基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討“杜仲-牛膝”治療腰椎間盤突出癥的分子機制

鄧夢 馬斌祥 關(guān)永林▲ 張洋 常斌 姚鵬程 劉靜怡

腰椎間盤突出癥（Lumbar disc herniation,LDH）是骨科臨床的一種常見疾病，是由椎間盤退變、突出、壓迫或刺激臨近組織或相應(yīng)平面的神經(jīng)根、馬尾神經(jīng)后表現(xiàn)出來的一種綜合征[1]，主要以下腰部疼痛及坐骨神經(jīng)放射痛為臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重時可出現(xiàn)馬尾神經(jīng)損傷癥狀，是臨床下腰痛的主要病因。腰椎間盤突出癥歸屬于中醫(yī)學(xué)“腰痛”“痹病”范疇，主要病位在腎、肝等，主要病性是血瘀、濕、寒、氣滯等[2]，主要治療方法是補益肝腎、強筋骨等。秦曉寬等[3]研究表明，“杜仲-牛膝”在LDH 的治療中較為常見，杜仲、牛膝均可歸肝、腎經(jīng)，功效能補肝腎、強筋骨。骨傷科治療LDH 的常用方劑如獨活寄生湯、杜仲腰痛丸等均含有“杜仲-牛膝”，且療效顯著。既往研究多從杜仲、牛膝單味中藥或該藥物組成的復(fù)方治療LDH著手，目前藥對聯(lián)合治療LDH的研究較少。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來新興的基于系統(tǒng)生物學(xué)，利用計算機進行生物網(wǎng)絡(luò)分析，構(gòu)建“藥材-成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)，分析通路機制的一門學(xué)科，其為藥物治療疾病從靶點分子層面提供了導(dǎo)向。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的相關(guān)原理和方法，探討“杜仲-牛膝”治療LDH 的分子機制，為進一步實驗研究及臨床應(yīng)用提供思路[4-5]。

1 資料和方法

1.1 “杜仲-牛膝”有效成分及靶點預(yù)測通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫TCMSP[6]（https://tcmsp-e.com）挖掘“杜仲-牛膝”的有效成分，根據(jù)成分毒藥物動力學(xué)（absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME）參數(shù)對藥物潛在活血成分進行篩選，將藥物口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%、藥物相似度（drug likeness,DL）≥0.18定義為篩選條件[7]。

1.2 “杜仲-牛膝”有效成分作用靶點預(yù)測及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過TCMSP 及PharmMapper 數(shù)據(jù)庫（http://lilabecust.cn/pharmmapper/）[8-10]預(yù)測“杜仲-牛膝”有效成分的作用靶點，利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫[11]（https://www.

uniprot.org）完成靶點基因名稱（Gene name）的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換。使用網(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape 3.7.1對篩選出的“杜仲-牛膝”有效成分及作用靶點進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，用節(jié)點（node）表示藥物、有效成分及靶蛋白，用邊（edge）表示作用關(guān)系，利用軟件中network analyzer 插件進行網(wǎng)絡(luò)特征分析，以明確“杜仲-牛膝”中有效分與靶點之間的相互作用關(guān)系。

1.3 LDH 疾病相關(guān)靶點獲取通過OMIM（https://omim.org）、DrugBank[12]（https://go.drugbank.com/）、GeneCards（https://www.genecards.org）等疾病數(shù)據(jù)庫，以“Lumbar disc herniation”及“LDH”為關(guān)鍵詞對已知LDH 相關(guān)靶點進行檢索，檢索截止時間為2021 年11月，刪除重復(fù)值，得到已知的LDH疾病相關(guān)靶點。

1.4 “杜仲-牛膝”治療LDH的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析通過Venny分析獲得藥物與疾病共同作用的靶點，繪制韋恩圖，將獲得的中藥有效成分、藥物與疾病作用靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建“有效成分-靶點-疾病”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 靶點蛋白與蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析將初步得到的潛在作用靶點輸入STRING 數(shù)據(jù)庫[13]（https：//string-db.org）,構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI）;將STRING數(shù)據(jù)庫獲得的數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1，通過軟件的數(shù)據(jù)分析功能分析PPI網(wǎng)絡(luò)中各個節(jié)點的節(jié)點度值（Dgree），用節(jié)點顏色和大小代表節(jié)點度值，Dgree值越大代表其在相互作用網(wǎng)絡(luò)中作用越重要。將Dgree值前10位定義為“杜仲-牛膝”治療LDH的關(guān)鍵靶點。

