)越多的研究模式轉(zhuǎn)向至“快速分離—高效鑒別—虛擬篩選”的研究思路,即通過制備型色譜分離手段(柱層析、分級(jí)沉淀、膜分離等)獲得動(dòng)物藥活性部位,采用基于液質(zhì)聯(lián)用的化學(xué)物質(zhì)組分析鑒定,確定化學(xué)組成信息,通過計(jì)算機(jī)模擬動(dòng)物藥活性部位中化學(xué)物質(zhì)組成與靶蛋白相互作用情況,以此篩選確定活性化學(xué)物質(zhì),通過表達(dá)、化學(xué)合成等手段制備活性物質(zhì)進(jìn)行活性驗(yàn)證,最終闡明動(dòng)物藥功效物質(zhì)[38]。

2.1.3.3 生物信息學(xué)與計(jì)算機(jī)結(jié)合的蛋白質(zhì)、肽類結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 一直以來(lái),科研工作者需要借助X射線、冷凍電鏡等實(shí)驗(yàn)確定完整的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。而現(xiàn)階段可通過生物信息學(xué)結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助解析(機(jī)器學(xué)習(xí)、人工智能等)來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)、肽類的結(jié)構(gòu)。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)、肽類結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法主要包括基于模板方法(Template-based method,TBM)和無(wú)模板方法(Template-free method,TFM)。TBM包括:數(shù)據(jù)檢索得到目標(biāo)蛋白的一組同源性序列,并根據(jù)序列獲得一個(gè)或多個(gè)折疊結(jié)構(gòu)模板,目標(biāo)序列與模板序列一致的片段則直接使用模板的對(duì)應(yīng)折疊結(jié)構(gòu);對(duì)于目標(biāo)序列與模板序列不一致的區(qū)域,采用碎片組裝、優(yōu)化算法或是數(shù)據(jù)庫(kù)方法等單獨(dú)預(yù)測(cè)。TFM通過從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中根據(jù)同源性序列比對(duì)結(jié)果找到一些片段的結(jié)構(gòu)并將其放入片段庫(kù)中,然后找到評(píng)分較高的片段結(jié)構(gòu)拼成初始結(jié)構(gòu),采用片段組裝的方法,以片段結(jié)構(gòu)為單元,通過計(jì)算機(jī)輔助等方式演化蛋白質(zhì)全局結(jié)構(gòu)[39]。

二硫鍵是由蛋白質(zhì)2個(gè)半胱氨酸之間配對(duì)形成的一種共價(jià)鍵,可存在于同一條蛋白質(zhì)多肽鏈內(nèi),亦可存在于不同多肽鏈之間。利用生物信息學(xué)結(jié)合計(jì)算機(jī)科學(xué)、數(shù)學(xué)、生物學(xué)等技術(shù)方法進(jìn)行二硫鍵預(yù)測(cè):基于現(xiàn)有蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù),如PDB,構(gòu)建高精度蛋白質(zhì)二硫鍵數(shù)據(jù)集,在此基礎(chǔ)上對(duì)該數(shù)據(jù)集進(jìn)行詳細(xì)的統(tǒng)計(jì)與計(jì)算分析,研究二硫鍵的形成與分布規(guī)律,預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白、多肽的空間結(jié)構(gòu)。二硫鍵的形成是蛋白質(zhì)、肽類折疊過程的重要步驟,二硫鍵的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)對(duì)于活性肽類發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)工程、藥物設(shè)計(jì)等都有著積極而重要的意義[40]。

2.1.4 分子生物學(xué)與生物工程 人工麝香的研制與產(chǎn)業(yè)化是動(dòng)物藥研究領(lǐng)域標(biāo)志性成果之一,通過對(duì)麝香主要成分,麝香酮、芳活素、激素類等成分的合成與配制,從化學(xué)成分類同性、生物活性一致性、理化性質(zhì)近似性、低毒性等方面研制成功人工麝香。人工麝香的研制是我國(guó)珍稀動(dòng)物藥材代用品研究的重大突破,為珍稀動(dòng)物藥類效資源、替代產(chǎn)品的研究開辟新途徑[41]。

