低亞硝酸鹽柳州酸筍的研制及品質(zhì)分析

劉永逸，林華，楊超，楊宛螢，彭幫柱*

1(柳州市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測研究中心，廣西 柳州，545001)2(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢，430070) 3(果蔬加工與品質(zhì)調(diào)控湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(華中農(nóng)業(yè)大學(xué))，湖北 武漢，430070)

酸筍主要以新鮮竹筍為原料，在低鹽條件下密封發(fā)酵而成，發(fā)酵后的酸筍富含人體必需氨基酸和膳食纖維，具有降血脂、增強(qiáng)免疫力等保健功能[1]。在酸筍發(fā)酵過程中，硝酸鹽在微生物所產(chǎn)生的硝酸還原酶的作用下生成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽含量超標(biāo)會影響酸筍品質(zhì)[2]。過量攝入亞硝酸鹽會引起人體中毒，導(dǎo)致高鐵血紅蛋白癥，世界衛(wèi)生組織規(guī)定亞硝酸鹽每日攝入量限量為0.06 mg/kg[3-4]。

目前，對酸筍的研究主要集中在乳酸菌的篩選、營養(yǎng)物質(zhì)和風(fēng)味成分的解析。孫寧等[1]對自然發(fā)酵酸筍中的乳酸菌進(jìn)行了篩選和鑒定，發(fā)現(xiàn)6株具有良好的益生性能和體外抗氧化活性的乳酸菌；郭榮燦等[5]對發(fā)酵酸筍氣味物質(zhì)的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)頂空固相萃取法為最佳萃取方法；朱照華[6]發(fā)現(xiàn)酚類、醇類、酸類和醛類物質(zhì)為自然發(fā)酵酸筍的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。然而現(xiàn)階段對于研制低亞硝酸鹽酸筍及其品質(zhì)分析的報(bào)道較少，傳統(tǒng)發(fā)酵酸筍存在發(fā)酵周期長、亞硝酸鹽含量高等問題[7]，有研究表明乳酸菌在發(fā)酵過程中能夠有效減少亞硝酸鹽含量，其產(chǎn)生大量的乳酸有抑菌作用，能有效防止酸筍的腐敗變質(zhì)[8]。

本研究選用實(shí)驗(yàn)室保存的乳酸菌接種于酸筍發(fā)酵中，并與自然發(fā)酵酸筍對比分析。通過對酸筍發(fā)酵過程中各項(xiàng)理化指標(biāo)及亞硝酸鹽含量的檢測和發(fā)酵后酸筍的質(zhì)構(gòu)分析，結(jié)合GC-MS解析發(fā)酵后酸筍的風(fēng)味成分，研制低亞硝酸鹽的發(fā)酵酸筍，以期為規(guī)?；a(chǎn)安全性高和風(fēng)味獨(dú)特的柳州酸筍提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

新鮮采摘竹筍，購于廣西柳州；乳酸菌菌株，分離自廣西柳州酸筍發(fā)酵液中，保存于柳州市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測研究中心。

MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司；食鹽，市售；NaNO2、NaOH、硼砂、乙酸鋅、K4Fe(CN)6、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

YX-280高壓蒸汽滅菌鍋，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；U-1750紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；ZXDP-B1160生化培養(yǎng)箱，上海智誠分析儀器制造有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PHS-3C pH計(jì)，上海精科儀器有限公司；TA.XT.Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro System公司；Agilent 7000D/8890氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫儀器有限公司；50/30 μm DB/CAR/PDMS纖維萃取頭，美國Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的活化

將保存于-80 ℃的3株取自柳州酸筍發(fā)酵液中的乳酸菌(P51、P52、P53)解凍后，取1環(huán)接種于50 mL MRS液體培養(yǎng)基中(121 ℃滅菌20 min)，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h。按接種量2%(體積分?jǐn)?shù)，下同)接種至50 mL MRS液體培養(yǎng)基中并擴(kuò)大培養(yǎng)22 h。

1.3.2 乳酸菌降解亞硝酸鹽能力測定

以2%的接種量將活化后的乳酸菌P51、P52、P53分別接種于含有150 mg/L NaNO2的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，取樣并測定亞硝酸鹽含量[9-10]。亞硝酸鹽含量的測定參考GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.600 1x+0.007 6，R2=0.999。