1.6 生物富集分析利用DAVID[14]（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫對“杜仲-牛膝”有效成分作用靶點與LDH 疾病靶點的交集進行靶點基因本體論（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析，設(shè)定（P＜0.05）分析主要生物過程及涉及的主要信號通路。

2 結(jié)果

2.1 “杜仲-牛膝”藥物有效成分及編碼通過TCMSP數(shù)據(jù)庫挖掘杜仲及牛膝的藥物有效成分，獲得“杜仲-牛膝”潛在有效成分。根據(jù)ADME參數(shù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)置OB≥30%、DL≥0.18為篩選條件，結(jié)果：牛膝有效成分共176 個，符合條件的有20 個；杜仲有效成分共147 個，符合條件的有28 個；其中兩藥共同有效成分有3個。見表1。

表1 “杜仲-牛膝”藥物有效成分及編碼

續(xù)表

2.2 “杜仲-牛膝”有效成分作用靶點預(yù)測及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過TCMSP 及PharmMapper 數(shù)據(jù)庫預(yù)測所篩選出的“杜仲-牛膝”有效成分的作用靶點，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫進行靶點基因名稱（Gene name）的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換，得到杜仲有效成分作用靶點共260個，牛膝作用靶點共238 個，其中兩種藥物的共同作用靶點211 個。利用網(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape 3.7.1 進行“杜仲-牛膝”有效成分及作用靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，利用軟件中的network analyzer 插件進行網(wǎng)絡(luò)特征分析，以明確“杜仲-牛膝”中有效成分與作用靶點的相互作用關(guān)系，用節(jié)點（node）表示藥物、有效成分及靶蛋白，用邊（edge）表示其中的作用關(guān)系，節(jié)點（node）共334個，作用關(guān)系邊（edge）共1164條，見圖1。

圖1 “杜仲-牛膝”有效成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 “杜仲-牛膝”治療LDH疾病作用靶點預(yù)測通過對OMIM、DrugBank、GeneCards 等疾病數(shù)據(jù)庫進行篩選，合并去重后通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫完成靶點基因名稱（Gene name）的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換，得到目前已知LDH 疾病靶點506個。利用Venny 分析繪制Venny 圖獲得藥物與疾病共同作用的靶點，得到藥物與疾病交集62個，代表“杜仲-牛膝”治療LDH 的潛在靶點數(shù)量62個，同時通過Cytoscape 3.7.1 進行藥物-疾病-靶點的可視化分析，見圖2、圖3。

圖2 藥物-疾病-靶點韋恩圖

圖3 藥物-有效成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果分析將所得到的“杜仲-牛膝”治療LDH潛在靶點通過STRING數(shù)據(jù)庫進行PPI分析（DDX6與其他靶點蛋白均未關(guān)聯(lián)，故將其移除），見圖4。將獲得的結(jié)果利用Cytoscape 3.7.1 中network analyzer插件對潛在靶點PPI進行網(wǎng)絡(luò)特征分析，共有61 個靶點，1034 個作用關(guān)系。其中關(guān)聯(lián)度最高的前10 種靶蛋白為IL6、TNF、IL1B、ALB、FN1、MMP9、AKT1、JUN、PTGS2、TP53，認(rèn)為這是治療疾病的核心靶點，見圖5。

圖4 “杜仲-牛膝”治療LDH的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 藥物治療疾病的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 生物富集分析將藥物治療疾病的潛在靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫，進行GO 富集分析，得到生物學(xué)進程（Biological Process，BP）366 條，細胞組分（Cellular Component，CC）36 條，分子功能（Molecular Function，MF）71 條。靶點主要參與RNA 聚合酶II 啟動子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、參與炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細胞增殖和細胞凋亡、免疫應(yīng)答、脂多糖應(yīng)答反應(yīng)、調(diào)節(jié)血管生成及對缺氧反應(yīng)等生物學(xué)進程，主要在胞外空間、細胞核線粒體等區(qū)域發(fā)揮作用，主要參與蛋白質(zhì)、酶和轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合、細胞因子及蛋白質(zhì)二聚化活性等MF。見圖6。

