ITGA2表達增加與胰腺癌的進展和預后不良相關研究

呂朝旭，史 愷

(攀枝花學院 基礎醫(yī)學院，四川 攀枝花 617000)

胰腺癌是最常見的致死性癌癥之一，其惡性程度高、治療效果差，對全世界居民健康及生活質(zhì)量都造成了嚴重危害。在全球，因癌癥導致的死亡率中，胰腺癌排名第四位。據(jù)統(tǒng)計，2019年有56 770例胰腺癌患者被確診，其中約 45750 名患者死于胰腺癌[1]。2013年簽署的頑固性癌癥研究法案預估到2030年，胰腺癌將成為僅次于肺癌的第二大致死性癌癥[2]。對于胰腺癌患者來說，及時的手術治療及相應的輔助化療對于患者預后的恢復至關重要，而超過80%的胰腺癌患者由于確診時間晚，腫瘤細胞已發(fā)生晚期轉(zhuǎn)移而不適合手術治療[3]。晚期診斷、早期轉(zhuǎn)移和不同程度的藥物抵抗是胰腺癌死亡的三個主要原因[4]。

由于早期胰腺癌沒有特異性癥狀及敏感和特異性的腫瘤標志物，因此超過一半以上的胰腺癌患者被診斷時已經(jīng)處于晚期轉(zhuǎn)移階段[5]。從整體上來說胰腺癌患者的五年生存率低于9%，而晚期患者的五年生存率降至3%[4，6]。胰腺導管上皮內(nèi)瘤變是胰腺癌最常見的前驅(qū)病變。雖然及時發(fā)現(xiàn)胰腺癌的前驅(qū)病變可能對患者的診斷及治療有很大幫助，但如何盡早發(fā)現(xiàn)胰腺癌的前驅(qū)病變對于目前的技術來說仍然是一個很大的挑戰(zhàn)。手術切除是目前已知的胰腺癌唯一的根治性治療方案，但未根治性切除的患者總體5年生存率仍低于5%。統(tǒng)計結(jié)果表明，80%～90%的胰腺癌患者在診斷時患有無法切除的腫瘤[7]。此外，胰腺癌對許多傳統(tǒng)的化療藥物具有抗藥性，這些因素使胰腺癌成為嚴重危害人類健康的疾病之一。因此，早期診斷和檢測胰腺癌的前驅(qū)病變或?qū)ふ倚碌奶禺愋阅[瘤生物標志物并找到及時干預是降低胰腺癌發(fā)病率和死亡率的有效的方法[8]。胰腺癌被認為是一種具有高度遺傳變異性的疾病，其中包含一些核心基因表達改變[9]。生物信息學分析是目前找出癌癥發(fā)生發(fā)展過程中關鍵基因的有效方法。

整聯(lián)蛋白是由α和β亞基組成的異二聚體跨膜受體。據(jù)報道，整合素通過將信號分子和銜接蛋白募集到β亞基，有助于調(diào)節(jié)細胞存活、運動、增殖、粘附、遷移和癌癥治療抗性[10-11]。整合素α2是整聯(lián)蛋白的α亞單位之一，廣泛表達于成纖維細胞、內(nèi)皮細胞及上皮細胞當中。編碼整合素α2蛋白的基因位于5號染色體上，該蛋白由1181個氨基酸組成，作為細胞粘附分子，ITGA2通過與β1亞基非共價結(jié)合形成整聯(lián)蛋白異二聚體，是層粘連蛋白、膠原蛋白、纖連蛋白和E-鈣粘蛋白的受體，負責血小板和其他細胞與膠原蛋白的粘附。ITGA2的異常表達與癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移具有顯著相關性，包括乳腺癌[12-14]、腸道腫瘤[15]、結(jié)直腸癌[16-17]、胃癌[18]、前列腺癌[19]等。但ITGA2的功能存在爭議，在不同癌癥中充當抑癌基因或癌基因。Anuratha 和 Oliver M.Sieber 揭示 PHLDA1 在腸道腫瘤中作為癌基因發(fā)揮作用，部分是通過調(diào)節(jié) ITGA2 表達水平介導的，然后促進結(jié)腸癌細胞的遷移和增殖[15]。Xu T研究結(jié)果表明ITGA2 促進肢端黑色素瘤進展并與肢端黑色素瘤患者的臨床預后結(jié)果相關20。作為 HMGA2-FOXL2 通路的下游效應分子，ITGA2 在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移中增加，這與胃癌患者的總體生存時間縮短有關[18]。以上的研究結(jié)果都表明ITGA2在癌癥中充當癌基因的角色。而 Ramirez 表明整合素 α2β1 可抑制人類乳腺癌中的乳腺腫瘤[21]。到目前為止，ITGA2 在胰腺癌中的作用及預后尚不清楚。因此，本研究的目的是根據(jù)從 TCGA 和 ICGC 數(shù)據(jù)庫獲得的胰腺癌表達數(shù)據(jù)及相應的臨床數(shù)據(jù)來評估 IFGA2 表達在胰腺癌中的角色以及其對胰腺癌預后的關系。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與統(tǒng)計分析

