地塞米松治療槍彈傷致兔開放性骨缺損合并海水浸泡的實驗研究

陳肖松，張淦，劉勝杰，馬武秀，陳聰聰，吳成如

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇一醫(yī)院，1.骨一科；2.骨二科，安徽合肥 230031)

骨缺損是戰(zhàn)爭中常見的損傷，火器傷導致的骨缺損因局部組織血運遭到嚴重破壞導致無法獲取充足的氧氣和營養(yǎng)，常出現(xiàn)延遲愈合。海戰(zhàn)及登陸作戰(zhàn)時，骨缺損常伴有海水浸泡，海水含多種致病菌，其還有滲透壓高以及高堿性的理化特點，影響受損組織的修復[1,2]。本研究制作火器傷致兔開放性骨缺損合并海水浸泡的動物模型，經(jīng)靜脈注射地塞米松治療，旨在觀察其效果，并分析其中的機理。

1 資料與方法

1.1 動物選擇及其相關分組

選擇56只日本大耳家兔(安徽醫(yī)科大學提供)，體重(2.5±0.43)kg。按隨機數(shù)字表法，將實驗動物隨機分為A、B兩組各28只，A組為空白對照組，B組為地塞米松治療組。每組分為1 d、3 d、1周、2周、4周、8周、12周7個亞組，每亞組4只兔子。

1.2 設備及儀器

人工海水由海鹽配制(國家海洋局第三研究所提供)。MDA、SOD試劑盒，Olympus光學顯微鏡(日本)，Pixel LINK 1394 Camera顯微鏡(美國)。超聲破碎儀，離心機，紫外可見光分光光度計。槍支及彈丸指標：中國東風速射運動手槍SS04型，口徑為5.6 mm，初速(V10)210～240 m/s，使用直徑5.6 mm槍彈。

1.3 方法

(1)動物手術方法：將20%烏拉坦(4 mg/kg，國藥集團化學試劑有限公司，國藥準字Q31/0106000055c444-2020，批號：20210907)通過耳緣靜脈注射進行麻醉，將實驗動物固定于支架上，隨機選擇單側后肢對準股骨中段進行槍擊，槍口距離20 cm，造成股骨開放性骨缺損，傷后患肢均行簡單固定及包扎，將傷肢浸泡于人工海水1 h，水溫控制在21℃，室溫25℃。A組(對照組)：行常規(guī)清創(chuàng)+股骨復位內固定術，一期閉合傷口。B組(地塞米松治療組)：行常規(guī)清創(chuàng)+股骨復位內固定，一期閉合傷口，立即于靜脈注射地塞米松注射液(5 mg/kg，山東辰欣藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H37021969，批號：2108302212)。所有動物均置于動物房中飼養(yǎng)，青霉素粉針劑(華北制藥股份有限公司，國藥準字H13020657，批號：F1042106)40 WU肌肉注射1次/d×3 d，定時換藥，傷后愈合后拆線。

(2)取材與石蠟切片制作：各亞組于術后1 d、3 d、1周、2周、4周、8周、12周各取4只兔，取各實驗組動物骨缺損周圍組織100 mg，移入玻璃勻漿器中，加1 mL勻漿介質，使組織勻漿化。將漿液放入離心管中，4000 rP/min離心10 min，棄上清液，加入預冷的0.05 mol/L pH為7.8的磷酸緩沖液，0～4 ℃下超聲波破碎, 破碎液在10000 rP/min的4℃離心機中離心30 min，上清液即為粗酶液，-20℃保存?zhèn)溆?。另外，于傷肢股骨骨缺損處截取標本，10%的甲醛處理標本，固定24 h，硝酸溶液脫鈣，制成石蠟切片，厚度5 μm。

1.4 觀察指標

(1)一般情況的觀察：實驗用兔子是否存活，傷口是否感染等。

(2)影像學觀察：傷后4周、8周、12周，實驗兔在麻醉后行X線攝片，觀察槍彈傷造成傷肢股骨骨折及骨缺損的愈合情況，并經(jīng)相關儀器測得骨缺損部位的骨痂灰度值?；叶戎禍y定方法：在X線機下拍攝實驗動物患肢正側位片，隨機于膠片上骨缺損區(qū)域取3個相應觀測點，用相關圖像軟件(Photoshop cc2021)分析各點骨痂灰度值，并取其平均數(shù)值作為指標。

