骨蝕方治療股骨頭壞死的藥理學(xué)機(jī)制

魏 濤，鄧凱文，曾 勇，周紅典，李 漁，徐祖健

西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 骨關(guān)節(jié)科（瀘州 646000）

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head,ONFH）是股骨頭血液供應(yīng)受損導(dǎo)致股骨頭內(nèi)細(xì)胞死亡，從而引起病人出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛及活動受限等臨床表現(xiàn)，是骨科中常見的多發(fā)性及難治性疾病[1-4]。據(jù)流行病學(xué)資料顯示，在美國和日本，每年分別有2 萬和1.2至2.4萬例新診ONFH病人，而在中國年齡大于15歲的人群中，累計約有812 萬例ONFH 病人，其中男性發(fā)病率（1.02%）明顯高于女性（0.51%），且在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年遞增趨勢[5-6]。目前，對于ONFH 病因的認(rèn)識可分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性兩大類，前者主要包括股骨頭/頸骨折和髖臼骨折等，后者的病因更為復(fù)雜，主要有長期吸煙和過量酗酒、不規(guī)范使用糖皮質(zhì)激素、肥胖、糖尿病和自身免疫性疾病等[5,7-9]。此外，ONFH對病人生活、心理和經(jīng)濟(jì)造成的影響更是難以估量[10-13]。故積極探索治療此病的新方式已成為目前研究的熱點方向。

中醫(yī)學(xué)依據(jù)ONFH 的臨床表現(xiàn)，可將其歸于“骨蝕”和“骨痹”等范疇，其中瘀阻絡(luò)證和肝腎虧虛證又為臨床常見的兩種證型[14]。但由于骨蝕方藥物所含成分復(fù)雜，其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。因此，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討骨蝕方治療ONFH的潛在作用靶點及分子學(xué)機(jī)制，擬為骨蝕方的臨床應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)和科學(xué)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 骨蝕方活性成分及靶點收集

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫收集骨蝕方中8味中藥的活性成分，首先分別以“延胡索”“續(xù)斷”“牛膝”“骨碎補(bǔ)”“獨活”“川芎”“白術(shù)”和“白芍”為關(guān)鍵詞逐一進(jìn)行檢索，再以口服利用度≥30%同時成藥相似性≥0.18為閾值對上述藥物進(jìn)行再次篩選，獲得骨蝕方有效活性成分信息，然后再次使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲得活性成分所對應(yīng)的靶點名稱，最后使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫獲得靶點對應(yīng)的基因，并將物種類型選擇為“human”。

1.2 股骨頭壞死治療靶點收集

首先分別通過Genecard 和OMIM 數(shù)據(jù)庫以“osteonecrosis of the femoral head”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，去重檢索結(jié)果后獲得ONFH 疾病的所有靶點，導(dǎo)入至Excel 對結(jié)果進(jìn)行整合，然后利用R語言制作韋恩圖，獲得骨蝕方作用靶點并與上述靶點取交集，最后得到骨蝕方治療ONFH的潛在靶標(biāo)。

1.3 構(gòu)建化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

首先將治療ONFH疾病的靶點與骨蝕方治療靶點同時導(dǎo)入至Excel 合并，對結(jié)果重復(fù)值導(dǎo)入至新的Excel表格，此結(jié)果即為骨蝕方治療ONFH的靶點，然后將上述結(jié)果導(dǎo)入至Cytoscape 3.7.2 軟件獲得骨蝕方與治療靶點的互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

首先將骨蝕方治療ONFH 的潛在靶點依次導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，然后導(dǎo)入至Cytoscape 3.7.2 軟件將結(jié)果以可視化形式展現(xiàn)出來。

1.5 GO生物功能與KEGG 信號通路富集分析

將骨蝕方治療ONFH 的交集靶點利用R 語言，條件設(shè)定為P ≤0.05 進(jìn)行KEGG 和GO 富集分析，并選擇前20條結(jié)果繪制柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 骨蝕方化合物-ONFH靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索骨蝕方治療ONFH的活性成分靶標(biāo)，剔除檢索出的重復(fù)結(jié)果后得到：延胡索8個，續(xù)斷3 個，牛膝6 個，骨碎補(bǔ)7 個，獨活4 個，川芎5個，白術(shù)3 個，白芍4 個。其中谷甾醇為白芍、川芎、延胡索的共有成分；山奈酚為白芍、骨碎補(bǔ)、牛膝的共有成分；豆甾醇為骨碎補(bǔ)、牛膝、熟地黃、延胡索的共有成分；槲皮素為牛膝、延胡索的共有成分；β-谷甾醇為獨活、骨碎補(bǔ)、牛膝、續(xù)斷共有成分。對Genecard 和OMIM 數(shù)據(jù)庫中獲得的ONFH 相關(guān)基因取并集，得到ONFH 相關(guān)基因739 個。將骨蝕方候選靶標(biāo)與ONFH候選靶標(biāo)相比較，得到可能與治療ONFH 的作用靶標(biāo)121個，并繪制韋恩圖展示（見圖1）。將骨蝕方活性成分和與ONFH相關(guān)靶標(biāo)同時導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，圖中包括158個節(jié)點。骨蝕方治療ONFH具有多成分和多靶標(biāo)等特點（見圖2）。

圖1 骨蝕方與ONFH靶點韋恩圖Figure 1 Venn diagram of Gushi Fang and targets of ONFH

圖2 骨蝕方治療ONFH的“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 "Drug-Target-Disease"network diagram of ONFH treated with Gushi Fang