1.3.3 生長曲線的測定

取適量活化兩代的乳酸菌P51 8 000 r/min離心10 min后用無菌水洗滌2次，重懸乳酸菌細(xì)胞并以2%接種量接種于50 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)并測定乳酸菌在600 nm處的吸光值以確定其生長情況[11]。

1.3.4 酸筍的發(fā)酵工藝

本實(shí)驗(yàn)選用產(chǎn)自廣西柳州的新鮮無蟲害竹筍，采取自然發(fā)酵和純種乳酸菌發(fā)酵酸筍，發(fā)酵工藝如下：

自然發(fā)酵：新鮮竹筍→去根、去殼→清洗、切塊→鹽漬(6%食鹽水)→密封發(fā)酵

純種乳酸菌發(fā)酵：新鮮竹筍→去根、去殼→清洗、切塊→熱水燙煮2 min→鹽漬(6%食鹽水)→接種乳酸菌(接種量為0.04 g/kg)→密封發(fā)酵

1.3.5 酸筍發(fā)酵過程中各項(xiàng)理化指標(biāo)的檢測

酸筍發(fā)酵周期為14 d,每隔2 d取樣。參照GB 12456—2008《食品中總酸的測定》測定pH值和總酸含量；參照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》中直接滴定法測定還原糖含量；參照GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中鹽酸奈乙二胺比色法測定亞硝酸鹽含量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行。

1.3.6 酸筍的品質(zhì)分析

對發(fā)酵后的酸筍進(jìn)行品質(zhì)分析，選取形狀、大小盡量一致的酸筍，將其切成4 cm長。使用質(zhì)構(gòu)儀檢測發(fā)酵后酸筍的硬度和脆度，檢測模式為穿刺模式，實(shí)驗(yàn)參數(shù)參考劉洪等[12]的研究并略作修改。選用P/2 N-2 mm不銹鋼針形探頭，測前速度1.0 mm/s、測試速度3.0 mm/s、測后速度10.0 mm/s、穿刺距離5 mm、觸發(fā)力3.0 g。樣品測試5次取平均值。

1.3.7 酸筍的感官評價(jià)

對發(fā)酵后酸筍進(jìn)行感官評價(jià)，由8人組成感官評價(jià)小組(4男4女，包括2名感官評價(jià)專家)，分別從酸筍的色澤、口感、滋味和風(fēng)味3方面進(jìn)行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 不同發(fā)酵方式的酸筍感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory ealuation standard of sour bamboo shoots with different fermentation methods

1.3.8 酸筍風(fēng)味成分分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析發(fā)酵后酸筍的風(fēng)味成分。將發(fā)酵14 d的自然發(fā)酵酸筍和純種乳酸菌發(fā)酵酸筍剁碎后取8 g分裝至20 mL頂空瓶中，于80 ℃平衡10 min后，插入經(jīng)老化處理后的萃取頭，頂空吸附30 min后將萃取頭插入進(jìn)樣品口解析5 min。氣相色譜條件：毛細(xì)管柱為HP-5 (30 m×250 μm×0.25 μm)；升溫程序：40 ℃保持2 min，以10 ℃/min升至100 ℃，再以4 ℃/min升至250 ℃，保持3 min；載氣He，流速1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0 μL。質(zhì)譜條件：電子電離源EI，電子能量70 e，四級桿溫度和離子源溫度分別為150 ℃和200 ℃，數(shù)據(jù)采集為全掃描[13]。在NIST 05質(zhì)譜庫中分析檢測到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，采用Excel處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并用Origin 2018繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌降解亞硝酸鹽能力及生長曲線測定

將活化兩代的乳酸菌(P51、P52、P53)分別加入到含有150 mg/L NaNO2的MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，NaNO2含量分別為0.069、10.071、16.545 mg/L，其降解率分別為99.95%、93.29%和88.97%。3株乳酸菌均具有較高的亞硝酸鹽降解能力，其中菌株P(guān)51降解能力最強(qiáng)，故選擇該菌株接種于后續(xù)酸筍發(fā)酵過程中。

如圖1所示，乳酸菌P51在營養(yǎng)物質(zhì)充足條件下，培養(yǎng)6 h后呈對數(shù)生長，在培養(yǎng)20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，因此將活化20 h的乳酸菌用于酸筍發(fā)酵。