分別從TCGA數(shù)據(jù)庫、GTEx和ICGC數(shù)據(jù)庫中獲得了胰腺組織的mRNA基因表達數(shù)據(jù)，其中TCGA數(shù)據(jù)庫中包含178個腫瘤組織表達數(shù)據(jù)和4個正常樣本的表達數(shù)據(jù)，GTEx中包含167個正常的胰腺組織表達數(shù)據(jù)，ICGC數(shù)據(jù)庫中包含84個腫瘤組織表達數(shù)據(jù)。同時下載了TCGA和ICGC中胰腺癌患者的相應臨床信息，包括性別、年齡、分級、分期等信息以便進一步的數(shù)據(jù)分析。在分析過程中，一些臨床信息不完整的樣本被刪除。由于 TCGA 中沒有足夠的正常胰腺組織測序數(shù)據(jù)，因此我們首先使用相同的歸一化方法將 TCGA 和 GTEx 中胰腺組織的測序數(shù)據(jù)組合在一起，最終獲得171個正常胰腺樣本和178個癌癥樣本，然后使用Wilcoxon秩和檢驗鑒定胰腺癌和正常胰腺組織之間ITGA2表達量的差異。對于臨床病理參數(shù)與ITGA2表達值之間的關系，則采用 Kruskal-Wallis 檢驗和邏輯回歸進行評估，包括TCGA和ICGC 數(shù)據(jù)中的分級、分期、T 分期、N 分期和病人的癌癥狀態(tài)。基于Kaplan-Meier曲線分析，我們在R語言中，使用“survival”包研究了 ITGA2 的總體存活率。然后根據(jù)ITGA2的中位表達值將TCGA和ICGC患者分為高表達組和低表達組。最后，利用Cox 回歸評估了臨床病理學特征與 TCGA中胰腺癌患者總生存期之間的關系。根據(jù)ITGA2基因的中位表達值，進行多變量Cox分析，比較ITGA2表達對生存的影響以及其他臨床特征，如分期、分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)及遠處轉(zhuǎn)移狀態(tài)等。所有統(tǒng)計分析均使用 R(v.3.5.3)進行。

1.2 單基因富集分析

首先根據(jù)ITGA2的表達值分別將TCGA隊列和ICGC隊列中的樣本分為高表達組和低表達組。然后使用GSEA軟件3.0進行單基因富集分析s-GSEA以識別統(tǒng)計富集的途徑。每次分析對預選的基因組進行1000次測序，錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)值<25%的基因組被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ITGA2在胰腺癌患者中的過表達

本研究所使用的數(shù)據(jù)包含來自 TCGA 和 GTEx 的 171 個正常胰腺組織和 178 個胰腺癌組織，以及來自 ICGC 的 84 個胰腺癌組織。TCGA和ICGC患者對應的臨床資料見表1。結(jié)果顯示ITGA2在胰腺癌組織中的表達顯著高于正常組織，如圖1A所示(p=3.247e-56)。此外，我們通過Oncomine數(shù)據(jù)庫證實了ITGA2在胰腺癌中的表達上調(diào)，如圖1B所示，倍數(shù)變化為8.163，p值=3.41E-8。