基于生物工程技術(shù)制備動(dòng)物藥來(lái)源活性蛋白質(zhì)、肽類物質(zhì),是除化學(xué)合成外另一種主要的產(chǎn)業(yè)化途徑,例如,1991年中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所構(gòu)建了酵母工程菌,分泌表達(dá)的水蛭素抗凝血酶活力單位10～20 ATU·mL-1,1997年譚樹華等構(gòu)建了重組水蛭素工程菌,而后進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝,獲得發(fā)酵液的抗凝活力可達(dá)850 ATU·mL-1[42]。庾石山等采用重組表達(dá)的方式制備了一系列角蛋白,重組角蛋白具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗驚厥等功效[43]。楊金玲、夏揚(yáng)等[44-45]采用基因克隆與重組表達(dá)的方式制備蝎毒多肽BmK AngM1與Bmk NaTx12。此外,芋螺毒素[46]、蜘蛛多肽[47]、蜈蚣多肽[48]等亦可通過重組表達(dá)的方式制備。

近年來(lái),類器官(Organoids)培養(yǎng)技術(shù)日益發(fā)展,應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域,類器官來(lái)源于自組織和自我更新的干細(xì)胞,是利用干細(xì)胞的自組織特性進(jìn)行體外3D培養(yǎng)后形成的細(xì)胞團(tuán)[49]。在研究來(lái)源器官發(fā)育、生物學(xué)和病理生理學(xué)方面,類器官比傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)更符合生理機(jī)制與進(jìn)程,現(xiàn)階段已有多種策略可在體外培養(yǎng)得到具有功能的胰島類器官,并探討胰島類器官實(shí)際應(yīng)用于糖尿病的研究與治療的可能性[50]。在動(dòng)物藥研究方面,Jens等[51]建立了蛇毒腺類器官,并應(yīng)用于體外生成蛇毒毒液。此外,有研究開發(fā)了一種皮膚重建的方法,基于人源性角質(zhì)提取物與納米纖維結(jié)合,采用3D打印技術(shù)制備一種新型皮膚替代物[52],亦有報(bào)道將角蛋白通過3D打印方式制備成犀角[53]。這些研究啟示我們,化學(xué)、生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)的多學(xué)科交叉給動(dòng)物藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了新的思路與途徑,可能成為獲取動(dòng)物藥功效物質(zhì)、尋找珍稀瀕危動(dòng)物資源類效品或替代資源更高效的方法與手段。

2.2 動(dòng)物藥傳統(tǒng)功效與生物學(xué)評(píng)價(jià)研究

2.2.1 動(dòng)物藥功效與機(jī)制研究 活性強(qiáng)是動(dòng)物藥特點(diǎn)之一,如蜈蚣、全蝎具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙,通絡(luò)止痛,攻毒散結(jié)之功;水蛭具破血通經(jīng),逐瘀消癥之功;土鱉蟲具破血逐瘀,續(xù)筋接骨之功;斑蝥具破血逐瘀,散結(jié)消癥,攻毒蝕瘡之功等。動(dòng)物藥的生物效應(yīng)機(jī)制有必要闡明,為動(dòng)物藥功效發(fā)揮與中醫(yī)臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。Lu等[15]研究發(fā)現(xiàn)蝎毒的活性物質(zhì)主要是作用于Na+、K+、Cl-、Ca2+離子通道的毒素多肽,其中短鏈毒素由29～39個(gè)氨基酸殘基組成,含有3對(duì)或4對(duì)二硫鍵,主要作用于K+通道或者Cl-通道,分離純化得到的東亞鉗蝎粗毒可以通過直接增強(qiáng)Nav1.7的活性產(chǎn)生致痛作用。水蛭素具有很強(qiáng)的抗凝血酶活性,是由65或66個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽,水蛭素N-端有3對(duì)分子內(nèi)二硫鍵,分別為Cys6-Cys14、Cys16-Cys28與Cys22-Cys39,二硫鍵的結(jié)構(gòu)決定了水蛭素穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)和凝血活性[54]。研究表明,水蛭素活性中心位于結(jié)構(gòu)緊密的N-端,能夠識(shí)別凝血酶堿性氨基酸富集位點(diǎn),并與之結(jié)合[55]。水蛭素C-端含有多個(gè)酸性氨基酸,有利于其和凝血酶結(jié)合。水蛭素C-端含有一個(gè)被磺酸化的酪氨酸(Tyr63)以及一個(gè)被糖基化的酪氨酸(Tyr45)。酸性氨基酸殘基能阻止凝血酶與纖維蛋白原結(jié)合,從而產(chǎn)生抗凝血的作用[56]。水蛭素N-端1～3位的氨基酸可與凝血酶活性位點(diǎn)結(jié)合,是其重要的結(jié)構(gòu)序列;水蛭素還含有Pro-Lys47-Pro的結(jié)構(gòu)單元,在保持分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的同時(shí),可引導(dǎo)水蛭素以正確的空間方向與凝血酶結(jié)合。而水蛭素C-端所含有的Asp56-Phe-Xaa-Yaa-Ile-Pro結(jié)構(gòu)單元可阻斷凝血酶上的纖維蛋白原識(shí)別位點(diǎn)。目前已發(fā)現(xiàn)的水蛭素類結(jié)構(gòu)均含有上述特征性結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)單元,這是水蛭素抗凝血酶活性的關(guān)鍵。蟾毒內(nèi)酯為源于動(dòng)物藥蟾酥的一類小分子化合物,其中沙蟾毒素(Arenobufagin)的抗腫瘤活性最強(qiáng),可能與活化PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路參與凋亡和自噬調(diào)控的抗癌機(jī)制有關(guān)[57];華蟾毒精(Cinobufagin)通過靶向微管切割蛋白KATNB1抑制微管聚合從而抑制腫瘤細(xì)胞有絲分裂[58]。