圖1 乳酸菌生長曲線Fig.1 The growth cure of lactic acid bacteria

2.2 酸筍發(fā)酵過程中pH值和總酸含量的變化

如圖2所示，酸筍初始pH為6.96，發(fā)酵過程中，發(fā)酵液pH值隨時(shí)間的變化逐漸降低，且純種發(fā)酵酸筍的pH值均低于自然發(fā)酵；總酸含量逐漸增多且純種發(fā)酵中總酸含量高于自然發(fā)酵。

a-pH值；b-總酸含量圖2 酸筍發(fā)酵過程中pH值和總酸含量的變化Fig.2 Changes of the pH, total acid content of sour bamboo shoots during fermentation

在發(fā)酵前期，乳酸菌生長代謝迅速，發(fā)酵液的總酸含量不斷增加且pH值顯著下降；在發(fā)酵后期，pH值逐漸降低且變化速率趨于平緩，總酸含量在發(fā)酵第12天達(dá)到最大值后略有降低，這是由于大量乳酸的積累抑制了乳酸菌的生長，降低了其產(chǎn)酸能力[14]。

研究表明，當(dāng)泡菜液的pH值為3.5～3.8時(shí)，發(fā)酵結(jié)束[15]。在發(fā)酵第6天時(shí)，純種發(fā)酵酸筍發(fā)酵液pH值為3.73，總酸含量為0.39%；而自然發(fā)酵酸筍在第12天時(shí)，pH值為3.69，總酸含量為0.48%。乳酸菌在生長代謝過程中，能產(chǎn)生大量乳酸和乙酸等物質(zhì)[16]，在純種發(fā)酵酸筍中，乳酸菌作為優(yōu)勢菌群其繁殖速度更快，產(chǎn)酸更多，因此純種乳酸菌發(fā)酵酸筍能顯著縮短酸筍的發(fā)酵周期。

2.3 酸筍發(fā)酵過程中還原糖含量的變化

由圖3可知，2種不同發(fā)酵方式的發(fā)酵液中還原糖含量均呈下降趨勢。在第2～6天時(shí)，乳酸菌的生長代謝需消耗碳源，因此還原糖消耗速率較快；發(fā)酵第8～14天時(shí)，還原糖含量逐漸減少。在自然發(fā)酵酸筍中存在大量微生物，乳酸菌含量較少，因此在發(fā)酵過程中其還原糖消耗速率均低于純種乳酸菌發(fā)酵酸筍。

圖3 酸筍發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Fig.3 Changes of reducing sugar content of sour bamboo shoots during fermentation

2.4 酸筍發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的變化

自然發(fā)酵和純種發(fā)酵酸筍在發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量均低于GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》中的限量標(biāo)準(zhǔn)。如圖4所示，純種發(fā)酵和自然發(fā)酵酸筍分別在第6天和第10天時(shí)產(chǎn)生“亞硝峰”，亞硝酸鹽含量分別為1.815 mg/kg和2.157 mg/kg。

圖4 酸筍發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.4 Changes of nitrite content of sour bamboo shoots during the fermentation

在第14天時(shí)，純種發(fā)酵和自然發(fā)酵酸筍中亞硝酸鹽含量最低，分別為0.431 mg/kg和0.716 mg/kg。說明純種發(fā)酵所接種的乳酸菌P51具有高效降解亞硝酸鹽的能力，有效減少了酸筍發(fā)酵過程中亞硝酸鹽的產(chǎn)生，因此純種乳酸菌發(fā)酵酸筍具有更高的食用安全性。

2.5 發(fā)酵酸筍的質(zhì)構(gòu)分析

發(fā)酵后酸筍口感清脆，風(fēng)味獨(dú)特，酸筍的硬度和脆度與發(fā)酵過程中微生物、酶及原果膠含量有關(guān)[15,17]。用質(zhì)構(gòu)儀檢測2種不同發(fā)酵方式酸筍的硬度和脆度，如表2所示，純種乳酸菌發(fā)酵酸筍的硬度和脆度均優(yōu)于自然發(fā)酵，這可能是由于發(fā)酵后期，純種發(fā)酵酸筍的pH值較低，抑制了乳酸菌P51的生長，減少了酶類的產(chǎn)生，降低了酸筍中原果膠的水解作用。

