亞硝酸鹽對氨水法測定碳氧血紅蛋白的影響

王 樂，劉 捷，丁 斌，張瑞先，關(guān)江玲，滕漢飛，柴盼盼

（1.南京森林警察學(xué)院，南京 210023； 2.云南大學(xué)，昆明 650500；3.蘭州鐵路公安處刑事技術(shù)支隊， 蘭州 730030；4.甘肅省公安廳刑偵局，蘭州 730030；5.甘肅省第三人民醫(yī)院，蘭州 730030）

一氧化碳為常見含碳物質(zhì)燃燒不充分時產(chǎn)生，是一種無色無味、不溶于水的有毒氣體[1]。由于一氧化碳與血紅蛋白結(jié)合能力強于氧氣，故人體在吸入一氧化碳后，會部分失去攜氧能力，造成身體缺氧而中毒。一氧化碳中毒的程度決定于血液中碳氧血紅蛋白的飽和程度，機(jī)體對一氧化碳的耐受性有很大差異，甚至同時中毒者可表現(xiàn)出不同程度的癥狀。由于我國北方冬季取暖期較長，屋內(nèi)生活取暖時煤層等燃料不完全燃燒，造成中毒案事件時有發(fā)生。

硝酸鹽和亞硝酸鹽是自然界中最普遍的含氮化合物，廣泛存在于人們?nèi)粘Ｉ瞽h(huán)境中。人體內(nèi)硝酸鹽在微生物的作用下可還原為亞硝酸鹽、N-亞硝基化合物的前體物質(zhì)。由于常見亞硝酸鹽外觀及味道都與食用鹽相似，多年來，常有誤將亞硝酸鹽當(dāng)作食用鹽、白砂糖、食用堿等使用而中毒的案事件。我國北方各省群眾在漫長的冬季有食用腌菜等腌制品的習(xí)慣，而許多蔬菜，如小白菜等能從土壤中富集硝酸鹽。當(dāng)以這些蔬菜為原料腌制或保存不好腐爛變質(zhì)及長時間溫水燜煮時，在大腸桿菌、沙門氏菌等硝酸鹽還原菌作用下，蔬菜中富集的硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽；有的地方會直接使用亞硝酸鹽含量較高的苦井水腌制食品。食品工業(yè)中也允許亞硝酸鹽作為防腐劑限量使用[2]，不法商家用亞硝酸鈉拌肉餡冒充純瘦肉掩蓋肥肉色澤[3]。過量進(jìn)食含亞硝酸鹽較多的食物或食用了腐爛變質(zhì)的蔬菜、肉制品，造成亞硝酸鹽中毒案事件也常有發(fā)生。

在北方漫長的冬季，多地群眾有生火取暖及食用腌菜的習(xí)慣，使得一氧化碳與亞硝酸鹽共存的機(jī)會增大，在多起案事件現(xiàn)場中均發(fā)現(xiàn)了同時出現(xiàn)腌制食品和一氧化碳的情況，亞硝酸鹽能阻止正常氧合血紅蛋白釋放氧氣，使組織出現(xiàn)缺氧現(xiàn)象[4]，一氧化碳也會造成組織缺氧，由于很多現(xiàn)場毒物濃度低，尸體征象不明顯，利用尸表判斷此類案事件真實的中毒原因存在困難。同時由于亞硝酸鹽的存在會對廣泛使用的氨水法測定碳氧血紅蛋白的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，對案事件的性質(zhì)準(zhǔn)確判定也產(chǎn)生較大困擾。

針對此類問題，本文考察了亞硝酸鹽對氨水法測定碳氧血紅蛋白含量的影響并探究機(jī)理，為食源性亞硝酸鹽及碳氧血紅蛋白相關(guān)的中毒案事件提供中毒原因分析的科學(xué)依據(jù)，為此類案事件的定性以及檢驗鑒定工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Agilent Cary 5000紫外-近紅外-可見分光光度計（美國Agilent Technologies）；Brand Transferpette移液器（德國Brand）；亞硝酸鈉（分析純，中國光復(fù)試劑），氨水（色譜純，中國科密歐試劑），超純水，一氧化碳中毒者血樣及陰性血樣（來自于實際案件）。