圖6 GO富集分析氣泡圖

潛在靶點KEGG富集分析得到100條相關(guān)信號通路，藥物-疾病共同靶點主要參與：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)直腸癌、癌癥中的蛋白多糖、癌癥中的途徑、HTLVI感染、甲型流感、乙型肝炎、結(jié)核、阿米巴病、弓形蟲、恰加斯?。绹F蟲?。?、利什曼病、百日咳、沙門氏菌感染、TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、破骨細胞分化、PI3K Akt 信號通路、細胞因子-細胞因子-受體相互作用、MAPK信號通路。見圖7。

圖7 KEGG富集分析

將篩選得到的“杜仲-牛膝”有效成分及藥物與LDH的共同作用靶點和靶點參與數(shù)量前20的信號通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 進行可視化分析，同時利用軟件內(nèi)數(shù)據(jù)分析插件進行網(wǎng)絡(luò)特征分析，節(jié)點顏色及大小反映重要程度，得到節(jié)點共119 個，相互作用關(guān)系623條。見圖8。

圖8 成分-疾病-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

腰椎間盤突出癥歸屬于中醫(yī)學(xué)“腰痛”“痹病”的范疇，西醫(yī)對癥治療的不良反應(yīng)較多，而疾病早期及時的中醫(yī)藥干預(yù)能有效改善癥狀，減輕患者心理及身體負(fù)擔(dān)，改善生活質(zhì)量。其中杜仲-牛膝作為治療LDH的常用藥對，臨床使用頻率高且療效顯著。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的相關(guān)理論及技術(shù)，研究了“杜仲-牛膝”聯(lián)合治療LDH的分子作用機制。

通過篩選得到“杜仲-牛膝”有效成分共45種，有效成分作用靶點共287個，其中治療LDH的潛在靶點62 個。根據(jù)構(gòu)建的“藥物-疾病-靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖，杜仲-牛膝治療LDH 的主要作用成分有槲皮素（quercetin）、山奈酚（aempferol）、漢黃芩素、β-胡蘿卜素、去氫雙丁香酚等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，槲皮素具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性，能促進小鼠脾淋巴細胞的增殖，增強小鼠免疫功能，又能抑制其T、B 細胞的增殖，抑制TNF-α、IL-6、INF-γ等促炎因子的分泌[15]，主要通過調(diào)控PI3K/AKT、NFκB 等信號通路抑制細胞炎癥過程[16]。山奈酚具有抗炎、抗氧化、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用。蔡美云等[17]研究表明，山奈酚能通過已知p38 MAPK 小號通路的激活進而發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護作用。鄒雪蓮等[18]研究表明，山奈酚作為Nrf2 激活劑參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高細胞對氧化損傷的保護作用。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素可通過調(diào)節(jié)MLCK/MLC、NF-kB、Nrf2、Hif-1α、ERK 和STAT3 等相關(guān)信號通路途徑，進而發(fā)揮抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用[19]。β-胡蘿卜素是維生素A的前體，具有抗氧化、增強機體免疫、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、預(yù)防癌癥等功能[20]，其主要通過調(diào)節(jié)NF-κB、JAKSTAT 等信號通路發(fā)揮作用。去氫雙丁香酚具有抗炎、抗氧化作用，能影響MAPK-JNK/MAPK、VAChT和STAT3 等信號通路，降低IL-6、IL-1β 等炎癥因子，以及具有DPPH 自由基清除活性，并減少LPS 刺激細胞釋放的NO，進而發(fā)揮抗氧化作用[21-22]。