動(dòng)物藥成分復(fù)雜,起效方式與作用特點(diǎn)均不同于傳統(tǒng)植物藥,近年來(lái)基于化學(xué)生物學(xué)發(fā)展形成的藥物生物效應(yīng)機(jī)制研究方法,也為動(dòng)物藥效應(yīng)機(jī)制研究提供借鑒與方法,如運(yùn)用多組學(xué)技術(shù)從分子水平闡述藥物干預(yù)前后的基因、蛋白質(zhì)、神經(jīng)肽、內(nèi)源代謝物等變化,尋找作用通路與靶點(diǎn)并驗(yàn)證。此外,基于天然產(chǎn)物靶點(diǎn)識(shí)別策略:通過共價(jià)結(jié)合親和磁珠[59-60]、生物素修飾[61]、生物正交反應(yīng)[62]、光親和探針[63]等篩選靶點(diǎn);基于非標(biāo)記定量的天然產(chǎn)物靶點(diǎn)識(shí)別方法:藥物親和反應(yīng)的靶點(diǎn)穩(wěn)定性技術(shù)(Drug affinity responsive target stability,DARTS)[64]、細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)(Cellular thermal shift assay,CETSA)[65]、靶點(diǎn)響應(yīng)可及性變化譜技術(shù)(Target responsive accessibility profiling,TRAP)[66]、色譜共洗脫靶點(diǎn)識(shí)別技術(shù)(Target identification by chromatographic co-elution,TICC)[67]等新的技術(shù)與策略,均可借鑒作為動(dòng)物藥活性物質(zhì)作用機(jī)制研究的技術(shù)與方法。

2.2.2 適宜于動(dòng)物藥研究的模式生物建立與評(píng)價(jià)研究 動(dòng)物藥傳統(tǒng)服用方法以口服為主,富含蛋白質(zhì)、肽類的動(dòng)物藥或提取物經(jīng)過體內(nèi)復(fù)雜消化過程后,發(fā)揮生物效應(yīng)的物質(zhì)可能并非蛋白質(zhì)、肽類原型,因此僅通過細(xì)胞模型或離體器官模型,不能很好地反映動(dòng)物藥體內(nèi)效應(yīng)過程,需要開發(fā)基于模式生物評(píng)價(jià)的整體動(dòng)物模型,以評(píng)價(jià)動(dòng)物藥生物效應(yīng)。

