云南廣南天然蒜頭果可培養(yǎng)內(nèi)生及根際真菌多樣性分析

雷小鈴 潘 悅 張麗麗 王 明 陸成軍 李進寶 毛 平 王 娟

（1. 西南林業(yè)大學(xué)地理與生態(tài)旅游學(xué)院，云南 昆明 650233；2. 西南林業(yè)大學(xué)綠色發(fā)展研究院，云南 昆明 650233；3. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650233；4. 廣南縣林業(yè)與草原局，云南 廣南 653300）

蒜頭果（Malania oleifera）屬鐵青樹科蒜頭果屬，是我國特有單種屬古老植物，國家Ⅱ級珍稀瀕危保護樹種，云南省極小種群重點拯救保護對象[1]。蒜頭果種仁油中富含神經(jīng)酸，對提高腦神經(jīng)的活躍程度，防止腦神經(jīng)衰老有重要作用[2]，同時，蒜頭果種子中的油脂成分也是合成麝香酮的理想原料[3]。此外，蒜頭果也是石漠化治理的優(yōu)良樹種[4]，因此，該樹種具有重要的經(jīng)濟和生態(tài)價值。近年來，在云南省蒜頭果原產(chǎn)地不斷擴大規(guī)模進行人工種植，然而，其培育周期長，幼苗成活率和造林保存率較低[5]，相關(guān)研究表明[6]蒜頭果幼苗第3年造林保存率僅為24.6%。如何提高蒜頭果的種植存活率，縮短其生長周期，增強植株抗性，是蒜頭果產(chǎn)業(yè)發(fā)展迫切需要解決的問題。

植物的內(nèi)生、根際真菌不僅與其營養(yǎng)攝取、生長發(fā)育及存活率緊密相關(guān)，也對植物免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)起著重要作用。內(nèi)生真菌能增強植物對磷、鉀、鐵等營養(yǎng)元素的吸收[7-8]，產(chǎn)生生長調(diào)節(jié)劑，增強植株的水分利用率和光合效率，促進植物種子萌發(fā)、根系生長及生物量的增加[9-10]，同時，對多種病蟲害具有抑制效果[11-12]。根際有益真菌具有分解有機質(zhì)為植物提供養(yǎng)分的功能，同時可抑制病原菌，對土壤質(zhì)地和結(jié)構(gòu)的形成、土壤肥力的提高等具有重要作用[13]。

內(nèi)生真菌的種類和多樣性受多種因素的共同影響，包括宿主植物的種類、生長環(huán)境、生長年限、氣候條件（海拔、溫度、濕度）等[12]。王毅等[14]研究了廣南縣裸露石灰?guī)r山地和石灰?guī)r林地中蒜頭果不同器官的內(nèi)生真菌多樣性，結(jié)果表明石灰?guī)r林地蒜頭果根、葉的內(nèi)生真菌多樣性較裸露石灰?guī)r山地豐富，然而，與蒜頭果營養(yǎng)攝取和生長發(fā)育密切相關(guān)的根際真菌以及海拔對蒜頭果內(nèi)生、根際真菌的影響還鮮有報道。因此，本研究根據(jù)廣南縣天然蒜頭果的區(qū)域分布特點，選取并采集2個不同海拔石灰?guī)r林地以及1個裸露石灰?guī)r山地的健康蒜頭果植株及根際土壤進行內(nèi)生、根際真菌的分離、純化及種類鑒定，系統(tǒng)分析內(nèi)生真菌不同器官及根際真菌的多樣性，揭示高海拔與低海拔石灰?guī)r山地蒜頭果以及相同海拔條件下石灰?guī)r林地和裸露石灰?guī)r山地的蒜頭果內(nèi)生、根際真菌多樣性，為豐富蒜頭果微生物資源庫，探討生境對其真菌多樣性的影響，挖掘蒜頭果真菌資源的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年4月在文山州廣南縣天然蒜頭果集中分布區(qū)選取3塊樣地，包括石灰?guī)r林地和裸露石灰?guī)r山地（地理信息見表1），蒜頭果樹齡約為40年（胸徑：（11.9 ± 2.9）cm，樹高：（7.4 ±2.8）m，每塊樣地根據(jù)實際面積按照五點取樣法選取5株正常生長且無病害癥狀的蒜頭果植株，共計15株，取其根、莖、葉和根際土，用無菌自封袋密封編號后置于車載冰箱，帶回實驗室進行內(nèi)生及根際土壤真菌的分離、鑒定。

