核桃細菌性黑斑病病原分子鑒定及室內(nèi)藥劑篩選

李 亞 張珍蔭 肖 波 楊 斌 趙 寧,

（1. 西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650233；2. 玉龍縣林業(yè)和草原局，云南 麗江 674100；3. 重慶三峽農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶 萬州404100；4. 西南林業(yè)大學(xué)云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點實驗室，云南 昆明 650233）

核桃（Juglans regia），又稱胡桃，為胡桃科胡桃屬植物。其經(jīng)濟價值和食藥用價值在木本植物中有著不可忽視的作用，具有很大的發(fā)展?jié)摿桶l(fā)展優(yōu)勢[1]。核桃是云南省的支柱產(chǎn)業(yè)、特色產(chǎn)業(yè)和傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，全省16個地、州市，129個縣、市、區(qū)均有分布及栽培[2-3]。全省核桃種植面積達350.92萬hm2，產(chǎn)量約116萬t，產(chǎn)值318億元，種植面積、產(chǎn)量和產(chǎn)值均居全國首位[4]，其種植面積在全球也名列前茅。但是由于云南的自然條件和地勢較為復(fù)雜，以及種植管理方式的落后，導(dǎo)致全省各地核桃病害種類繁多[5-7]。據(jù)統(tǒng)計，截至2020年，全省核桃的病蟲害共有160余種，病害占67種。其中核桃細菌性黑斑病是危害云南核桃的主要病害之一，嚴重威脅著云南核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，影響了核桃的產(chǎn)值產(chǎn)量，制約著農(nóng)民增收致富。

核桃細菌性黑斑病是由細菌侵染引起的病害[8-9]，全省多地均有發(fā)生[10-11]。黑斑病主要危害核桃的果實，感病后導(dǎo)致核桃果實變黑、早落或腐爛[12-14]。陳善義等[15]研究發(fā)現(xiàn)黃單胞桿菌屬細菌（Xanthomonas campestris）是導(dǎo)致北京地區(qū)核桃患黑斑病的主要病原菌；王瀚等[16-17]研究表明致使隴南地區(qū)核桃患細菌性黑斑病病原菌是X.campestris和 成 團 泛 菌（Pantoea agglomerans）；張琴等[18]研究表明美國山核桃黑斑病為真菌病害，其病原菌為小孢擬盤多毛孢（Pestalotiopsis microspora）。肖波等[19]通過形態(tài)特征觀察和生理生化測定說明了云南地區(qū)核桃黑斑病的病原菌是黃單胞桿菌（X. arboricola）和成團泛菌。不同地區(qū)核桃黑斑病病原菌存在差異，弄清細菌性黑斑病的病原菌對于核桃黑斑病的防治具有重要意義，為開展防治工作提供一定的理論依據(jù)。瞿佳等[20]對陜西地區(qū)的核桃黑斑病防治進行了研究，發(fā)現(xiàn)中生菌素、噻霉酮等藥劑對核桃黑斑病具有較好的防治效果；武海斌等[21]對泰安市核桃園中核桃黑斑病的發(fā)生情況進行調(diào)查，針對不同時間的核桃病害發(fā)生情況設(shè)計了化學(xué)防治的用藥流程。

本研究采用分子生物學(xué)的方法進一步確定云南地區(qū)核桃細菌性黑斑病的病原，并利用牛津杯法篩選2種病原菌的防治藥劑，為云南核桃黑斑病的研究和防治工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試培養(yǎng)基

供試培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。

1.1.2 供試菌株

分離自患細菌性黑斑病的核桃，由西南林業(yè)大學(xué)生物化學(xué)教研室保存，病原菌株編號NO39、

NO119。

1.1.3 供試藥劑

10%苯醚甲環(huán)唑（上海禾本藥業(yè)），72%農(nóng)用鏈霉素（重慶豐化科技），3%噻霉酮（陜西西大華特科技），30%戊唑·多菌靈（深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司），16%苯甲·中生（深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司），72%百菌清（江蘇龍燈化學(xué)），33.5%咪鮮胺（江蘇明德主達作物科技），6%丙靈·多菌靈（貴州道無生物）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分子鑒定