2.2.2.1 斑馬魚模型建立與應(yīng)用 細(xì)胞模型或嚙齒類動(dòng)物模型是中藥活性成分和毒性篩選的傳統(tǒng)方法,但存在不能反映機(jī)體完整情況或開銷大且費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)。斑馬魚作為一種模式生物,胚胎和幼魚體積小,可大規(guī)模飼養(yǎng)于細(xì)胞板,不僅減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開支,且斑馬魚胚胎及幼魚身體透明，能直接吸收培養(yǎng)介質(zhì)中物質(zhì),因此適用于復(fù)雜中藥活性成分的大規(guī)模篩選以及毒性評(píng)價(jià)。更重要的是,斑馬魚是一種完整動(dòng)物模型,疼痛、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管張力和腸道運(yùn)動(dòng)等可在斑馬魚模型中觀察到的疾病相關(guān)表型,同時(shí)可以保留中藥代謝過程,能夠?qū)τ行С煞旨捌浯x組分同時(shí)進(jìn)行測(cè)評(píng),在中藥代謝研究中可以得到更為完整的研究結(jié)果[68]。張友剛等采用斑馬魚模型,從動(dòng)物免疫相關(guān)細(xì)胞因子、巨噬細(xì)胞吞噬能力等指標(biāo)評(píng)價(jià)新阿膠對(duì)化療誘導(dǎo)免疫損傷的保護(hù)作用[69]。

2.2.2.2 秀麗隱桿線蟲模型建立與應(yīng)用 秀麗隱桿線蟲作為模式生物評(píng)價(jià)疾病發(fā)生與調(diào)控機(jī)制有諸多優(yōu)勢(shì),秀麗隱桿線蟲基因組保守性高,且和人類疾病的相關(guān)性高。秀麗隱桿線蟲體積小,生命周期短,易于在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)。此外,秀麗隱桿線蟲整個(gè)生命周期都是透明的,可通過熒光標(biāo)記來(lái)跟蹤蟲體內(nèi)物質(zhì)變化[70]。安苗青等以秀麗隱桿線蟲模型評(píng)價(jià)龜鹿二仙膠的抗衰老活性,結(jié)果表明,龜鹿二仙膠可顯著提高線蟲行動(dòng)能力,改善氧化損傷狀態(tài),延長(zhǎng)線蟲平均壽命[71]。劉春紅等以秀麗隱桿線蟲為模式生物,通過壽命、紫外應(yīng)激、熱應(yīng)激、運(yùn)動(dòng)、產(chǎn)卵等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鹿茸乙醇提取物對(duì)線蟲衰老的影響[72]。李振旺研究馬鹿角水提物可能通過激活線粒體信號(hào)通路,上調(diào)相關(guān)抗氧化基因表達(dá)水平,增強(qiáng)線蟲抗氧化應(yīng)激能力,延緩線蟲衰老[73]。

2.2.2.3 果蠅模型建立與應(yīng)用 果蠅作為模式動(dòng)物,有著易于飼養(yǎng)、繁殖力強(qiáng)、生長(zhǎng)周期短、遺傳背景明確等特點(diǎn)。正因如此,以果蠅為模式動(dòng)物的研究吸引了越來(lái)越多的科研工作者,而研究過程中,許多生命現(xiàn)象和規(guī)律也正在揭示或即將揭示。基于果蠅模式動(dòng)物研究,胚胎發(fā)育、先天性免疫和晝夜節(jié)律等成果均先后獲得了諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng),有效推動(dòng)了生命醫(yī)學(xué)發(fā)展[74]。史晉源等以果蠅為模式動(dòng)物研究甲魚肽對(duì)果蠅壽命的影響,結(jié)果表明,甲魚肽可以提高雌、雄果蠅體內(nèi)抗氧化酶活力,緩解脂質(zhì)過氧化作用,從而延長(zhǎng)果蠅壽命,具有潛在抗衰老作用[75]。

2.3 動(dòng)物藥品質(zhì)評(píng)價(jià)與質(zhì)量控制研究

隨著科技進(jìn)步,儀器方法日益完善,動(dòng)物藥質(zhì)量控制研究方面取得了長(zhǎng)足進(jìn)步,專屬性好、準(zhǔn)確性高、靈敏度高的方法,廣泛應(yīng)用于動(dòng)物藥飲片、中間體、成藥的質(zhì)控,對(duì)動(dòng)物藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)手段不斷提升具有重要作用。