藥物-疾病共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果中，Degree值前10分別為IL6、TNF、IL1B、ALB、FN1、MMP9、AKT1、JUN、PTGS2、TP53。白細胞介素（interleukin，IL）能通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及抑制MMPs 中的蛋白多糖合成而作用于椎間盤[23]。其中IL-6 是反映炎癥程度的重要指標(biāo)，促進巨噬細胞和淋巴細胞分泌炎性因子，通過干預(yù)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）的活性影響椎間盤生物功能；IL-1β 能通過干預(yù)NF-KB/p65信號通路，調(diào)節(jié)人體髓核細胞中聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的表達[24]。TNF-α 通過促進炎癥因子的釋放，同時增加血管通透性，促進破骨細胞增殖，導(dǎo)致軟骨細胞凋亡，從而引起椎間盤退變[25-26]。ALB作為維持機體營養(yǎng)和滲透壓的重要蛋白質(zhì)，既可以用于評估營養(yǎng)狀態(tài)，也能用于區(qū)分炎癥反應(yīng)程度[27]。FN1 能干預(yù)VEGF、PI-3K/Akt2 等信號通路，參與細胞黏附、細胞骨架蛋白的調(diào)節(jié)[28]。AKT1 主要調(diào)節(jié)細胞凋亡、血管損傷。MMP9 主要通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)降解，參與椎間盤退變進程?！岸胖?牛膝”藥物治療LDH疾病的關(guān)鍵靶點蛋白主要參與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細胞凋亡、調(diào)節(jié)血管通透性等生物過程。

生物富集分析結(jié)果顯示，“杜仲-牛膝”治療LDH主要涉及的信號通路包括TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、破骨細胞分化、PI3K-Akt 信號通路、MAPK信號通路等，主要涉及細胞分化和凋亡、炎癥反應(yīng)相關(guān)及代謝（如內(nèi)分泌、氧化應(yīng)激等）等相關(guān)生物學(xué)進程。TNF（腫瘤壞死因子）主要引起細胞凋亡，目前主要研究的有TNF-α 和TNF-β 兩大類，TNF 相關(guān)信號通路主要參與細胞凋亡、調(diào)節(jié)機體免疫及炎癥反應(yīng)等進程，椎間盤中髓核細胞產(chǎn)生的TNF-α是引起椎間盤退變的主要炎性物質(zhì)之一，其作用主要表現(xiàn)在可增加椎間盤細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的有效表達，并使基質(zhì)中的蛋白多糖、彈性蛋白及膠原等大量減少[5]。Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）相關(guān)信號通路主要與免疫應(yīng)答相關(guān)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。TLRs 的激活既可誘導(dǎo)先天性炎癥反應(yīng)，也可激活抗原適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)。目前研究已證明，活化TLRs 信號傳導(dǎo)途徑主要有兩條：一種是由MyD88銜接蛋白介導(dǎo)的MyD88依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終誘導(dǎo)炎癥細胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和趨化因子的基因表達和釋放；另外一種是MyD88 非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終促進抗炎因子如IFN-α、IFN-β、IL-10 和TGF-β 等的釋放[29-30]。破骨細胞分化主要與OPG/RANKL/RANK、NFkB、c-src-PI3K-Akt、MAPK、CN/NFAT、IDO/Tryptophan 等相關(guān)信號通路相關(guān)[31]。PI3K-Akt信號通路一直以來作為研究熱點，主要參與細胞凋亡、調(diào)節(jié)炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)[32]。MAPK信號通路主要包含細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、c-Jun N末端激酶（JNK）和p38 MAPK等，參與調(diào)節(jié)機體炎癥、細胞增殖分化及細胞凋亡等生物過程[33]。

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)“杜仲-牛膝”通過多成分、多靶點、多通路發(fā)揮抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)細胞增殖分化及細胞凋亡的藥理作用治療LDH，從靶點分子層面為藥物作用于疾病提供了參考。此次研究既分析了“杜仲-牛膝”的主要成分及作用靶點，為進一步研究藥物治療不同疾病做基礎(chǔ)；同時分析了LDH疾病的相關(guān)靶點基因，可進一步研究疾病的相關(guān)信號通路，基于信號通路挖掘相關(guān)治療藥物，同時兩者結(jié)合，為杜仲-牛膝治療LDH 進一步的實驗研究及臨床應(yīng)用提供參考思路。