表2 不同發(fā)酵方式酸筍的質(zhì)構(gòu)分析Table 2 Texture analysis of sour bamboo shoots with different fermentation methods

2.6 發(fā)酵酸筍的感官評價(jià)分析

在發(fā)酵第14天，自然發(fā)酵和純種發(fā)酵酸筍中亞硝酸鹽含量均低于國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，可用于感官評價(jià)。如表3所示，純種發(fā)酵酸筍在色澤和口感上均優(yōu)于自然發(fā)酵，其色澤均勻，呈乳白色，口感清脆，感官脆度與質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果一致；在滋味和風(fēng)味方面評分略低于自然發(fā)酵，自然發(fā)酵酸筍香味更濃郁，這可能與自然發(fā)酵過程中微生物種類較多有關(guān)。綜上，純種發(fā)酵酸筍感官評價(jià)優(yōu)于自然發(fā)酵酸筍。

表3 不同發(fā)酵方式酸筍的感官評分比較Table 3 Comparison of sensory scores of sour bamboo shoots with different fermentation methods

2.7 發(fā)酵酸筍的風(fēng)味成分分析

通過GC-MS對發(fā)酵后酸筍的風(fēng)味成分進(jìn)行分析，在自然發(fā)酵和純種發(fā)酵酸筍中，揮發(fā)性風(fēng)味成分主要由酯類、醛類、酚類和醇類等物質(zhì)組成。如圖5所示，純種乳酸菌發(fā)酵酸筍中酯類物質(zhì)含量高于自然發(fā)酵，其中乙酸甲酯含量最高(17.56%)，賦予酸筍一定的清香香味，此外乙酸苯酯(5.77%)、庚酸乙酯(2.45%)、辛酸甲酯(2.13%)、亞油酸乙酯(1.97%)、水楊酸甲酯(1.48%)等酯類物質(zhì)也影響酸筍的風(fēng)味。純種發(fā)酵酸筍中醛類物質(zhì)含量低于自然發(fā)酵，苯甲醛具有發(fā)霉的味道，其含量在2種酸筍的醛類物質(zhì)中最高，分別為8.71%和16.37%。酚類物質(zhì)具有一定的刺激性氣味，有研究表明對甲苯酚是賦予發(fā)酵酸筍酸臭味的最主要成分[7,18]，2種方式發(fā)酵的酸筍中對甲苯酚含量分別為11.23%和10.63%。醇類物質(zhì)具有花果香味[19]，2種方式發(fā)酵酸筍的醇類物質(zhì)含量相近，主要為乙醇、苯乙醇、環(huán)乙醇、2-壬醇等物質(zhì)。此外，醚類、酮類、酸類、烷類和烯類物質(zhì)在酸筍中也有檢出，但其種類和含量較少。

由圖5可知，自然發(fā)酵和純種發(fā)酵酸筍中風(fēng)味成分的含量略有不同，但風(fēng)味物質(zhì)的種類較為接近，說明純種乳酸菌發(fā)酵酸筍具有和自然發(fā)酵酸筍相近的風(fēng)味。

圖5 不同發(fā)酵方式酸筍中揮發(fā)性風(fēng)味成分含量Fig.5 Analysis of olatile flaor components of sour bamboo shoots with different fermentation methods

3 結(jié)論與討論

本研究利用實(shí)驗(yàn)室保存的乳酸菌P51接種于發(fā)酵酸筍中，分別從食用安全性、品質(zhì)和風(fēng)味等方面與自然發(fā)酵酸筍進(jìn)行對比分析。結(jié)果表明純種乳酸菌發(fā)酵酸筍顯著降低了亞硝酸鹽的產(chǎn)生，在發(fā)酵第14天時(shí)亞硝酸鹽含量最低為0.431 mg/kg；pH值、總酸和還原糖含量變化速率較快，縮短了發(fā)酵周期；其硬度和脆度均優(yōu)于自然發(fā)酵，且保留了與自然發(fā)酵酸筍相近的風(fēng)味成分。綜上，純種乳酸菌發(fā)酵酸筍中亞硝酸鹽含量較低，具有更高的食用安全性，且在品質(zhì)和風(fēng)味上優(yōu)于自然發(fā)酵酸筍，該研究為低亞硝酸鹽酸筍的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)。