2.3.1 DNA條形碼的應(yīng)用 作為一種新興的生物鑒定方法,DNA條形碼技術(shù)是應(yīng)用基因組中一段標(biāo)準(zhǔn)的DNA短序列進(jìn)行物種鑒定的分子診斷技術(shù)[76]。Hebert[77]提出COⅠ序列可作為DNA條形碼序列對(duì)動(dòng)物進(jìn)行鑒定。Yao等[78]提出ITS2可作為COⅠ序列的補(bǔ)充序列對(duì)動(dòng)物進(jìn)行鑒定。陳士林等[79]在大量樣本研究的基礎(chǔ)上,建立了以COⅠ為主體、ITS2序列為補(bǔ)充的動(dòng)物藥材DNA條形碼鑒定體系,該體系已納入《中國(guó)藥典》。此外,由于一些動(dòng)物物種的COⅠ序列差異較低,甚至不變,Luo等[80]提出用12S rRNA基因的種內(nèi)和種間遺傳變異來(lái)鑒別角類動(dòng)物藥,可準(zhǔn)確區(qū)分綿羊角、山羊角、水牛角、馬鹿角、羚羊角。

2.3.2 特征肽的發(fā)現(xiàn)與動(dòng)物藥品質(zhì)評(píng)價(jià) 作為DNA條形碼鑒別的重要補(bǔ)充方法,特征肽作為動(dòng)物藥專屬性檢測(cè)指標(biāo),越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于動(dòng)物藥質(zhì)量控制,2020年版《中國(guó)藥典》中的阿膠、鹿角膠、龜甲膠均以特征肽進(jìn)行鑒別。特征肽應(yīng)具有專屬性與易檢測(cè)性,即僅在目標(biāo)樣品中可被檢測(cè)出來(lái),且響應(yīng)性好。特征肽的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用對(duì)動(dòng)物藥質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)提升意義重大。

2.3.2.1 基于化學(xué)物質(zhì)組與多元統(tǒng)計(jì)分析的特征肽發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用 程顯隆等[81]通過UPLC-QTOF-MS對(duì)動(dòng)物藥酶解物總離子流進(jìn)行分析,將所有質(zhì)譜離子信息采用多元數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)主成分分析(PCA),結(jié)合正交偏最小二乘法(PLS-DA)比較,篩選離散值即為潛在的特征肽,進(jìn)一步依據(jù)質(zhì)譜碎片信息鑒定了部分特征肽的信息,最終可鑒別阿膠、牛皮膠、豬皮膠、龜甲膠與鹿角膠。在此方法下，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法,從大量數(shù)據(jù)中提取出關(guān)鍵離子信息以發(fā)現(xiàn)特征肽,因此對(duì)樣本量要求較高,即樣本量越大特征肽的準(zhǔn)確度越高。

2.3.2.2 基于生物信息學(xué)比較分析的特征肽發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用 Li等[82]通過Shotgun分析動(dòng)物藥樣品中主要蛋白類型,基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取各物種相應(yīng)類型蛋白質(zhì)序列信息,通過比對(duì)不同物種同源蛋白序列中的差異氨基酸位點(diǎn),并以含差異位點(diǎn)的胰蛋白酶酶切肽段為潛在的目標(biāo)特征肽,通過LC-MS/MS對(duì)驗(yàn)證這些潛在特征肽,最終篩選確定特征肽,可用于阿膠、馬皮膠、牛皮膠、豬皮膠的鑒別與區(qū)分。生物信息學(xué)分析比較是基于已知的物種蛋白質(zhì)序列發(fā)現(xiàn)特征肽的方法,可行性與準(zhǔn)確度較高,但可能因缺乏特征肽的PTM信息,而缺失部分潛在特征肽。