1.2 原理

碳氧血紅蛋白與氧合血紅蛋白對光譜有不同的特征吸收，氧合血紅蛋白在589～577 nm、556～536 nm區(qū)間有兩條吸收譜帶，其中于579、542 nm處有最大吸收，碳氧血紅蛋白在579～564 nm、548～530 nm區(qū)間有兩條吸收譜帶，其中于572、539 nm處有最大吸收[5]。用0.5%的氨水稀釋后的一氧化碳中毒案件檢材血在529、582 nm處有吸收峰，稀釋液做參比，利用經(jīng)驗公式測定含量：

1.3 前處理與方法

保持環(huán)境恒溫[6]，取混勻后的檢材血少許，充分溶于0.5%的氨水中，并使溶液在529、582 nm處的吸光度始終處于0.4～0.6之間，備檢。

實驗一：選取多組由陰性及不同含量碳氧血紅蛋白檢材血樣組成的系列，系列中各檢材血樣平行測定三組后得其碳氧血紅蛋白含量均值。

實驗二：分別向?qū)嶒炓恢袡z材血樣中加入不同濃度的亞硝酸鈉，使其含量分別為0.05、0.1、0.2 mg/mL （口服亞硝酸鹽1～2 g可致死[5]，根據(jù)一般身材成年人體內(nèi)血液容量換算亞硝酸鈉中毒致死時血液濃度約為0.2～0.25 mg/mL）后按照氨水法進(jìn)行碳氧血紅蛋白定性定量測定。

實驗三：對實驗二中測定所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后再選取不同含量碳氧血紅蛋白檢材血樣組成的系列，每份血樣取2 mL，分別加入亞硝酸鈉后混勻，使其中亞硝酸鈉濃度為0.25 mg/mL（以70 kg體重人體為準(zhǔn)，致死血液濃度約為0.25 mg/mL）后仍然正常進(jìn)行氨水法的碳氧血紅蛋白定性定量測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

由圖1可以看出，陰性檢材血樣譜圖中529 nm處吸光度（碳氧血紅蛋白量）低于582 nm處吸光度（氧合血紅蛋白量），經(jīng)過經(jīng)驗公式計算后結(jié)果為負(fù)值，即陰性結(jié)果；陽性檢血譜圖中529 nm處吸光度高于582 nm處吸光度，即陽性結(jié)果，并經(jīng)過經(jīng)驗公式可準(zhǔn)確計算結(jié)果；應(yīng)為負(fù)值的陰性檢血加入亞硝酸鈉后譜圖中529 nm處吸光度明顯高于582 nm處吸光度，經(jīng)過經(jīng)驗公式計算后結(jié)果為正值，即出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

由圖2可以發(fā)現(xiàn)，添加了不同量亞硝酸鈉的陰性檢材血樣，其582 nm處吸光度即氧合血紅蛋白量會隨著亞硝酸鈉的量增大而同步降低，其吸光度會逐步低于529 nm處碳氧血紅蛋白吸光度。此時無論是譜圖，還是經(jīng)過計算，結(jié)果均趨同于碳氧血紅蛋白血譜圖，結(jié)果也為正值，且該值隨著亞硝酸鈉量的增加而增大，即會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。經(jīng)過對多個（n＞100）來自不同個體的檢材血樣的實驗測定，由于個體差異的原因，雖然假陽性的定量值與亞硝酸鈉的含量在一定范圍內(nèi)存在正相趨同，但是能夠引起假陽性的亞硝酸鈉的含量及亞硝酸鈉增大到碳氧血紅蛋白定量值不再增大時的含量，各不相同，并未顯示有較為明顯的閾值。

對于陽性檢材血樣的影響，由圖3可以發(fā)現(xiàn)，也具有與陰性檢材血樣相同的影響趨勢，同樣由于個體差異的原因，產(chǎn)生影響的亞硝酸鈉的量未發(fā)現(xiàn)有明顯的閾值。

圖1 陰性、陽性及假陽性碳氧血紅蛋白光譜圖Fig. 1 Carboxyhemoglobin’s spectra shown as the negative, positive and false positive conditions

圖2 陰性及添加不同含量亞硝酸鈉后假陽性碳氧血紅蛋白 光譜圖Fig. 2 Carboxyhemoglobin’s spectra shown as the negative and false positive with addition of content-different sodium nitrite

圖3 陽性及添加不同含量亞硝酸鈉后碳氧血紅蛋白光譜圖（HbCO%＝45.9%）Fig. 3 Carboxyhemoglobin’s spectra shown as the normal positive and positive with addition of content-different sodium nitrite (HbCO%=45.9%)

