電針干預(yù)慢性炎性痛及其焦慮情緒與海馬不同區(qū)域GABA相關(guān)機(jī)制研究

林俊言 何金霞 鄭千姿 邱夢婷 房軍帆 方劍喬 杜俊英

浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院浙江省針灸神經(jīng)病學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310053

根據(jù)國際疼痛研究學(xué)會（International Association for the Study Pain，IASP）對疼痛的定義，疼痛包含了痛感覺和痛情緒雙重含義?，F(xiàn)有研究報道，慢性痛常伴發(fā)負(fù)性情緒，其中50%的慢性痛患者伴有焦慮癥[1]，這對患者的身心造成了極大的影響。目前臨床對于焦慮情緒的治療，仍局限于藥物治療，用于鎮(zhèn)痛以及緩解負(fù)性情緒的優(yōu)化治療方案仍需進(jìn)一步探索。

當(dāng)前大量研究針對疼痛刺激與大腦皮層的反應(yīng)，但是對于邊緣系統(tǒng)與疼痛之間的關(guān)系研究仍相對較少。海馬作為邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，位于丘腦和內(nèi)側(cè)顳葉之間，與疼痛的情緒-動機(jī)有特殊的關(guān)聯(lián)[2-3]。有研究表明，海馬參與疼痛信號的處理過程[4-5]，海馬角1（Cornu Ammonis 1，CA1）、 海馬角3（Cornu Ammonis 3，CA3）以及齒狀回（Dentate Gyrus，DG）三區(qū)與慢性疼痛及疼痛產(chǎn)生的情感障礙密切相關(guān)[6-9]。γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）是腦內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，大腦神經(jīng)遞質(zhì)分泌失調(diào)或神經(jīng)發(fā)育異常，可導(dǎo)致GABA與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸（glutamic acid，Glu）突觸之間傳遞失衡，該失衡與痛情緒的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[10-11]，恢復(fù)GABA能系統(tǒng)對痛情緒的調(diào)控有著重要作用。谷氨酸 脫 羧 酶 （glutamic acid decarboxylase，GAD）是GABA的關(guān)鍵合成酶，有兩種不同的異構(gòu)體，即GAD65和GAD67，可作為監(jiān)測GABA能神經(jīng)傳遞的標(biāo)記物[12]。GABA能神經(jīng)元是多樣化的神經(jīng)元群體，依據(jù)表達(dá)分子標(biāo)記物的不同，GABA能神經(jīng)元主要可分為5個類型，其中表達(dá)小清蛋白（parvalbumin，PV）、生長抑制素 （somatostatin，SOM）、 神經(jīng)肽Y（neuropeptide Y，NPY）的神經(jīng)元群最常見[13]。海馬內(nèi)GABA能神經(jīng)元盡管只占神經(jīng)元總數(shù)的10%～15%，但其群體多樣性仍是皮層回路功能和調(diào)節(jié)方面的主要決定因素[14]。目前，關(guān)于慢性痛及痛情緒與海馬中各區(qū)GABA能神經(jīng)元之間的系統(tǒng)研究尚少見于報道。

電針的鎮(zhèn)痛療效已被廣泛認(rèn)可，被應(yīng)用于治療多種急性和慢性疼痛疾病，對疼痛相關(guān)的痛情緒也具有良好的干預(yù)作用[15-16]。前期研究中已證實(shí)電針干預(yù)慢性痛及其相關(guān)痛情緒的前扣帶皮層（anterior cingulate cortex，ACC）GABA的相關(guān)機(jī)制[17-18]，而作為邊緣系統(tǒng)重要組成部分的海馬，電針干預(yù)海馬GABA能系統(tǒng)的機(jī)制尚不清楚。

本研究通過建立完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA）誘導(dǎo)的大鼠慢性炎性痛模型，造模后進(jìn)行電針干預(yù)，觀察其對大鼠機(jī)械痛閾（paw withdrawal threshold，PWTs）、焦慮行為，以及海馬CA1、CA3、DG區(qū)中NPY、PV、SOM、GAD65/67及原癌基因蛋白（cellular protooncogene Fos，c-Fos）表達(dá)的影響，以期部分闡明電針干預(yù)痛情緒的海馬GABA能系統(tǒng)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 32只雄性清潔級健康SD大鼠，體質(zhì)量（220±10）g，購于中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK （滬）2018-0006]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（浙）2018-0012]。 飼養(yǎng)溫度22～26 ℃，濕度60%，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，保持飼養(yǎng)環(huán)境安靜，通風(fēng)良好，12 h∶12 h晝夜循環(huán)光照。本實(shí)驗(yàn)所有操作均符合中華人民共和國《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》。