表1 TCGA和ICGC數(shù)據(jù)庫中患者的相應臨床信息

圖1 ITGA2在胰腺癌和正常胰腺組織中的表達

2.2 ITGA2表達與臨床病理學變量之間的相關性分析

分別采用兩種分析方法，Kruskal檢驗和Logistic回歸，對TCGA隊列獲得的182個胰腺癌樣本和從ICGC隊列獲得的83個胰腺癌樣本及其相應的臨床病理學變量進行分析，評估ITGA2表達與臨床病理變量之間的相關性。結(jié)果如圖2(A-H)所示。Kruskal檢驗的結(jié)果表明，ITGA2表達增加與某些臨床病理變量之間存在明顯的關系，例如分級(圖2A，p=8.334e-04，TCGA隊列；圖2F，p=0.027，ICGC隊列)，TNM分期(圖2B，p=0.03，TCGA隊列)，T分期(圖2C，p=0.009，TCGA隊列；圖2G，p=0.018，ICGC隊列)，N期(圖圖2D，p=0.618，TCGA隊列；圖2H，p=0.559，ICGC隊列)和癌癥狀態(tài)(圖2E，p=2.758e-06，TCGA隊列)。但本次分析的結(jié)果顯示ITGA2的表達量與N期無相關性。如表2所示，Logistic分析結(jié)果回歸顯示ITGA2表達是一個影響胰腺癌患者預后不良的獨立因素。由表2可知，ITGA2高表達與高分期(OR=2.790，Ⅰ期vs.Ⅱ期)、分級(OR=3.000，G1vs.G2；OR=4.79，G1vs.G3)顯著相關，癌癥狀態(tài)(OR=3.596，無腫瘤與有腫瘤)，這表明具有高ITGA2表達的胰腺癌患者比具有低ITGA2表達的胰腺癌患者更容易進展到更晚期和更高級別。

表2 與臨床病理特征相關的TGA2表達(邏輯回歸)

圖2 ITGA2表達和臨床病理特征的關系

2.3 ITGA2在胰腺癌中表達的預后價值

為了評價ITGA2在胰腺癌中的預后價值，采用Kaplan-Meier生存曲線比較了ITGA2表達對胰腺癌患者生存期的影響。結(jié)果表明，ITGA2高表達組的存活時間明顯短于低表達組。如圖 3A 所示，低表達組患者的總時間明顯長于高表達組患者(p=0.002)。為了進一步評估 ITGA2 表達作為胰腺癌生物標志物的預后價值，還對 ICGC 數(shù)據(jù)庫中的 ITGA2 進行了生存分析(p=0.009，圖 3B)，得到了相同的結(jié)果。如表3 所示，單變量 cox 回歸分析結(jié)果顯示，高表達 ITGA2 與胰腺癌總生存時間縮短顯著相關。風險比(HR)為 4.089，95% 置信區(qū)間(CI)為 1.732-9.651(p<0.001)。為探討 ITGA2 與其他臨床因素(如年齡、T 分期、N 分期)的獨立性，在 R 中也進行了多變量 Cox 回歸分析。根據(jù)多變量 Cox 回歸分析的結(jié)果，ITGA2-高表達與整體顯著相關。胰腺癌患者的生存率作為連續(xù)變量(HR：4.137；95% CI：1.623-10.547；p=0.003)，并且獨立于其他臨床因素，這表明 ITGA2是胰腺癌的預后相關因素。在我們的分析中，其他傳統(tǒng)的預后因素，如TNM分期和等級，不被視為總生存期的預后指標。

表3 TCGA隊列中總生存期的單因素和多因素分析

圖3 根據(jù) ITGA2 表達水平，胰腺癌患者的 Kaplan-Meier生存曲線

2.4 富含ITGA2的信號通路

在TCGA隊列中，根據(jù)ITGA2的中位表達值將胰腺癌患者分為高表達組和低表達組。為了識別在ITGA2高表達組中顯著富集的信號通路，在高ITGA2組和低ITGA2組之間進行了s-GSEA。結(jié)果顯示，11個基因組在FDR<25%時顯著富集，如表4所示。包括其中一些與癌癥發(fā)生和發(fā)展密切相關的KEGG通路也顯著富集，如胰腺癌(圖4A)、子宮內(nèi)膜癌(圖4B)、前列腺癌(圖4C)、癌癥中的通路(圖4D)、甲狀腺癌(圖4E)、膀胱癌(圖4F)、腎細胞癌(圖4G)、緊密連接(圖4H)等。

