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    β-地中海貧血研究對象B細(xì)胞淋巴瘤因子11A基因rs4671393、rs766432位點檢測分析

    2022-10-18 09:05:48徐冬云黃潭靈李如凱
    大醫(yī)生 2022年19期
    關(guān)鍵詞:等位基因多態(tài)性貧血

    徐冬云,黃潭靈,李如凱

    (深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院檢驗科,廣東深圳 518108)

    β-地中海貧血是一種單基因遺傳病,主要流行于我國南方地區(qū),該病在臨床上從無癥狀到輸血依賴均可發(fā)生,表現(xiàn)出較大的差異,并且目前暫無理想的根治方法,可嚴(yán)重影響地區(qū)的出生人口質(zhì)量[1]。胎兒血紅蛋白(HbF)的升高有利于緩解患者的病情,目前部分研究以B細(xì)胞淋巴瘤因子11A(BCL11A)為切入點,利用基因編輯技術(shù)提高HbF含量以緩解患者癥狀[2]。研究顯示,HbF含量與BCL11A基因的單核苷酸多態(tài)性密切相關(guān),并在不同地區(qū)、種族中表現(xiàn)出一定差異[3]。本研究旨在分析深圳市寶安區(qū)β-地中海貧血患者BCL11A基因rs4671393、rs766432位點單核苷酸多態(tài)性與HbF的相關(guān)性,以期為寶安區(qū)β-地中海貧血患者的個性化編輯治療提供依據(jù),現(xiàn)報道如下。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 選取2020年1月至2021年6月深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院收治的120例β-地中海貧血患者設(shè)為觀察組,另選取同期院內(nèi)100名健康體檢者設(shè)對照組,進(jìn)行回顧性分析。觀察組患者中男性67例,女性53例;年齡22~46歲,平均年齡(37.58±6.46)歲;體質(zhì)量指數(shù)(BMI)18~28 kg/m2, 平 均 BMI(23.41±3.26)kg/m2。對照組研究對象中男性54名,女性46名;年齡24~49歲,平均年齡(39.06±5.48)歲;BMI 18~28 kg/m2, 平 均 BMI(22.86±3.54)kg/m2。兩組研究對象一般資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),組間具有可比性。本研究經(jīng)深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《重型β地中海貧血的診斷和治療指南(2017年版)》[4]中β-地中海貧血的診斷標(biāo)準(zhǔn);②血紅蛋白<60 g/L;③2周以上無羥基脲治療史或輸血史。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并多發(fā)性骨髓瘤、遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)增高綜合征等影響HbF的疾??;②合并明確診斷的惡性腫瘤;③合并嚴(yán)重精神或心理疾病無法配合研究。

    1.2 研究方法 采集兩組研究對象空腹靜脈外周血2 mL,使用EDTA抗凝的采血管收集,存放于2~4 ℃環(huán)境下。采用法國SEBIA全自動毛細(xì)管電泳儀(深圳市科時達(dá)電子科技有限公司,型號:sebia capillarys 2 flex piercing)及配套試劑對標(biāo)本進(jìn)行血紅蛋白電泳檢測。全血基因組DNA提取,使用基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取基因組DNA,嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行操作,將提取的基因組DNA置于-20 ℃冰箱中保存,并檢測DNA濃度和純度,純度在1.6~1.9 μg范圍內(nèi)為合格。采用Primer和OligO 6.0軟件設(shè)計引物,由上海生物工程有限公司合成,其中rs4671393位點引物序 列 為:5’-GTGTTCGGAGTCCTAAGAGC-3’、5’-TGTCTAAGATGGCTGTCCTGT-3’,退火溫度為60 ℃,產(chǎn)物大小為419 bp;rs766432位點引物序列為:5’-CCTGAAAGACGGCTAGAGTCT-3’、5’-GGCAAATTGAATCCAACTG-3’,退火溫度為54 ℃,產(chǎn)物大小為172 bp。限制性內(nèi)切酶的設(shè)計與合成:采用DNAssist2.0軟件確定內(nèi)切酶(加拿大Fermentas公司),rs4671393位點限制性內(nèi)切酶:Eco57I.水浴溫度37 ℃。酶切片段:GG型為419 bp,GA型為419 bp、169 bp、250 bp,AA型 169 bp、250 bp。使用 ABI-9700PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增,步驟如下:PCR總反應(yīng)體系為 25 μL,包括 10 μL 的 2×PCR mix,上下游引物各0.5 μL,1 μL DNA模板,并以雙蒸水補足為25 μL。在PCR儀中擴(kuò)增,反應(yīng)條件如下:94 ℃下預(yù)變性5 min,94 ℃下變形45 s,退火30 s,72 ℃延伸45 s,35個循環(huán),72 ℃終末延伸7 min。各反應(yīng)體系只控制退火溫度不同。將PCR產(chǎn)物置于4 ℃冰箱中保存,取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。BCL11A目的基因rs4671393、rs766432位點多態(tài)性PCR限制性片段長度多態(tài)性分析:取5 μL PCR產(chǎn)物分別加入Fast 10×Buffer緩沖液(ThermoFisher)1 μL,0.5 μL限制性內(nèi)切酶,3.5 μL去離子水,反應(yīng)總體系為10 μL,混合均勻后以1 000 r/min速度離心數(shù)秒,放置于恒溫水浴箱中約16 h,取10 μL酶切好的PCR產(chǎn)物加樣到2.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行凝膠電泳。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序,驗證酶切結(jié)果,使用測序儀ABI-PRISM3730儀器(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司,型號:PRISM3730)進(jìn)行測序,測序試劑使用Big Dyeterminator v3.1。使用chromas軟件讀出測序結(jié)果后,與Gene Bank參照序列進(jìn)行比較。