2.3.2.3 基于多肽組與數(shù)學(xué)集合比較分析的特征肽發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用 課題組提出采用多肽組與數(shù)學(xué)集合結(jié)合的分析方法尋找特征肽:基于非靶向質(zhì)譜方法分析待測(cè)動(dòng)物藥樣品、偽品的全部多肽序列信息,取不同批次待測(cè)動(dòng)物藥樣品肽段序列信息的交集設(shè)為集合Ⅰ(即這部分肽段在每個(gè)批次待測(cè)樣品中均可被測(cè)出),取其他各偽品樣品中肽段序列信息的并集為集合Ⅱ(即只要存在的偽品肽段均包含在內(nèi))。集合Ⅰ相對(duì)于集合Ⅱ的補(bǔ)集,即僅在集合Ⅰ中存在,且不在集合Ⅱ中存在的肽段信息即為潛在的特征肽,進(jìn)一步通過靶向質(zhì)譜驗(yàn)證確定特征肽。通過這一方法發(fā)現(xiàn)了6條鹿皮膠特征肽序列,及其他物種的8條同源肽段,基于這些特征肽可鑒別區(qū)分鹿皮膠、阿膠、馬皮膠、牛皮膠與豬皮膠[83-84]。根據(jù)相同方法,發(fā)現(xiàn)了4條水牛角特征肽,可用于區(qū)分水牛角、山羊角與豬蹄甲[85]。

2.3.2.4 基于定量多肽組分析的特征肽發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用 不同物種來(lái)源的樣品,由于種屬差異導(dǎo)致個(gè)別氨基酸位點(diǎn)的差異是發(fā)現(xiàn)種屬間特征肽的關(guān)鍵。然而,對(duì)于相同物種不同藥用部位,如鹿角膠與鹿皮膠,其蛋白質(zhì)序列一致,不存在差異氨基酸位點(diǎn)。為解決相同來(lái)源不同部位動(dòng)物藥區(qū)分問題,課題組采用非標(biāo)記定量(LFQ)多肽組學(xué)結(jié)合糖基化位點(diǎn)分析方法,篩選含量差異特征肽,結(jié)合PCA、火山圖(Volcano plot)和熱圖(Heatmap)對(duì)比尋找具有潛在差異的糖基化肽段,通過質(zhì)譜的MRM模式篩選并確證了4條含有糖基化修飾位點(diǎn)的特征肽,在鹿角中含量顯著大于鹿皮,從而實(shí)現(xiàn)鹿角與鹿皮的區(qū)分[86]。此外,課題組采用定量多肽組與數(shù)學(xué)集合分析結(jié)合,發(fā)現(xiàn)3個(gè)特征肽,可實(shí)現(xiàn)近緣物種水牛角、牦牛角及黃牛角的鑒別與區(qū)分[87]。

2.3.3 專屬性成分的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用

2.3.3.1 用于摻偽鑒定與評(píng)價(jià)研究 基于特征肽的“有”或“無(wú)”可實(shí)現(xiàn)動(dòng)物藥的種屬鑒別,如鹿膠樣品中僅檢測(cè)出鹿源特征肽的為正品,如檢測(cè)出其他物種特征肽則表明存在摻偽情況。而摻偽樣品中偽品物種特征肽相對(duì)含量與偽品摻入量呈線性相關(guān),可用于計(jì)算摻偽比例。對(duì)于響應(yīng)靈敏度高的特征肽,可實(shí)現(xiàn)1%的摻偽檢測(cè)限。據(jù)此,課題組實(shí)現(xiàn)了摻有牛皮的鹿皮膠、摻有牛皮的阿膠、摻有馬皮的阿膠等樣品摻偽比例的檢測(cè),并根據(jù)不同物種特征肽的相對(duì)峰面積確定摻偽比例;此外,根據(jù)鹿皮、鹿角特征肽含量的相對(duì)差異,可計(jì)算鹿角膠中摻有鹿皮樣品比例范圍[29,84,86]。