2.2 靶蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

將骨蝕方治療ONFH 作用靶點導(dǎo)入STRING 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，再將得到的靶蛋白互作圖導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件。結(jié)果共計158 節(jié)點，515 條邊（見圖3）。連接度位于前30 的靶點作為骨蝕方治療ONFH的核心靶點，其中排名前4 的包括白介素6（Interleukin 6,IL-6）、AKT1、VEGFA、MAPK3和JUN。提示這4個靶標(biāo)基因是骨蝕方治療ONFH 的重要基因（見圖4）。

圖3 骨蝕方治療ONFH的PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 3 PPI network of ONFH treated with Gushi Fang

圖4 骨蝕方治療ONFH的核心靶點Figure 4 Core targets of ONFH treated with Gushi Fang

2.3 GO生物功能與KEGG 信號通路富集分析

GO 功能富集出生物過程總計140 條，結(jié)果取排名前20（見圖5）。KEGG 信號通路富集出相關(guān)通路總計157 條，結(jié)果取排名前20（見圖6）。分析結(jié)果表明，骨蝕方治療ONFH 的靶點主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體激活（signaling receptor activator activity）、IL-17信號通路（Interleukin-17 signaling pathway）、TNF信號通路（TNF signaling pathway）以及P13K-Akt信號通路（P13K-Akt signaling pathway）等。

圖5 骨蝕方治療ONFH靶點基因GO功能富集圖Figure 5 GO function enrichment map of the target genes of ONFH treated with Gushi Fang

圖6 骨蝕方治療ONFH靶點基因KEGG功能富集圖Figure 6 KEGG functional enrichment map of target genes of ONFH treated with Gushi Fang

3 討論

目前對ONFH的治療方式主要包括手術(shù)治療和保守治療兩類，手術(shù)治療方式的選擇又是多種多樣，各有優(yōu)劣，其中髓芯減壓術(shù)和鉭棒植入術(shù)雖然對疾病分期較早的病人療效顯著，但對于分期較晚者常常難以達(dá)到緩解臨床癥狀的目的；而髖關(guān)節(jié)置換術(shù)雖然是治愈病人的有效方法，但作為異體結(jié)構(gòu)，存在后期再次換髖和翻修的可能，加之手術(shù)風(fēng)險和較高的手術(shù)費用使病人對手術(shù)治療的接受度相對較低[15]。另外，保守治療又分為藥物治療和物理治療，前者主要有應(yīng)用雙膦酸鹽抑制骨吸收，促進(jìn)新骨生成，但對于此藥的最佳使用濃度尚存爭議；抗凝藥物和血管擴(kuò)張劑的應(yīng)用能有效改善病灶處血液供應(yīng)，預(yù)防塌陷等特點，但對于有出血風(fēng)險的病人而言又限制了此類藥物的使用；體外沖擊波療法和脈沖電磁療法為治療ONFH 常用的物理方式，主要通過促進(jìn)病灶處血管生成、刺激成骨起到增加骨量等作用，而高壓氧治療可增加氧含量，改善微循環(huán)，并誘導(dǎo)新生血管形成，但目前相關(guān)報道較少，療效有待大樣本臨床研究驗證[16-17]。

中醫(yī)在治療ONFH 方面具有獨特優(yōu)勢，對早期病人的治療效果甚至優(yōu)于手術(shù)治療[18-19]。骨蝕方作為治療ONFH 的特色方劑，通過長期觀察發(fā)現(xiàn)骨蝕方在改善病人疼痛和提高關(guān)節(jié)活動度等方面療效確切。本方重用續(xù)斷和牛膝為君藥，補(bǔ)腎強(qiáng)骨的同時兼顧活血通經(jīng)，考慮本病病程較長，久病入絡(luò)，故配伍延胡索為臣藥，止痛行氣之余兼活血之功，同時佐以骨碎補(bǔ)、獨活和川芎加強(qiáng)諸藥補(bǔ)腎活血之力，最后施以少量白術(shù)和白芍健脾柔肝，以上藥物合用共奏補(bǔ)腎強(qiáng)骨、活血止痛之效，故“骨蝕”自愈也。此外，結(jié)合本網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，我們推測骨蝕方通過調(diào)節(jié)IL-17、TNF 以及P13KAkt信號通路發(fā)揮治療ONFH的作用。IL-17和TNF作為重要的促炎性因子，相比健康人群，在ONFH病人血清中含量較高，故以IL-17和TNF為治療靶標(biāo)成為目前治療ONFH 的新思路[20-23]。亦有研究證實，通過激活P13K-Akt信號通路能促進(jìn)股骨破骨細(xì)胞的重吸收，對改善股骨的骨顯微參數(shù)具有積極作用[24-26]。同時，P13K-Akt信號通路在既往研究中表明，在心肌缺血再灌注中可以通過恢復(fù)細(xì)胞抗凋亡、促進(jìn)肌漿網(wǎng)對Ca2+再攝取途徑保護(hù)心肌[27]；也有研究表明P13K-Akt 信號通路可通過調(diào)控股骨血管信號通路活性，促進(jìn)病灶血管修復(fù)，也可通過誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖、抑制破骨細(xì)胞活性，從而調(diào)節(jié)二者比值，參與到治療ONFH 疾病的過程[28-31]。

4 結(jié)論與后續(xù)驗證

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果得知，骨蝕方治療ONFH 的藥理學(xué)機(jī)制可能通過谷甾醇、豆甾醇、槲皮素和β-谷甾醇等成分，作用于IL-6、AKT1、VEGFA、MAPK3 和JUN 等靶點和IL-17、TNF 以及P13K-Akt 等信號通路，發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)成骨/破骨細(xì)胞比值等而發(fā)揮治療作用。后續(xù)，我們將結(jié)合本研究結(jié)果開展一系列實驗驗證骨蝕方治療ONFH的具體作用機(jī)制。

（利益沖突：無）