選擇添加致死量的亞硝酸鈉的檢材血樣，經(jīng)過多組不同系列濃度重復(fù)測定后，選取的各系列濃度檢材血樣碳氧血紅蛋白含量實際值及經(jīng)亞硝酸鹽干擾后的值如表1所示。

表1 碳氧血紅蛋白含量測定結(jié)果Table 1 Contents of carboxyhemoglobin determined

由以上結(jié)果可以得出：

1）用氨水法進(jìn)行測定時，血液中一定濃度亞硝酸鹽的存在可導(dǎo)致不含碳氧血紅蛋白的正常血在碳氧血紅蛋白測定時結(jié)果為陽性，即陰性血被誤判為陽性；雖以致死量上限作為添加量進(jìn)行了驗證，但經(jīng)過實驗可知：血液中不同含量的亞硝酸鹽濃度對這種假陽性的影響程度不同，且個體差異較大。經(jīng)過抽樣測定（n＞100），總體來說，呈現(xiàn)的規(guī)律為：極低濃度的亞硝酸鹽并不會導(dǎo)致假陽性，而能夠?qū)е轮卸镜膩喯跛猁}濃度則一定會在測定時出現(xiàn)碳氧血紅蛋白測定假陽性；假陽性的定量值也受到亞硝酸鹽濃度的影響，呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，但由于個體差異的不同，并未發(fā)現(xiàn)有具體的量化趨勢。

2）用氨水法進(jìn)行測定時，血液中亞硝酸鹽的存在會導(dǎo)致碳氧血紅蛋白含量較低的檢材血樣中所測得的碳氧血紅蛋白含量顯著增大，增大后的含量接近50%，而碳氧血紅蛋白含量較高的血樣中碳氧血紅蛋白含量測定值則改變較為輕微，并有略微降低的情況出現(xiàn)，如圖4所示。

圖4 加入亞硝酸鈉后碳氧血紅蛋白測定值變化圖Fig. 4 The changing values of determined carboxyhemoglobin with addition of sodium nitrite

2.2 討論

血液中一定量亞硝酸鹽的存在將導(dǎo)致氨水法測定碳氧血紅蛋白時出現(xiàn)假陽性或低含量陽性檢材血樣中碳氧血紅蛋白含量測定值增大，增大原因為氨水法測定碳氧血紅蛋白含量時是以529 nm波長處碳氧血紅蛋白的吸光度減去582 nm處氧合血紅蛋白的吸光度進(jìn)行計算。而亞硝酸鹽存在時，在其作用下氧合血紅蛋白含量會減少，造成582 nm處吸光度降低，從而出現(xiàn)假陽性或測定值增大的結(jié)果。然而高含量陽性檢材由于碳氧血紅蛋白含量較高，中毒劑量的亞硝酸鹽雖然可以使其中氧合血紅蛋白的含量減少，但減少的幅度并不足以引起碳氧血紅蛋白含量測定值的較大變化。

3 結(jié)論

本文對血液中亞硝酸鹽的存在對氨水法測定碳氧血紅蛋白的影響進(jìn)行研究。通過實驗分析，亞硝酸鹽的存在會造成碳氧血紅蛋白含量測定時出現(xiàn)假陽性或低含量陽性檢血中碳氧血紅蛋白測定值增大的現(xiàn)象。在實際案件檢驗中，當(dāng)陽性碳氧血紅蛋白檢血中含有較高濃度的亞硝酸鹽時，血液自身的顏色會呈現(xiàn)出較為明顯的亞硝酸鹽中毒所具有的醬油色，雖然會與腐敗血有所類似，但仍然較易從顏色上進(jìn)行區(qū)分。然而當(dāng)亞硝酸鹽濃度較低時，對二者的區(qū)分則比較困難。此時氨水法作為判定一氧化碳中毒普遍使用的檢驗方法，在使用時亞硝酸鹽可能導(dǎo)致的假陽性及含量增大的情況應(yīng)引起足夠的重視，并主動加以分辨，進(jìn)一步進(jìn)行亞硝酸鹽的確認(rèn)與排除，防止誤判。同時，在案件檢驗中，對于現(xiàn)場出現(xiàn)的其他有具有類似性質(zhì)并可能產(chǎn)生類似影響的物質(zhì)，在使用該法測定碳氧血紅蛋白時也應(yīng)加以注意，進(jìn)行分析排除。