將實驗室保藏的菌株NO39和NO119活化到LB培養(yǎng)基上，參照北京百泰克生物技術(shù)有限公司試劑盒的提取方法提取基因組DNA，采用細菌16S rDNA通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3）和1492R（5-TACGGCTACCTTGTT ACGACTT-3）進行PCR擴增[22]，PCR反應(yīng)體系（50 μL）：模板2 μL，2 ×TaqMaster Mix 25 μL，正反引物各1 μL，ddH2O補滿體系。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火90 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。將擴增產(chǎn)物進行電泳檢測后送往北京百泰克生物技術(shù)有限公司測序。將測序結(jié)果在Gen-Bank進行BLAST比對，選取同源性高的序列在MEGA 7.0中以Neighbor-Joining法進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.2 殺菌劑對病原菌的抑菌試驗

采用牛津杯法進行室內(nèi)藥劑篩選測定。將所選的藥劑使用牛津杯法進行初篩，篩選出對核桃細菌性黑斑病病原菌有抑制作用的藥劑，初篩后，將有效藥劑按高濃度到低濃度進行梯度稀釋，測定出有效藥劑對病原菌的半數(shù)有效濃度（EC50）。具體方法為：在制作好的LB培養(yǎng)基中加入300 μL菌懸液(108cfu/mL)，用涂布棒涂抹均勻。在已涂菌液的培養(yǎng)基上呈等邊三角形放置牛津杯，在其中2組中加入經(jīng)過濾膜處理的100 μL同一濃度的農(nóng)藥，另一組加入100 μL的無菌水做空白對照，每組做3個重復(fù)。放入28 ℃的培養(yǎng)箱中，采用十字交叉法測量抑菌圈的生長直徑并計算抑菌率[23]。

1.2.3 分析方法

采用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以藥劑濃度的對數(shù)值為橫坐標，抑制率的幾率值為縱坐標建立毒力回歸方程，得出相關(guān)系數(shù)R2以及EC50，并根據(jù)EC50進行抑菌效果評價分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃細菌性黑斑病病原菌的分子鑒定

將得到的2種病原菌提取其DNA進行PCR擴增后送往北京百泰克生物技術(shù)有限公司進行測序。將測序得到的片段在NCBI中進行BLAST比對，選取同源性高的序列在MEGA7.0中采用Neighbor-Joining法構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)Kimura 2-parameter法 計 算 遺 傳 距 離，以NJ法Bootstrap 1 000次后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。菌株NO39在NCBI中比對后，發(fā)現(xiàn)其16S rDNA序列與GenBank中的成團泛菌同源性高達99.93%，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1。由圖1可知，菌株NO39與4株成團泛菌聚在同一個節(jié)點，并且其可信度達到100%。而菌株NO119是黃單胞菌屬下的一種，由圖2可看出，菌株NO119與2株單胞桿菌在同一節(jié)點，雖然BLAST后其與X. campestris、X. oryzae的相似性也很高，但圖2可看出，其在發(fā)育過程中出現(xiàn)了分支，并且都與假單胞菌屬下的Pseudomonas aeruginosa保持著較遠距離。

圖 1 菌株NO39基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 NO39 phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

圖 2 菌株NO119基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 NO119 phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

綜上所述，可將菌株NO39確定為成團泛菌，菌株NO119確定為黃單胞桿菌，同時將2株細菌提交到NCBI中，得到菌株NO39的序列號為MH036307，菌株NO119的序列號為MG872816。

2.2 供試殺菌劑對2種病原菌的抑制效果

將8種供試藥劑使用牛津杯法進行初篩，通過判斷是否有抑菌圈產(chǎn)生分別篩選出對黃單胞桿菌和成團泛菌有抑制作用的藥物（表1）。結(jié)果在8種供試藥劑中，僅有72%農(nóng)用鏈霉素、16%苯甲·中生和3%噻霉酮3種藥劑有明顯抑菌圈產(chǎn)生，對成團泛菌有抑制作用。當72%農(nóng)用鏈霉素濃度為33.33 mg/mL時，抑菌率達到65.23%，而16%苯甲·中生和3%噻霉酮濃度為60 mg/mL時，抑菌率分別為46.09%和58.37%。

表 1 供試藥劑對兩種病原菌的抑制效果Table 1 The inhibitory effect of the test agent on 2 pathogens

而選用的8種殺菌劑中72%農(nóng)用鏈霉素、3%噻霉酮、33.5%咪鮮胺、30%戊唑·多菌靈、16%苯甲·中生和6%丙靈·多菌靈對黃單胞桿菌都有一定的抑制效果，60 mg/mL的3%噻霉酮對黃單胞桿菌的抑制率達到79.84%，72%的農(nóng)用鏈霉素對黃單胞桿菌的抑制率達到58.86%。不同的殺菌劑對黃單胞桿菌的抑菌效果存在一定差別，本研究選用對成團泛菌和黃單胞桿菌均有抑制作用的3種藥劑3%噻霉酮、72%農(nóng)用鏈霉素和16%苯甲·中生進行毒力測試。