1.1.2 試劑與器材 CFA購于美國Sigma公司（批號：F5881）；兔抗PV多克隆抗體、兔抗NPY多克隆抗體、兔抗GAD65+67單克隆抗體、小鼠抗c-Fos單克隆抗體、驢抗小鼠IgG抗體、驢抗兔IgG抗體均購于美國Abcam 公 司 （ 批 號 ：ab11427、ab10980、ab183999、ab208942、ab150109、ab150061）； 兔抗SOM多克隆抗體購于Gene Tex公司（批號：GTX133119）；含4，6-二脒基-2-苯基吲哚 （4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI）的抗熒光淬滅封片液購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號：P0131）。

von-Frey纖維絲購于美國Stoelting公司；HANS-200A韓氏穴位神經(jīng)刺激儀購于南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司；高架O迷宮（elevated zero maze，EZM）為深圳瑞沃德公司產(chǎn)品；Smart 3.0分析軟件購于美國Panlab公司；不銹鋼一次性針灸針購于蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；蔡司光學(xué)顯微鏡為德國ZEISS公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將大鼠完全隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、電針治療組、假電針治療組，每組8只。除空白對照組外，所有大鼠右側(cè)足底中心皮下注射CFA 0.1 mL，以造模后1 d，PWTs顯著下降為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)；空白對照組注射等量的0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 干預(yù)措施 電針治療組與假電針治療組于造模后26 d開始干預(yù)。電針治療組：采用0.25 mm×13 mm針灸針刺入大鼠雙側(cè)“后三里”穴（膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨頭下約5 mm處）和“昆侖”穴（后肢外踝與跟腱之間的凹陷中），連接HANS-200A韓氏穴位神經(jīng)刺激儀，選用疏密波、頻率2/100 Hz、強(qiáng)度0.5～1.5 mA（每10 min增加0.5 mA），治療30 min，每日1次，連續(xù)4 d；假電針治療組僅將針灸針刺入相同穴位皮下不通電，其操作同電針治療組。其余兩組不作干預(yù)。

1.2.3 PWTs檢測 分別在造模前、造模后1、3、7、14、21、28 d，將大鼠放置于有透明有機(jī)玻璃的金屬網(wǎng)箱中，大小20 cm×20 cm×15 cm，適應(yīng)環(huán)境30 min。 在安靜的狀態(tài)下，參考Chaplan等[19]建立的方法，以von-Frey纖維絲測定大鼠右后足的PWTs。 用0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0、26.0 g纖維絲套組， 從4.0 g開始，避開足墊，刺激大鼠的右后足中心，使纖維絲“S”型彎曲并保持6～8 s，若大鼠抬腿或舔腳則被視為陽性，用“X”表示，更換為相鄰的低克數(shù)纖維絲。若無反應(yīng)，用“O”表示，更換為相鄰的高克數(shù)纖維絲。從第1次出現(xiàn)“XO”或“OX”開始再檢測4次，獲得一連串的“OX”組合。 PWTs（g）=（10[Xf+κδ]）/10000計(jì)算。 如果連續(xù)5次刺激是“X”則為4.0 g，若連續(xù)5次刺激是“O”則為26.0 g。

1.2.4 EZM實(shí)驗(yàn) 在造模后29 d進(jìn)行EZM實(shí)驗(yàn)，觀察大鼠的焦慮行為。操作間保持較暗的光線，溫度恒定在23℃左右，在安靜的環(huán)境中進(jìn)行，測試前將大鼠置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中2 h以適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)開始時，將大鼠頭朝開放臂的方向放入開放臂和閉合臂交界處，記錄5 min探索情況。用Smart 3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算大鼠5 min中的總運(yùn)動距離、開放臂運(yùn)動距離、開放臂進(jìn)入次數(shù)和開放臂停留時間。每次實(shí)驗(yàn)后用70%乙醇溶液擦拭實(shí)驗(yàn)場地，以避免前次大鼠殘留氣味的影響。