表 1 廣南縣蒜頭果采樣點地理信息Table 1 Geographic information of M. oleifera sampling points in Guangnan County

1.2 真菌的分離與培養(yǎng)

蒜頭果根、莖、葉用自來水沖洗干凈后進行超聲震蕩，然后將根、莖、葉用75%乙醇浸泡3 min，再分別用0.5%的次氯酸鈉溶液處理8、5 min和3 min，無菌水沖洗3遍后，通過漂洗液涂布法檢測表面消毒的效果[15]。將處理好的植物材料在超凈工作臺上自然風(fēng)干，剪成約0.5 cm × 0.5 cm的小塊，每皿5片接種于含鏈霉素（50 mg/μL）和 氨 芐 青 霉 素（50 mg/μL） 的PDA培 養(yǎng) 基 上（200克馬鈴薯，20克葡糖糖，10克瓊脂粉和1 000 mL蒸餾水），每樣品重復(fù)6皿，各30個組織塊，即每樣地每個部位（根、莖、葉）各取150個組織塊進行分離。

根際土樣品去除殘根、碎石等雜物后經(jīng)孔徑2 mm的篩網(wǎng)混勻過篩，按水土比9∶1的比例混合，加入適量玻璃珠，在150 r/min 轉(zhuǎn)速下震蕩30 min后靜置10 min。通過梯度稀釋法的預(yù)實驗結(jié)果[16]，最終選取10-3、10-4為最佳稀釋倍數(shù)，吸取100 μmol/L土壤懸浮上清液均勻涂布于PDA培養(yǎng)基，每稀釋倍數(shù)重復(fù)3次。

將上述培養(yǎng)皿在25℃恒溫箱中培養(yǎng)3～4 d。挑取菌落邊緣菌絲進行分離純化，并接種于PDA斜面于4℃下低溫保藏。

1.3 真菌的鑒定

將真菌菌株接種在PDA培養(yǎng)基黑暗培養(yǎng)7～10 d，根據(jù)菌落形態(tài)初步確定菌株種類。參照尿素提取法進行DNA提取[17]。選用引物ITS1F和ITS4對真菌ITS1-5.8S-ITS2基因片段進行PCR擴增[18-19]。經(jīng)電泳檢測擴增結(jié)果后將PCR產(chǎn)物送昆明碩擎生物科技有限公司測序。獲得的序列經(jīng)CExpress軟件雙向拼接后與GenBank上的已知序列進行比對。選取參考序列與代表菌株的結(jié)果序列經(jīng)ClustalX18.1對齊后，在MEGA6.0手動校對，并通過鄰接法（Neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 分析方法

真菌的分離頻率（SF）是衡量蒜頭果中某種（或某屬）真菌的優(yōu)勢度[15]，即分離頻率（%）= 分離到某種（某屬）真菌的菌株數(shù)/分離到的菌株總數(shù)。其中SF ≥ 10%為優(yōu)勢種（屬），SF ≥ 1%為常見種（屬），SF ＜ 1%的為稀有種（屬）[20]。

式中：Pi=Ni/N，Ni為第i個種（屬）數(shù)的個體數(shù)；N為所有種（屬）數(shù)的個體數(shù)；S為種（屬）數(shù)。

相似性系數(shù)（SC）：SC = 2j/(a+b)，描述2個樣本間真菌物種組成的相似程度。其中，j為2個樣本共同的真菌種（屬）數(shù)，a和b分別為不同樣本內(nèi)的真菌種（屬）數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒜頭果內(nèi)生、根際土壤真菌種類組成

3個樣地共分離獲得真菌276株，其中，內(nèi)生真菌218株，根際土壤真菌58株，經(jīng)ITS序列鑒定，分屬3門8綱35個屬（圖1）。其中優(yōu)勢菌屬為木霉屬（Trichoderma），間座殼屬（Diaporthe）和鐮孢屬（Fusarium），分離頻率分別為24.28%、13.04%和10.15%，常見屬為擬莖點霉屬（Phomopsis）、葉點霉屬（Phyllosticta）、青霉屬（Penicillium）、藍狀菌屬（Talaromyces）、新殼梭孢屬（Neofusicoccum）、黑孢霉屬（Nigrospora）、鏈格孢屬（Alternaria）、炭皮菌 屬（Biscogniauxia）、炭 疽 菌 屬（Colletotrichum）、葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）、炭角菌屬（Xylaria）、裂褶菌屬（Schizophyllum）、耙菌屬（Irpex）以及附毛菌屬（Trichaptum），余下18個屬為稀有屬（表2）。