2.3.3.2 特征肽的絕對(duì)定量研究 2020年版《中國(guó)藥典》阿膠的含量測(cè)定項(xiàng)下以UPLC-MS/MS對(duì)2條驢源多肽進(jìn)行絕對(duì)定量測(cè)定,從而規(guī)定阿膠含量限度。課題組前期研究中發(fā)現(xiàn),待檢測(cè)酶解樣品中存在大量膠原肽,在質(zhì)譜離子化過程中,由于膠原肽中大量甘氨酸殘基的促質(zhì)子化作用,使得部分特征肽在ESI離子化過程中,質(zhì)譜響應(yīng)顯著增強(qiáng),這一響應(yīng)增強(qiáng)(Response boosting)效應(yīng)可顯著提高特征肽的檢測(cè)靈敏度,部分特征肽檢測(cè)LOD可達(dá)0.5 ng·mL-1,這對(duì)于動(dòng)物藥真?zhèn)舞b別具有積極意義。同時(shí),通過同位素特征肽的校正,建立了驢、豬、牛特征肽的絕對(duì)定量方法學(xué),可準(zhǔn)確檢測(cè)動(dòng)物藥中特征肽的絕對(duì)含量,阿膠、牛皮膠及豬皮膠中特征肽的含量分別為(1 763±146)、(1 805±245)、(145±37)μg·g-1[88]。

3 動(dòng)物藥現(xiàn)代研究展望

3.1 構(gòu)建動(dòng)物藥大數(shù)據(jù)庫(kù)

基于全基因組測(cè)序技術(shù)、蛋白質(zhì)組多肽組技術(shù)、5G云數(shù)據(jù)技術(shù)等,對(duì)動(dòng)物類中藥的基源動(dòng)物、動(dòng)物藥材、飲片、加工中間體、中成藥等的生產(chǎn)工藝、物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量評(píng)價(jià)等進(jìn)行全面分析與數(shù)據(jù)共享。

目前動(dòng)物藥,尤其是瀕危珍稀動(dòng)物藥的全基因數(shù)據(jù)、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)不完善,嚴(yán)重制約著動(dòng)物藥物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。如課題組前期開展珍稀瀕危角類動(dòng)物藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究中,因犀牛、賽加羚羊基因庫(kù)與蛋白質(zhì)庫(kù)的不完善,只能采用近緣物種(?？?Bovine)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配鑒定,大量的MS/MS圖譜與牛科蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)不能匹配,而無(wú)法獲得關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)信息,更無(wú)法獲得犀角或羚羊角專屬性物質(zhì)基礎(chǔ)。根據(jù)現(xiàn)有基因信息加以注釋分析,獲取基因功能信息及蛋白質(zhì)信息,如已有報(bào)道關(guān)于賽加羚羊的全基因組測(cè)序,但是未完成注釋工作,可在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步完善基因注釋,以幫助完善動(dòng)物藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

3.2 動(dòng)物藥功效物質(zhì)基礎(chǔ)與體內(nèi)過程研究

動(dòng)物藥常以粉末或煎煮口服使用,且作用確切。動(dòng)物藥物質(zhì)組成主要包括:蛋白質(zhì)類、肽類、脂類、氨基酸類、生物堿類、元素類等,基于現(xiàn)代分析化學(xué)、儀器分析的技術(shù)手段,這些物質(zhì)基礎(chǔ)基本闡明,而基于整體動(dòng)物效應(yīng)評(píng)價(jià)手段亦可明確動(dòng)物藥的生物效應(yīng)。但是,連接動(dòng)物藥“物質(zhì)”與“功效”之間的橋梁,即動(dòng)物藥體內(nèi)過程,仍不清晰,不同于小分子化合物的體內(nèi)Ⅰ相代謝與Ⅱ相代謝,動(dòng)物藥的體內(nèi)過程像是一個(gè)“黑箱”,亟待建立適宜的方法體系加以闡明?，F(xiàn)代研究提出了一些關(guān)于蛋白質(zhì)類、肽類成分體內(nèi)過程研究思路,并建立方法,如同位素標(biāo)記與示蹤、熒光標(biāo)記成像、肽類成分跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、腸道微生物干預(yù)等,但是仍無(wú)法闡明動(dòng)物藥如何在機(jī)體的復(fù)雜環(huán)境中發(fā)揮生物效應(yīng)的機(jī)制。因此,功效物質(zhì)的揭示與體內(nèi)過程的闡明是動(dòng)物藥研究亟待開展與解決的研究方向之一。