(3)組織學觀察：骨標本脫鈣、制作石蠟切片、H-E染色后，光鏡下觀察骨折處肉芽組織、纖維組織、軟骨細胞和骨細胞等生長情況。

(4)動物標本骨缺損周圍組織中MDA含量、SOD活力測定：MDA含量采用TBA比色法測定，吸取離心的上清液0.2 mL和1.8 mL蒸餾水(對照加2 mL蒸餾水)，加入2 mL的0.6%TBA溶液，混勻物于沸水浴上反應15 min，迅速冷卻后再在4000 rP/min下離心10 min。取上清液測定532 nm波長下的消光度，用比濃度表示MDA(nmoL/mg)含量。SOD測定采用黃嘌呤氧化酶法，取上清液，按照試劑盒說明書配制相應溶液，在560 nm波長下測定各管的OD值，計算SOD活性。用比活力表示SOD(U/mg)活力。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 一般情況觀察

所有實驗動物均存活，傷口無明顯感染，均愈合，予以拆除傷后縫線，骨缺損臨床愈合后，動物活動能力良好。

2.2 影像學觀察

術后4周A、B兩組骨缺損區(qū)有薄云狀骨痂陰影，術后8周兩組骨缺損部位組織陰影較4周時增強，少部分外骨痂形成板層狀或梭形且規(guī)則。術后12周，兩組動物骨缺損處均形成骨性連接，但髓外皮質尚未完全塑性，部分動物的髓腔未完全再通(見圖1)。A組及B組動物骨缺損區(qū)在不同時間點的平均骨痂灰度值見表1，A、B兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 傷后4、8、12周動物傷肢X線片觀察

表1 實驗動物骨缺損區(qū)域X線片平均骨痂灰度值

2.3 組織學觀察

術后第1天，A組挫傷區(qū)肌纖維大片壞死，部分區(qū)域組織僅見一些殘存的結締組織和少量肌組織碎片，伴有大量炎細胞浸潤，間質血管淤血，大量出血。震蕩區(qū)發(fā)生大片繼發(fā)性肌變性壞死，肌纖維排列紊亂，間質嚴重水腫、淤血，有中等量炎細胞浸潤，灶性出血。B組標本各區(qū)炎癥反應、水腫程度及范圍方面均較A組減輕。術后4周，A、B組均以纖維組織增生為主，未見明顯軟骨組織增生，偶見骨樣組織形成，可見少許血管增生。術后第8周，A、B兩組可見少量軟骨細胞，骨樣基質形成，未見不規(guī)則骨小梁。術后12周，A、B組少量成熟板層骨，不規(guī)則骨小梁形成，骨小梁窄細、稀少，部分髓腔內未見骨小梁。術后兩組成骨質量無明顯差別(圖2)。

HE染色×100

2.4 動物標本骨缺損區(qū)域MDA含量以及SOD活力測定

傷后1 d、3 d、7 d、2周、4周時，A組標本中MDA含量顯著高于B組，SOD活性顯著低于B組(P<0.05)；而在8、12周時，兩組標本中MDA含量及SOD活力無明顯差異(P>0.05)，見表2-3。

表2 兩組傷后骨缺損區(qū)域各時相點MDA含量比較(nmol/mg)

表3 兩組傷后骨缺損區(qū)域各時相點SOD活力比較(U/mg)

3 討論

由于特殊的作戰(zhàn)環(huán)境，參加海戰(zhàn)及登陸作戰(zhàn)的傷員在傷后常伴有長時間的海水浸泡。火器傷經(jīng)海水浸泡后，會明顯增加傷員的死亡率和致殘率，并對指戰(zhàn)員士氣造成重大影響，降低部隊的戰(zhàn)斗力，無法有效完成作戰(zhàn)任務，是后勤醫(yī)療保障部門必須重視和解決的難題[3]。