2.3 有效殺菌劑對2種病原菌的毒力測定

以藥劑濃度的對數(shù)值為橫坐標，抑菌率的幾率值為縱坐標，計算出3種殺菌劑對成團泛菌的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和EC50值。從表2可以看出，篩選出的3種藥劑對核桃細菌性黑斑病病原菌成團泛菌都有一定的抑制作用，其中3%噻霉酮抑菌效果最好，濃度為0.94 mg/mL 時，抑菌率可達到46.67%，其EC50為3.89 mg/mL；其次是72%農(nóng)用鏈霉素，其EC50值為9.97 mg/mL；16%苯甲·中生抑制效果最差，EC50值為103.30 mg/mL。

表 2 3種藥劑對病原細菌成團泛菌的毒力比較Table 2 Comparison of virulence of 3 effective bactericide to P. agglomerans

續(xù)表 2

以藥劑濃度的對數(shù)值為橫坐標，抑菌率的幾率值為縱坐標，計算出3種殺菌劑對黃單胞桿菌的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和EC50值，結(jié)果見表3。由表3可知，72%農(nóng)用鏈霉素、3%噻霉酮和16%苯甲·中生3種藥劑對黃單胞桿菌都有一定的抑制作用，但不同的藥劑間抑制效果差異較大。3%噻霉酮對黃單胞桿菌的抑制效果最好，濃度為60 mg/mL時抑菌率達到81.18 %，其EC50值為4.93 mg/mL，其次是72%農(nóng)用鏈霉素，其EC50值為14.94 mg/mL，16%苯甲·中生對黃單胞桿菌的抑菌效果最差，其EC50值為67.03 mg/mL。

表 3 三種藥劑對病原細菌黃單胞桿菌的毒力比較Table 3 Comparison of virulence of 3 effective bactericide to X. arboricola

3 結(jié)論與討論

細菌性黑斑病是一種對核桃的果實、枝干和葉片都能產(chǎn)生嚴重影響的病害，本研究通過采用分子生物學(xué)的方法鑒定出云南地區(qū)核桃黑斑病的主要病原菌是黃單胞桿菌和成團泛菌，并且采用牛津杯法分別測定8種殺菌劑對成團泛菌和黃單胞桿菌的抑制作用，篩選出了3%噻霉酮、72%農(nóng)用鏈霉素、16%苯甲·中生3種藥物對成團泛菌和黃單胞桿菌均具有良好抑制作用。

篩選出對核桃細菌性黑斑病有防治作用的藥劑對核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有深遠的意義。已有多篇報道表明抗生素類藥劑對細菌性病害有較好的防治效果[24-25]，本研究篩選出的72%農(nóng)用鏈霉素對成團泛菌和黃單胞桿菌都有一定的抑制作用。孫俊[26]采用分光光度計法也說明農(nóng)用鏈霉素對核桃黑斑病的病原細菌有著較好的抑制作用，可用于生產(chǎn)實踐。王瀚等[27-28]通過使用抑菌圈法和平板菌落計數(shù)法得出農(nóng)用鏈霉素和百菌清對成團泛菌的防治有時間和劑量效應(yīng)，但在本研究中，百菌清對成團泛菌的抑制效果并不明顯。王琳瑩[29]研究發(fā)現(xiàn)咪鮮胺和甲基硫菌靈混合試劑對核桃黑斑病有較好的防治效果，而本研究中咪鮮胺對成團泛菌無抑制作用，可能是由于不同地區(qū)分離出的病原菌抗病性存在差異，王琳瑩研究的石棉縣核桃（NO.EF178448.1）與本研究中的成團泛菌雖然都屬于Pantoea agglomerans，但二者進化關(guān)系屬于不同分支。因此對于不同地區(qū)的核桃黑斑病防治應(yīng)因地制宜，結(jié)合當?shù)貙嶋H進行防治試驗。

不同地區(qū)核桃黑斑病的病原菌抗性有所不同，本研究篩選出的72%農(nóng)用鏈霉素和3%噻霉酮對云南核桃細菌性黑斑病病原菌有良好的抑制作用，可為云南地區(qū)核桃細菌性黑斑病的防治提供參考依據(jù)。