3.3 動(dòng)物藥溯源與精準(zhǔn)質(zhì)控體系

劉昌孝院士提出以中藥質(zhì)量標(biāo)志物(Q-Marker)為核心,從質(zhì)量要素的傳遞與溯源的基本研究模式,促進(jìn)中藥大品種及中藥方劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升[89]。動(dòng)物藥質(zhì)量控制仍存在不足,需要完善與提升,建立動(dòng)物藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法體系。同樣的,動(dòng)物藥從養(yǎng)殖、采收加工、炮制、提取、純化、制劑成型過程中,產(chǎn)業(yè)鏈長(zhǎng)、行業(yè)跨度大、物質(zhì)組成復(fù)雜,因而動(dòng)物藥的原料、中間體及產(chǎn)品的質(zhì)量控制與溯源系統(tǒng)的構(gòu)建是保證動(dòng)物藥行業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵?；谥兴嶲-Marker思路,中藥動(dòng)物藥可通過如DNA片段、專屬蛋白質(zhì)、特征肽段等標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用,對(duì)動(dòng)物藥原料、中間體、產(chǎn)品,乃至產(chǎn)業(yè)化過程進(jìn)行溯源與精準(zhǔn)質(zhì)控。以膠類動(dòng)物藥為例,可在包括下述研究基礎(chǔ)上構(gòu)建溯源與精準(zhǔn)質(zhì)控體系:①通過DNA鑒定對(duì)原料進(jìn)行基原鑒定;②基于物種專屬性特征肽、膠原蛋白的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)中間體與膠類藥材的質(zhì)量控制;③基于專屬性特征肽定性/定量分析實(shí)現(xiàn)以類動(dòng)物藥為原料方劑或產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

3.4 瀕危珍稀動(dòng)物藥類效資源研究與替代產(chǎn)品開發(fā)

瀕危珍稀動(dòng)物藥類效資源的尋找評(píng)價(jià)研究及替代產(chǎn)品開發(fā)是動(dòng)物藥發(fā)展方向之一。由于多種因素的影響,犀角、羚羊角等珍稀角類動(dòng)物藥資源的應(yīng)用受到限制或明令禁止,珍稀角類藥用動(dòng)物種群銳減,亟需尋找類效資源以緩解資源可持續(xù)利用與資源保護(hù)的矛盾。目前水牛角及其濃縮粉已作為犀角代用資源,而山羊角在解熱、抗驚厥功效方面被作為羚羊角類效資源使用,如現(xiàn)代中藥“金振口服液”,具有清熱解毒、祛痰止咳的功效,工業(yè)生產(chǎn)均以山羊角替代羚羊角制備金振口服液,解熱與抗炎的功效與羚羊角制備的金振口服液相當(dāng)。現(xiàn)階段,人工麝香、人工牛黃、人工虎骨等動(dòng)物藥資源基本實(shí)現(xiàn)了人工替代與產(chǎn)業(yè)化[90],而羚羊角類效資源研究與替代產(chǎn)品開發(fā)亟待開展(圖2)。

4 結(jié)語(yǔ)

本文基于生物化學(xué)、天然產(chǎn)物化學(xué)、中藥資源化學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、生物工程、生物信息學(xué)等多學(xué)科現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)進(jìn)展,結(jié)合動(dòng)物藥的品質(zhì)形成、功效物質(zhì)基礎(chǔ)、藥材生產(chǎn)與質(zhì)量評(píng)價(jià)、多途徑替代策略等層面,較為系統(tǒng)地回顧分析了近些年來(lái)我國(guó)動(dòng)物藥研究的方法學(xué)進(jìn)展,從基于多組學(xué)、生物信息學(xué)、生物工程等技術(shù)方法的動(dòng)物藥功效物質(zhì)純化、鑒定與制備研究;動(dòng)物藥生物效應(yīng)評(píng)價(jià)與機(jī)制研究;基于專屬肽類定性/定量分析的動(dòng)物藥精準(zhǔn)質(zhì)控研究;動(dòng)物藥現(xiàn)代研究方法學(xué)的展望等方面進(jìn)行了梳理和凝練[91],以期為推動(dòng)藥用動(dòng)物資源和動(dòng)物藥研究和產(chǎn)業(yè)化提供方法學(xué)借鑒,為進(jìn)一步豐富完善適宜于動(dòng)物藥研究的系統(tǒng)方法學(xué)提供參考,為促進(jìn)我國(guó)動(dòng)物藥資源與特色經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。