2.2 不同器官蒜頭果內(nèi)生、根際真菌的群落組成

從蒜頭果不同器官內(nèi)生及根際真菌中分離出共有菌屬8個，分別為木霉屬、間座殼屬、鐮孢屬、擬莖點霉屬、炭皮菌屬、炭疽菌屬、新殼梭孢屬和青霉屬，表明蒜頭果內(nèi)生與根際真菌的群落組成存在一定聯(lián)系。同時，不同器官內(nèi)生及根際真菌種類和數(shù)量間存在明顯差異。其中，莖部分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量及種類最多，為93株，分屬23個屬；其次是葉部分離到74株23個屬，根部最少，僅分離到51株20個屬，而根際土壤中分離出真菌58株20個屬，其中特有屬1種，為球座菌屬（Guignardia）（圖2）。

圖 2 蒜頭果內(nèi)生、根際真菌屬級水平的菌群組成Fig. 2 Community composition of endophytic and rhizosphere fungi at genus level in M. oleifera

表 2 蒜頭果內(nèi)生、根際真菌分離頻率Table 2 Isolation frequency of endophytic and rhizosphere fungi in M. oleifera

圖 1 基于ITS序列構(gòu)建的蒜頭果內(nèi)生、根際土壤真菌代表菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of representative strains of endophytic and rhizosphere soil fungi in M. oleifera based on ITS sequences

續(xù)表 2

2.3 不同器官蒜頭果內(nèi)生、根際真菌的多樣性分析

由表3可知，蒜頭果不同器官及根際土的真菌多樣性差異顯著。其中莖部的內(nèi)生真菌多樣性、均勻度及豐富度指數(shù)為2.973、0.935和5.879，高于其他部位，根際真菌的優(yōu)勢度指數(shù)最高，為0.116。相似性系數(shù)表明，根部內(nèi)生菌與根際真菌相似性系數(shù)最高，為0.654，與葉部內(nèi)生菌相似度最低（SC = 0.5）（表4）。

表 3 蒜頭果不同器官內(nèi)生真菌及根際土壤真菌多樣性指數(shù)Table 3 Diversity index of endophytic fungi from different organ and rhizosphere soil fungi in M. oleifera

表 4 蒜頭果不同器官內(nèi)生真菌及根際土壤真菌相似性系數(shù)Table 4 Similarity coefficients of endophytic fungi from different issues and rhizosphere soil fungi in M. oleifera

2.4 不同生境蒜頭果內(nèi)生、根際土壤真菌的群落組成

2.4.1 相同同海拔下的群落組成

在相同海拔下，裸露石灰?guī)r山地（DY）分離到蒜頭果內(nèi)生、根際真菌112株，分屬30個屬，而石灰?guī)r林地（DB）分離到99株，包括24個菌屬，其中木霉屬和間座殼屬為2個樣地共有的優(yōu)勢菌屬，且石灰?guī)r林地中分離到的屬在裸露石灰?guī)r山地中均有出現(xiàn)（圖3），表明二者的菌群結(jié)構(gòu)具有一定的相似性。相較石灰?guī)r林地，裸露石灰?guī)r山地還分離出6個特有屬，分別為木腐菌屬，擬多隔孢屬，白腐菌屬， 傘狀霉屬，小貝氏孢屬和光柱擔(dān)菌屬，由此表明同海拔下，裸露石灰?guī)r山地（DY）的蒜頭果內(nèi)生、根際真菌種類和數(shù)量較石灰?guī)r林地（DB）豐富。

圖 3 相同海拔下裸露石灰?guī)r山地和石灰?guī)r林地蒜頭果內(nèi)生、根際真菌的群落組成Fig. 3 Community composition of endophytic and rhizosphere fungi of M. oleifera in bare limestone mountains and limestone woodlands at the same altitude