與淡水相比較，海水滲透壓高、含堿量高，同時攜帶多種細菌，是一種中等濃度的強電解質溶液[4]。損傷的機體經(jīng)海水浸泡后，可導致機體高滲性體液轉移，從而引起微循環(huán)供血的缺乏，組織如果出現(xiàn)缺血缺氧的狀態(tài)，氧自由基及超氧化物的聚集可誘發(fā)過氧化脂質反應[5]，產生大量炎癥細胞，刺激多種炎癥因子釋放，激活體內氧化應激系統(tǒng)，導致病情進一步發(fā)展，最終致受損組織周圍血管通透性增大，間質水腫，反復惡性循環(huán)、嚴重損傷機體組織[6,7]。根據(jù)研究表明，動物肢體被火器致傷、再經(jīng)海水浸泡后，機體組織受到的傷害會更加嚴重[8,9]。本實驗中的動物肢體火器傷浸泡于人工海水后，病理切片光鏡下觀察顯示，A、B兩組動物的患肢傷道周圍均出現(xiàn)原發(fā)傷道區(qū)、挫傷區(qū)及震蕩區(qū)，部分肌纖維斷裂，變性壞死，間質輕度水腫，血管淤血，各區(qū)均有不同程度的炎細胞浸潤。該結果與相關海水浸泡傷研究中組織損傷的表現(xiàn)一致[10,11]。

地塞米松具有抗炎、抗過敏等多種功能，在創(chuàng)傷后的自由基生成和脂質過氧化的抑制等方面得到了廣泛的應用[12-14]。地塞米松可以增加肺組織中PaO2的濃度，減輕肺組織的損害，并能抑制肺組織中SOD活性及TNF-α、IL-1β、IL-8的表達，從而降低肺組織中嗜酸性白細胞的侵襲和激活[15]；另一項研究顯示，地塞米松可減輕感染后大鼠肺組織的水腫，降低肺組織MDA含量、MPO活力、增強SOD活力、抑制自由基和脂質過氧化，從而減輕對小鼠的傷害，降低死亡率，證明了地塞米松具有抗炎癥的作用[16]。MDA是一種重要的脂質氧化產物，其作用機制是通過對線粒體呼吸鏈復合體和線粒體關鍵酶的合成，從而通過MDA的濃度來間接地反映細胞損傷。SOD是一種存在于生物體中的抗氧化金屬酶，能促進氧自由基的自由基歧化，產生氧和過氧化氫，SOD的活力是反映人體自由基代謝狀況的一個重要指標，對機體的氧化、抗氧化平衡有重要影響，SOD的水平可間接地反映機體對自由基的清除能力。本實驗中，傷后第1天，A組動物組織損傷嚴重，伴有大量炎細胞浸潤，間質嚴重水腫、淤血，炎癥反應明顯；B組經(jīng)地塞米松治療后，標本中可見炎癥反應、水腫程度及范圍方面均較A組減輕，同時傷后1 d、3 d、7 d、2周、4周時，A組標本中MDA高于B組，SOD活性低于B組。結果表明，在海水浸泡后，地塞米松在損傷早期確實能夠有效抑制火器傷導致的組織周圍炎癥反應，減輕過氧化脂質反應，保護損傷的機體組織，這與多數(shù)研究的結論相一致[17-19]；但是在傷后中遠期，影像學表現(xiàn)及骨缺損區(qū)域各時相點平均骨痂灰度值的比較證實，兩組動物傷后4～12周的骨缺損愈合程度并無明顯差異。組織學上，術后4周、8周、12周時，兩組成骨質量也無明顯差別；在8周和12周時，兩組標本中MDA含量及SOD活力也無明顯差異。以上結果表明，在傷后中遠期，地塞米松對于損傷組織的周圍炎癥抑制及緩解過氧化脂質反應作用并不明顯；而從骨缺損愈合的結果來看，地塞米松對于火器傷導致的骨缺損合并海水浸泡并無明顯促進愈合的作用。