1.2.5 取樣與樣本處理 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完成后，大鼠以2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，用注射針頭從心尖灌注4℃預(yù)冷的氯化鈉溶液，至肝臟完全變色，再灌注4%多聚甲醛。冰上快速取出全腦，置于4%多聚甲醛溶液中固定6 h，繼而移入15%、30%蔗糖溶液梯度脫水，液氮速凍后-80℃保存。取出大鼠全腦并包埋，-20℃下按照《大鼠腦立體定位圖譜（第6版）》[20]，取含有海馬的組織行25 μm切片，-80 ℃保存待用。

1.2.6 免疫熒光檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 從-80℃冰箱中取出切片，37℃復(fù)溫1 h，以pH 7.40～7.44的含有吐溫的Tris緩沖鹽溶液漂洗。加入10%驢血清37℃孵育1 h，分別加入用10%驢血清稀釋的兔抗PV（1∶200）、NPY（1∶800）、SOM（1∶500）、GAD65/67（1∶500）和小鼠抗c-Fos（1∶500）一抗，4 ℃孵育過夜。 復(fù)溫1 h后漂洗，加入Alexa Fluor 488標(biāo)記驢抗兔和Alexa Fluor 488標(biāo)記驢抗小鼠二抗，37℃孵育1 h，再次避光漂洗，風(fēng)干后用含DAPI的抗熒光淬滅封片液封片。蔡司光學(xué)顯微鏡下攝取5倍拼圖和10倍局部圖像，用Photoshop計(jì)算DG、CA1、CA3區(qū)上述指標(biāo)的陽性細(xì)胞數(shù)或陽性面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較，滿足方差齊性時采用SN-K檢驗(yàn)，方差不齊時采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠PWTs比較 造模前各組大鼠基礎(chǔ)PWTs差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 從造模后1 d至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，模型對照組大鼠PWTs均顯著低于空白對照組（P＜0.01）。 在造模后26～28 d電針介入后，電針治療組大鼠PWTs較模型對照組顯著升高（P＜0.01），但仍低于空白對照組（P＜0.01）。假電針治療組大鼠PWTs與模型對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠PWTs變化情況Fig.1 The changes of the PWTs in each group

2.2 各組大鼠焦慮行為比較 和空白對照組比較，模型對照組大鼠進(jìn)入開放臂運(yùn)動距離、開放臂停留時間和開放臂進(jìn)入次數(shù)顯著減少（P＜0.01）；與模型對照組比較，電針治療組大鼠進(jìn)入開放臂運(yùn)動距離、開放臂停留時間和開放臂進(jìn)入次數(shù)均顯著增加（P＜0.01）。假電針對各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯的干預(yù)作用。各組大鼠的總運(yùn)動距離差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。結(jié)果顯示，模型對照組大鼠具有明顯的焦慮行為，電針介入能有效緩解大鼠的焦慮行為。

圖2 各組大鼠的EZM行為學(xué)結(jié)果Fig.2 The behavior results of the EZM in each group

2.3 各組大鼠雙側(cè)海馬c-Fos表達(dá)比較 對于DG區(qū)，與空白對照組比較，模型對照組雙側(cè)c-Fos陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少（P＜0.01）；與模型對照組比較，電針治療組雙側(cè)c-Fos陽性細(xì)胞表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與電針治療組比較，假電針治療組顯著減少（P＜0.01）。

對于CA1區(qū)和CA3區(qū)，與空白對照組比較，模型對照組雙側(cè)c-Fos陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少（P＜0.01，P＜0.05）；與模型對照組比較，電針治療組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與電針治療組比較，假電針治療組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見圖3。

圖3 各組c-Fos陽性細(xì)胞表達(dá)Fig.3 c-Fos positive cells in each group

2.4 各組大鼠雙側(cè)海馬GAD65/67陽性面積比較 對于DG區(qū)，與空白對照組比較，模型對照組健側(cè)GAD65/67陽性面積增大（P＜0.05），患側(cè)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型對照組比較，電針治療組雙側(cè)GAD65/67陽性面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與電針治療組比較，假電針治療組雙側(cè)GAD65/67陽性面積顯著增大（P＜0.01）。