2.4.2 不同海拔下的群落組成

通過廣南縣天然蒜頭果資源調(diào)查，該植株主要 分 布在 海 拔1 200～1 500 m的區(qū)域[21]，因 此，本研究將董堡鄉(xiāng)八角山樣地（海拔1 175 m）設(shè)定為低海拔石灰?guī)r林地，而南坪鎮(zhèn)莊科村樣地（海拔1 435 m）設(shè)定為高海拔石灰?guī)r林地。低海拔石灰?guī)r林地（DB）中分離到蒜頭果內(nèi)生、根際真菌99株，分屬24個屬；高海拔石灰?guī)r林地（NZ）分離到65株，19個屬。2個樣地共有屬為12種，與此同時，均分離到一些特有菌屬，其中低海拔石灰?guī)r林地分離到12個特有屬，分別為：金色毛殼菌屬，曲霉屬，藍狀菌屬，炭團菌屬，可可毛色二孢屬，炭層菌屬，葡萄座腔菌屬，新擬盤多毛孢屬，裂褶菌屬，附毛菌屬，耙菌屬和盤菌屬；高海拔石灰?guī)r林地分離到7個特有屬，分別為：木霉菌屬，小脆柄菇屬，Dactylonectria，黃癬菌屬，無柄盤菌屬，球座菌屬和傘狀霉屬。由此表明，2個樣地的菌群結(jié)構(gòu)差異較大，低海拔石灰?guī)r林地（DB）的蒜頭果內(nèi)生、根際真菌種類和數(shù)量較高海拔林地（NZ）豐富（圖4）。

圖 4 不同海拔下石灰?guī)r林地蒜頭果內(nèi)生、根際真菌的群落組成Fig. 4 Community composition of endophytic and rhizosphere fungi of M. oleifera in limestone woodland at different altitudes

2.5 不同生境下蒜頭果內(nèi)生、根際真菌多樣性分析

通過比較不同生境下蒜頭果的內(nèi)生、根際真菌多樣性，結(jié)果表明，裸露石灰?guī)r山地（DY）的蒜頭果內(nèi)生、根際真菌多樣性指數(shù)與豐富度指數(shù)分別為2.727和6.123，較2個石灰?guī)r林地高，3個樣地由高到低的順序為裸露石灰?guī)r山地DY ＞低海拔石灰?guī)r林地DB ＞ 高海拔石灰?guī)r林地（NZ）；而辛普森優(yōu)勢度指數(shù)和均勻度指數(shù)則相反（表5）。此外，不同樣地間蒜頭果內(nèi)生、根際真菌的菌群相似性存在明顯差異，其中裸露石灰?guī)r山地（DY）和低海拔石灰?guī)r林地（DB）的菌群相似性最高，為0.8，而低海拔石灰?guī)r林地（DB）和高海拔石灰?guī)r林地（NZ）的菌群相似性最低（SC = 0.433）（表6）。

表 5 蒜頭果3個樣地內(nèi)生、根際真菌多樣性Table 5 Diversity of endophytic and rhizosphere Fungi of M. oleifera in 3 plots

表 6 蒜頭果3個樣地內(nèi)生、根際真菌的相似性系數(shù)Table 6 Similarity coefficients of endophytic and rhizosphere fungi of M. oleifera in 3 plots

3 結(jié)論與討論

本研究從廣南縣天然蒜頭果3個不同生境分離到內(nèi)生、根際真菌276株，涉及4個門9個綱34個屬，表明該地蒜頭果內(nèi)生、根際真菌數(shù)量和種類較為豐富。王毅等[14]從廣南縣蒜頭果的根、樹皮及葉組織中分離獲得112株內(nèi)生真菌，其中紫霉屬（Purpureocillium）、酵母樣菌屬（Acaromyces）、木霉屬為優(yōu)勢菌屬。本研究中除分離獲得大量木霉屬菌株外，未分離到紫霉屬和酵母樣菌屬真菌，這可能與采集年份、樣地及樹齡差異等因素有關(guān)[22-24]。本研究結(jié)果顯示木霉屬、間座殼屬、擬莖點霉屬、青霉屬和鐮孢屬真菌在3個樣地中分離頻率較高。其中木霉屬真菌普遍被認為能促進植物根系生長、種子萌發(fā)以及磷的吸收[7]，還能分泌多種有機酸并通過碳源的新陳代謝溶解礦物質(zhì)，起到土壤修復(fù)的作用[25]。而且木霉和青霉是重要的生防菌，能抑制多種病害尤其是土傳病害的侵染[26-27]，因此具有重要的研究開發(fā)價值。在研究中分離得到的座殼屬、擬莖點霉屬和鐮孢屬真菌中的大部分種類被認為是植物病原真菌[28-29]，但也有一些種類能產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物對病蟲害起到控制作用，因此認為宿主植物與內(nèi)生真菌間存在一種動態(tài)的平衡關(guān)系[30]。但不同的真菌種類在蒜頭果中發(fā)揮怎樣的生態(tài)學(xué)作用還有待進一步研究。