3 討論

胰腺癌在世界范圍內(nèi)是一種極其嚴重的致命性惡性腫瘤，胰腺癌患者所有階段的總體5年生存率都很低。目前還沒有有效的治療方法來降低胰腺癌的死亡率。此外，鑒于到2030年胰腺死亡率預計將成為癌癥相關死亡的第二大原因，因此迫切需要闡明詳細的發(fā)病機制，并尋找新的預后相關標志物和治療靶點。通過對測序數(shù)據(jù)的生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)了一個屬于整合素家族的蛋白質(zhì) ITGA2。ITGA2 編碼膠原蛋白和相關蛋白的跨膜受體的 α 亞基，它與 β 亞基形成異二聚體[22]。許多研究報告提出，ITGA2 在多種腫瘤中表達量顯著上調(diào)。Peng Guo 發(fā)現(xiàn) ITGA2 的高表達與膠質(zhì)母細胞瘤患者存活率降低密切相關[22]。據(jù)報道，SPARC 通過黑色素瘤中的 β2β1 整合素促進組織蛋白酶 B 介導的黑色素瘤侵襲性[23]。但ITGA2在胰腺癌中的作用仍然是個謎。在本研究中，我們從 TCGA、ICGC 和 GTEx 數(shù)據(jù)庫下載基因表達數(shù)據(jù)，通過生物信息學分析探討 ITGA2 在胰腺癌中是否具有基因表達量變化和潛在預后價值。我們發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，胰腺癌組織中ITGA2基因的表達顯著增加。ITGA2 表達變化的結(jié)果與 Oncomine 數(shù)據(jù)庫中的結(jié)果一致。ITGA2表達與臨床特征的相關性分析結(jié)果表明，胰腺癌中IFGA2的高表達與TNM分期、分級和癌癥狀態(tài)相關，表明ITGA2具有潛在的預后價值。在 TCGA 和 ICGC 隊列中，通過生存分析，我們發(fā)現(xiàn) ITGA2 在胰腺癌患者中顯示出良好的預測能力，即低表達組的總時間明顯長于高表達組患者(p= 0.002，p = 0.009 分別)。為了研究ITGA2在胰腺癌中的作用，用TCGA數(shù)據(jù)進行了單基因GSEA。結(jié)果顯示，在 FDR < 25% 的 ITGA2 高表達組中有 11 個基因組顯著富集，包括子宮內(nèi)膜癌、癌癥通路、軸突引導、前列腺癌、腎細胞癌、甲狀腺癌、泛素介導的蛋白水解、內(nèi)吞作用、緊密連接，膀胱癌，胰腺癌。此外，我們發(fā)現(xiàn) ITGA2 可能參與與 E-cadherin 的緊密連接途徑。E-cadherin 是一種被廣泛接受的 EMT 生物標志物，在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著至關重要的作用。以往的研究表明，EMT在胰腺癌的轉(zhuǎn)移中起重要作用。例如，F(xiàn)OXO3a 通過誘導上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進胰腺導管腺癌的轉(zhuǎn)移[24]。一些長鏈非編碼 RNA(lncRNA)，如 MEG8，可誘導 EMT 相關的細胞形態(tài)變化并增加胰腺癌細胞的細胞運動能力[25]。幾項研究表明，ITGA2 與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程存在千絲萬縷的關系。例如Ferraro A 揭示 EZH2 通過靶向整合素 α2 基因控制結(jié)腸癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[26]。董家強的研究表明，ITGA2通過調(diào)節(jié)耐藥轉(zhuǎn)移性胃癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化與遠處轉(zhuǎn)移有關[18]。盡管沒有直接證據(jù)表明 ITGA2 在胰腺癌轉(zhuǎn)移過程中起作用?？紤]到過去的研究結(jié)果和我們這次的分析，我們有理由相信 ITGA2 可能參與 EMT 促進胰腺癌轉(zhuǎn)移，從而導致預后不良。這與 ITGA2 高表達的患者比 ITGA2 低表達的患者具有更短的總生存時間一致。總之，我們的研究表明，ITGA2 有可能成為胰腺癌的治療靶點。