對于CA1區(qū)和CA3區(qū)，各組大鼠雙側(cè)GAD65/67陽性面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 各組GAD65/67陽性面積Fig.4 GAD65/67 positive area in each group

2.5 各組大鼠雙側(cè)海馬NPY陽性細(xì)胞比較 對于DG區(qū)，與空白對照組比較，模型對照組雙側(cè)NPY陽性細(xì)胞明顯增多（P＜0.05）；與模型對照組比較，電針治療組雙側(cè)NPY陽性細(xì)胞顯著減少（P＜0.01）；與電針治療組比較，假電針治療組雙側(cè)NPY陽性細(xì)胞顯著增多（P＜0.01）。

對于CA1區(qū)，與空白對照組比較，模型對照組雙側(cè)NPY陽性細(xì)胞明顯增多（P＜0.01）；與模型對照組比較，電針治療組雙側(cè)NPY陽性細(xì)胞顯著減少（P＜0.01）；與電針治療組比較，假電針治療組健側(cè)NPY陽性細(xì)胞顯著增多（P＜0.05），假電針治療組患側(cè)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

對于CA3區(qū)，與空白對照組比較，模型對照組雙側(cè)NPY陽性細(xì)胞明顯增多（P＜0.01）；與模型對照組比較，電針治療組健側(cè)NPY陽性細(xì)胞無顯著差異（P＞0.05），患側(cè)顯著減少（P＜0.01）；與電針治療組比較，假電針治療組健側(cè)NPY陽性細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），患側(cè)顯著增多（P＜0.01）。 見圖5。

圖5 各組大鼠NPY陽性細(xì)胞表達(dá)Fig.5 NPY positive cells in each group

2.6 各組大鼠雙側(cè)海馬PV與SOM陽性細(xì)胞數(shù)量比較在DG、CA1和CA3區(qū)，各組PV與SOM陽性細(xì)胞數(shù)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見圖6、7。

圖6 各組PV陽性細(xì)胞表達(dá)Fig.6 PV positive cells in each group

圖7 各組SOM陽性細(xì)胞表達(dá)Fig.7 SOM positive cells in each group

3 討論

慢性疼痛患者易伴發(fā)焦慮、抑郁等情緒障礙。CFA誘導(dǎo)的慢性炎性痛模型是目前應(yīng)用最廣泛的慢性炎性痛模型，其產(chǎn)生的炎性痛穩(wěn)定而持久，便于研究疼痛及其伴發(fā)的情緒異常。本研究中，造模后1～28 d觀察到大鼠PWTs顯著下降，提示造模成功。EZM實(shí)驗(yàn)是評估嚙齒類動物焦慮樣狀態(tài)的經(jīng)典行為學(xué)方法之一[21]。本研究提示，造模后1～28 d時模型對照組大鼠PWTs顯著降低，在EZM中進(jìn)入開放臂次數(shù)、時間、運(yùn)動距離顯著減小，與研究結(jié)果相似[22]。電針干預(yù)能起到鎮(zhèn)痛和抗焦慮情緒的作用，具體表現(xiàn)在PWTs增加，進(jìn)入開放臂次數(shù)和時間增加等，與課題組既往的研究結(jié)果相吻合[23]。

海馬是參與疼痛信號處理的重要腦區(qū)之一[9，24]，也是情緒加工神經(jīng)環(huán)路的重要組成部分，能夠整合加工情緒信息[25]。慢性疼痛可能通過改變海馬的結(jié)構(gòu)或者功能活動，進(jìn)而對患者的情緒和認(rèn)知功能產(chǎn)生影響[26]。海馬不同分區(qū)有不同的功能，這些區(qū)域共同參與海馬疼痛信號處理和情緒控制環(huán)路。本研究選擇DG、CA1和CA3三個區(qū)域作為檢測區(qū)域。c-Fos被認(rèn)為是神經(jīng)活動和痛覺處理的標(biāo)記物[27]，多項(xiàng)研究探索過疼痛相關(guān)c-Fos的表達(dá)，但呈現(xiàn)結(jié)果卻大不相同。Aloisi等[28]研究發(fā)現(xiàn)，注射甲醛后大鼠海馬DG區(qū)c-Fos顯著增加。Funahashi等[29]發(fā)現(xiàn)，對大鼠左下切牙進(jìn)行有害機(jī)械牙髓刺激，海馬雙側(cè)CA1區(qū)c-Fos表達(dá)受到抑制。本研究觀察到，模型對照組大鼠雙側(cè)海馬各區(qū)c-Fos陽性細(xì)胞表達(dá)均減少，這表明海馬神經(jīng)元活性在慢性炎性痛模型中被抑制，而電針無治療作用則提示電針治療慢性痛及伴發(fā)情緒障礙可能與調(diào)控海馬層面c-Fos陽性細(xì)胞表達(dá)無關(guān)。