    1.3 觀察指標(biāo) ①比較兩組研究對象rs4671393、rs766432位點基因型與等位基因頻率。②比較兩組研究對象rs766432位點基因型與等位基因頻率。③分析BCL11A基因rs4671393、rs766432位點不同基因型與HbF的相關(guān)性。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以()表示,組間比較采用獨立樣本t檢驗;計數(shù)資料以[例(%)]表示,組間比較行χ2檢驗;采用Spearman檢驗分析rs4671393、rs766432位點不同基因型與HbF的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組研究對象rs4671393位點基因型與等位基因頻率比較 觀察組研究對象rs4671393位點AA基因型、A等位基因頻率高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

    表1 兩組研究對象rs4671393位點基因型與等位基因頻率比較 [例(%)]

    2.2 兩組研究對象rs766432位點基因型與等位基因頻率比較 觀察組研究對象rs766432位點CC基因型、C等位基因頻率較高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

    表2 兩組研究對象rs766432位點基因型與等位基因頻率比較 [例(%)]

    2.3 BCL11A基 因rs4671393、rs766432位 點 不同基因型與HbF的相關(guān)性 經(jīng)Spearman檢驗,BCL11A基因rs4671393、rs766432位點與HbF水平呈正相關(guān)(P<0.05),見表3。

    表3 BCL11A基因rs4671393、rs766432位點不同基因型與HbF的相關(guān)性

    3 討論

    β-地中海貧血根據(jù)疾病嚴(yán)重程度可分為重、中、輕型,該病的癥狀具有較大的變異性,癥狀輕的患者可能與正常人無異,而重型β-地中海貧血由于β基因缺失或突變導(dǎo)致β鏈無法合成或合成不足,需要依賴輸血維持生命[5]。近年有研究顯示,肽鏈間的不平衡狀態(tài)在HbF增加后得到有效改善,重型β-地中海貧血患者的臨床表型也有所減輕,有利于降低患者死亡率[6]。因此,促進(jìn)HbF增加、研究單核苷酸多態(tài)性的功能成為β-地中海貧血相關(guān)研究中的重要問題。由于基因多態(tài)性具有明顯的種族和地域差異,因此在β-地中海貧血多發(fā)的地區(qū)進(jìn)行基因多態(tài)性研究具有重要意義。

    BCL11A基因是一種鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄阻遏物,活躍于B淋巴細(xì)胞,在紅細(xì)胞中表達(dá)。BCL11A參與造血腫瘤的產(chǎn)生和正常淋巴細(xì)胞的發(fā)育,此外還是HbF主要的數(shù)量性狀位點。研究顯示,BCL11A基因表達(dá)減少,HbF水平隨之提高,證明BCL11A基因?qū)bF具有負(fù)調(diào)控作用[7]。BCL11A影響HbF水平的主要功能序列位于BCL11A基因第2個內(nèi)含子上rs1427407和rs4671393之間的功能區(qū)。這一區(qū)域中rs4671393位點、rs766432位點的多態(tài)性和HbF的相關(guān)性已在部分研究中證實,它不影響其編碼,但可能通過組建新的剪切信號對正常轉(zhuǎn)錄造成影響,從而調(diào)節(jié)基因表達(dá),減少BCL11A的基因表達(dá),提高γ珠蛋白基因表達(dá),促進(jìn)HbF生成[8]。

    本研究顯示,rs4671393位點純合子突變AA基因型有15例,rs766432位點純合子突變CC基因型有37例。其中同時具有這兩個位點的純合突變的有9例;rs4671393位點、rs766432位點雜合突變分別有45例、12例,其中具有兩個位點雜合突變的有8例。本研究對單純rs4671393位點突變、單純rs766432位點突變樣本的基因型和HbF的相關(guān)性進(jìn)行研究,結(jié)果顯示,BCL11A基因rs4671393、rs766432位點與HbF水平具有相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為0.716、0.639,提示BCL11A基因rs4671393位點、rs766432位點的多態(tài)性可在一定程度上對HbF水平造成影響。此外,基因序列中rs4671393位點定位是60,493,816,而基因序列中rs766432位點定位為60,492,835,兩者的位置比較接近,并且兩個位點間高度連鎖不平衡,兩者的基因突變在功能上或許存在某些關(guān)聯(lián)性或協(xié)同作用[9-10]。

    綜上,寶安地區(qū)人群存在BCL11A基因的rs4671393位點、rs766432位點多態(tài)性,該地區(qū)β-地中海貧血患者與健康人群的rs4671393位點、rs766432位點基因型、基因頻率都有一定差異,并且rs4671393位點的G-A突變、rs766432位點的A-C突變可能促進(jìn)HbF的合成。

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