復(fù)方中草藥對云斑鮰熒光假單胞菌的抑菌試驗

羅 鵬

(天全縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 雅安 625599)

目前，水產(chǎn)疾病治療常用各類抗生素往往使病原菌產(chǎn)生耐藥性，水產(chǎn)品易產(chǎn)生大量的藥物殘留。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人們對水產(chǎn)品的食用安全意識逐漸增強和對產(chǎn)品質(zhì)量越來越重視，廣譜低毒的獸藥品質(zhì)和健康環(huán)保的綠色食品備受青睞。發(fā)展對環(huán)境無公害、無殘留、無污染、安全、可靠的綠色魚藥，生產(chǎn)綠色、環(huán)保、無公害水產(chǎn)品是擺在每個養(yǎng)殖戶面前必然的課題。中草藥作為天然、高效的抗菌藥物，耐藥性不顯著，而且毒副作用小。

云斑鮰屬溫水性淡水魚，高密度養(yǎng)殖以及運輸?shù)膿p傷，會繼發(fā)感染嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、愛德華氏菌等細菌，引發(fā)出血性腐敗癥、赤皮病、水霉病等細菌性疾病。其中由熒光假單胞菌引起的細菌性疾病在養(yǎng)殖過程中造成的困擾極大，給養(yǎng)殖戶和銷售商帶來很大的損失。本試驗探討了中草藥黃芪、黃柏對熒光假單胞菌的抑制作用，通過中草藥來抑制云斑鮰感染的熒光假單胞菌，將滿足云斑鮰養(yǎng)殖生產(chǎn)上尋求低毒、低殘留、綠色生態(tài)抗菌藥的需求。

一、材料與方法

1.試驗動物

身體健康、體表無任何損傷的云斑鮰20 尾，平均規(guī)格為55克/尾。

2.試驗時間與地點

試驗時間為2021年5月8-17日，試驗地點為成都某云斑鮰養(yǎng)殖場。

3.試驗方法

(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方。見表1。

表1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方

(2)試驗設(shè)計。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加黃芪、黃柏復(fù)合物，試驗共分5 組(表2)。每組需制備普通瓊脂培養(yǎng)基50毫升，分裝至5只滅菌培養(yǎng)皿中。

表2 試驗分組

將云斑鮰體表感染的熒光假單胞菌接種至不同濃度黃芪、黃柏復(fù)合物的培養(yǎng)基里。黃芪、黃柏復(fù)合物的添加量見表2，熒光假單胞菌接種后在37℃下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 小時，并觀察添加了不同濃度的黃芪、黃柏復(fù)合物培養(yǎng)基里熒光假單胞菌各自的生長情況。

(3)細菌感染。選10尾健康的云斑鮰，嚴格消毒殺菌后單獨放入1 只水族箱(水為實驗室經(jīng)過簡單曝氣的自來水)，用網(wǎng)具使魚體表機械受傷或用剪刀使其體表受傷，等受傷部位產(chǎn)生紅腫甚至潰爛，并且出現(xiàn)白色菌絲時進行細菌分離。

(4)細菌分離純化。挑選病癥明顯的魚，將其病變部位接種在肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱里經(jīng)過24 小時培養(yǎng)后，用革蘭氏染色和生化試驗的方法進行細菌鑒定。對肉湯中培養(yǎng)的細菌進行鑒定后，將其用劃線法接種在普通瓊脂培養(yǎng)基中，在37℃下、24小時進行純化培養(yǎng)。

(5)細菌接種。在健康的10尾云斑鮰身上人為劃1個傷口，取純化培養(yǎng)的單個熒光假單胞菌菌落接種至云斑鮰身上，讓其感染該細菌后觀察癥狀。嚴格按照接種細菌的方法，將病癥明顯的云斑鮰感染的熒光假單胞菌，采用平板劃線法接種到各試驗組。在37℃下、24 小時培養(yǎng)后觀察結(jié)果，記錄菌落數(shù)。

二、結(jié)果

1.菌種鑒別

通過革蘭氏染色后鏡檢，觀察到的細菌形態(tài)見圖1。革蘭染色后油鏡下觀察，呈紅色，為革蘭氏陰性；短桿狀，具圓端，成堆排列。生化試驗結(jié)果顯示微發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不發(fā)酵乳糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖。經(jīng)查閱資料發(fā)現(xiàn)，革蘭氏染色與生化試驗的結(jié)果與資料基本相符，判斷試驗的菌種是熒光假單胞菌。

圖1 細菌形態(tài)

2.細菌在不同中藥濃度培養(yǎng)基里的生長表現(xiàn)

對細菌進行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌在對照組上生長良好，菌落微凸，呈淡黃色，邊緣光滑整齊，表面較濕潤。與對照組相比，添加黃芪、黃柏復(fù)合物的培養(yǎng)基長勢較弱，表明黃芪、黃柏對熒光假單胞菌具有抑制效果。

3.不同中草藥濃度對熒光假單胞菌的抑制結(jié)果(表3)

由表3可以看出，試驗組對熒光假單胞菌具有抑菌作用。抑菌效果試驗組3 最明顯(P＜0.01)，其次為試驗組4、試驗組2(0.01＜P＜0.05)，試驗組1 與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)，當(dāng)培養(yǎng)基添加復(fù)方中草藥濃度為10%時，達到最大的抑菌效果。

表3 不同中草藥濃度時熒光假單胞菌的菌落數(shù) 個

三、小結(jié)與討論

1.黃芪、黃柏對熒光假單胞菌有較好的抑菌效果

中藥在防治疾病上的作用是以調(diào)動機體一切有利因素，提高免疫功能和防御功能而祛除病邪，康復(fù)機體。周顯青等(2003)試驗證實黃芪能明顯促進中華鱉血細胞吞噬率及血清的溶菌活力、殺菌活力。黃柏等能抑制細菌的呼吸和抑制細菌的核糖核酸(RNA)的合成，因而黃芪與黃柏可以有效抑制病原菌的繁殖。

2.不同中草藥濃度對熒光假單胞菌抑制效果的影響

本次試驗設(shè)計了4組不同的黃芪、黃柏中草藥濃度，試驗組與對照組相比都具有抑菌效果，但是試驗組的效果具有明顯的差異。黃芪、黃柏能抑制細菌自身的繁殖，但主要是通過增強機體的免疫功能達到抑菌、殺菌效果。試驗表明，黃芪、黃柏的濃度為10%時效果最好(P＜0.01)，當(dāng)超過或者不足時，不能有效控制病菌的生長繁殖，病菌仍能緩慢的生長。試驗濃度超過10%但抑菌效果卻不如10%濃度的抑菌效果，這一問題有待探討。

3.不足及改進之處

因為有些未考慮到的因素，本試驗的結(jié)果可能有偏差，如水體消毒滅菌的情況，試驗用水為自來水，除了曝氣沒有做其他處理，不能保證接種后病魚不被其他細菌感染，所以在接種病魚細菌培養(yǎng)后還應(yīng)該再進行一次細菌鑒別，保證試驗菌是所需的熒光假單胞菌。

本試驗有些操作還需改進，如接種病菌有很多種方法，魚體應(yīng)選用合適的方法——劃痕、肌肉接種。在菌落計數(shù)上不夠精準(zhǔn)，由于部分細菌生長成菌苔，很難辨認菌落個數(shù)，所以在統(tǒng)計時除了計算單個菌落數(shù)外，長成菌苔的部分是通過肉眼大致辨認菌落個數(shù)。