大腦的功能正常有賴于興奮性、抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的平衡，即需要GABA抑制性神經(jīng)遞質(zhì)和Glu興奮性神經(jīng)遞質(zhì)保持平衡[30]。GABA能神經(jīng)元作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)元，其功能障礙與疼痛發(fā)生機(jī)制和焦慮樣行為密切相關(guān)[31-32]。GABA由GABA能神經(jīng)元中GAD合成，GAD的兩種亞型GAD65和GAD67，是兩個獨(dú)立基因的產(chǎn)物[33]。SOM、PV和NPY中間神經(jīng)元是GABA中間神經(jīng)元的三種主要亞型[17]。SOM是一種內(nèi)源性非阿片類神經(jīng)肽，具有鎮(zhèn)痛作用[34]。PV神經(jīng)元在中樞系統(tǒng)分布廣泛，Kang等[35]研究發(fā)現(xiàn)，ACC中PV神經(jīng)元特異性激活后，可以緩解由CFA造成的機(jī)械超敏反應(yīng)。在本研究中，模型對照組海馬各區(qū)GAD、SOM、PV表達(dá)均無明顯變化，電針治療組大鼠海馬各區(qū)GAD、SOM、PV表達(dá)相較于模型對照組無明顯變化。因此，筆者猜測海馬水平的GAD、SOM、PV未參與慢性炎性痛模型大鼠的疼痛及伴發(fā)焦慮情緒形成，因此電針干預(yù)對其表達(dá)也未起到調(diào)節(jié)作用。

NPY是所有哺乳動物中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中一種高度保守的內(nèi)源性肽，與慢性疼痛密切相關(guān)[36]。Okabe等[37]研究提示，坐骨神經(jīng)慢性收縮性損傷的大鼠神經(jīng)性疼痛模型中，下丘腦弓狀核中NPY表達(dá)下降。潘集陽等[38]發(fā)現(xiàn)，高劑量咖啡因誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生焦慮樣行為，其海馬NPY表達(dá)顯著增多。本研究中，模型對照組大鼠海馬各區(qū)域NPY陽性細(xì)胞表達(dá)均上調(diào)，由此猜測海馬水平的NPY參與慢性炎性痛模型大鼠的疼痛及其相關(guān)負(fù)性情緒形成。已有研究表明，對于CFA誘導(dǎo)的慢性炎性痛模型大鼠，電針治療可能通過影響脊髓組織中NPY的表達(dá)，從而發(fā)揮抗傷害作用，改善疼痛感受[39]。本研究中，電針治療后大鼠海馬NPY陽性細(xì)胞表達(dá)顯著下降，由此推斷，電針干預(yù)慢性炎性痛模型大鼠可能通過下調(diào)海馬層面NPY表達(dá)水平，調(diào)節(jié)疼痛及情緒障礙。

綜上所述，通過建立CFA慢性炎性痛模型，觀察大鼠PWTs、焦慮樣行為，本研究發(fā)現(xiàn)慢性炎性痛大鼠海馬各區(qū)域NPY表達(dá)增加，而電針治療顯著降低NPY表達(dá)，并能夠有效緩解大鼠疼痛和焦慮樣行為。因此，電針對CFA誘導(dǎo)的慢性炎性痛的鎮(zhèn)痛和抗焦慮作用可能與下調(diào)海馬CA1、CA3和DG區(qū)NPY陽性細(xì)胞表達(dá)相關(guān)。