本研究中，蒜頭果莖部分離到的內(nèi)生真菌多樣性和豐富度指數(shù)最高，王毅等雖然僅分離莖部樹皮的內(nèi)生真菌，但結(jié)果顯示無論是石灰?guī)r林地還是裸露石灰?guī)r山地，蒜頭果樹皮分離的內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)高于根和葉部，與本研究的結(jié)論相似。根際土與根部菌群組成相似度較高，原因可能是根際土與根在長期互作中根際真菌選擇性地進入植物根部[31]。而葉與根的相似度較低，可能與2種器官中內(nèi)生真菌的來源不同有關(guān)。與紫莖澤蘭葉和根的內(nèi)生真菌相似度研究結(jié)果一致，被認為與葉部的內(nèi)生真菌可能源自于空氣，而根部內(nèi)生菌主要來源與土壤有關(guān)[32]，這可能也是蒜頭果地上和地下器官中菌群組成差異較大的原因，但蒜頭果地上和地下部器官中的真菌來源還有待進一步研究證實。

影響植物內(nèi)生、根際真菌的環(huán)境因素較多，如溫度、濕度、海拔、土壤、光照、大氣組成和采樣季節(jié)等[12]。本研究中，相同海拔條件下，裸露石灰?guī)r山地（DY）與石灰?guī)r林地（DB）的蒜頭果內(nèi)生、根際真菌群落結(jié)構(gòu)具有一定的相似性，但生長于裸露石灰?guī)r山地的蒜頭果內(nèi)生、根際真菌種類及數(shù)量均較石灰?guī)r林地豐富，原因可能與二者的土壤性質(zhì)有一定關(guān)系，研究表明，蒜頭果喜含鈣量較高的土質(zhì)[6]，下步可結(jié)合蒜頭果這一特性分析土壤含鈣量與其內(nèi)生、根際真菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系。王毅等研究表明，蒜頭果石灰?guī)r山地和裸露石灰?guī)r林地中樹皮的真菌多樣性相似，而根和葉的多樣性均為石灰?guī)r林地高于裸露石灰?guī)r山地[14]。與本研究結(jié)果有所不同，原因分析其一可能是采樣地不一樣，前者的采樣點位于舊莫鄉(xiāng)的安勒村（裸露石灰?guī)r山地）和巖臘村（石灰?guī)r林地），由于文中未提及海拔和樹齡信息無法進一步開展比較分析；其二可能是內(nèi)生真菌分離樣本數(shù)量的差異。此外，項目組對人工種植蒜頭果開展內(nèi)生、根際真菌的研究中發(fā)現(xiàn)裸露石灰?guī)r純林的蒜頭果內(nèi)生、根際真菌群落組成較石灰?guī)r純林豐富。相同的石灰?guī)r林地生境中，低海拔分布的蒜頭果內(nèi)生、根際真菌的種類及數(shù)量較高海拔豐富，且兩者差異較大，原因可能是低海拔石灰?guī)r林地溫度適宜、植被豐富、土壤養(yǎng)分充足，由此導(dǎo)致植物內(nèi)生、根際真菌的群落多樣性更為豐富，這與Shen等對長白山苔原沿海拔梯度升高其內(nèi)生真菌多樣性逐漸遞減的規(guī)律相符[33]。

蒜頭果不同生境間內(nèi)生、根際真菌多樣性指數(shù)與豐富度指數(shù)由高到低分別為裸露石灰?guī)r山地（DY）＞ 低海拔石灰?guī)r林地（DB）＞ 高海拔石灰?guī)r林地（NZ）；而辛普森優(yōu)勢度指數(shù)和均勻度指數(shù)則相反，由此表明，裸露石灰?guī)r山地（DY）的蒜頭果內(nèi)生、根際真菌群落更為豐富，高海拔石灰?guī)r林地（NZ）的單菌屬優(yōu)勢突出，菌落結(jié)構(gòu)較為單一，因而均勻度指數(shù)高。

目前通過菌落形態(tài)和ITS基因片段，僅能將大部分蒜頭果內(nèi)生、根際土壤真菌鑒定到屬級水平，下一步將針對有益優(yōu)勢菌屬，聯(lián)合分子條形碼技術(shù)和微觀形態(tài)學(xué)特征確定菌株種類，并開展促生功能篩選研究，為蒜頭果微生物資源利用奠定基礎(chǔ)。