利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯銀腺楊84K LAZY基因

楊海峰， 甘曉雪， 薄高峰， 王佳琪， 郝 璞， 張富滿， 王文功， 韓傲霜

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學林學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

分枝角度是形成理想株型的重要組成部分，對植物的生物量、經(jīng)濟林木的產(chǎn)量、固碳量、景觀效果均具有重要影響。分枝角度的大小受基因、內(nèi)源激素以及外界環(huán)境等多種因素調(diào)控，其中，基因調(diào)控是重要的內(nèi)部因素。研究發(fā)現(xiàn)，基因家族對分枝角度的調(diào)控尤為顯著，隸屬于基因家族的基因，最早由Takahashi等發(fā)現(xiàn)并確認其與分枝角度具有相關性，經(jīng)Kishimoto等研究確定水稻中的基因位于11號染色體近著絲點位置，在pd56和M265之間的68 kb區(qū)域中。隨著對基因的進一步深入研究，多位科學家先后從水稻()、高粱()、小麥()、玉米()、擬南芥()等植物中發(fā)現(xiàn)了基因的同源基因，從而證明了基因并不是單子葉植物所特有的。2017年，Xu 等以窄冠白楊為材料，分析了1基因在不同組織部位的表達情況，發(fā)現(xiàn)1基因在莖中最多，腋芽、葉中次之，根中表達量最少，這與Overbeek對玉米突變體的研究結果相一致，由此證明基因主要參與了植株地上部分的負向地性重力反應。

CRISPR/Cas9技術通過小向?qū)NA(sgRNA)介導和Cas9 蛋白切割實現(xiàn)對靶基因的編輯(堿基插入、刪除、替換等)，從而實現(xiàn)基因敲除。因其具有簡便、高效、低價等優(yōu)點，被廣泛應用于水稻、小麥、擬南芥、煙草()、毛白楊()等植物的研究中；其中，在水稻、小麥、擬南芥中都獲得了穩(wěn)定的基因編輯突變體，為植物基因功能研究和遺傳改良做出杰出貢獻。但目前為止，大部分研究僅是對特定位點的突變，在目標基因上精準編輯的效率很低。近年來，有多位科學家在玉米、大豆[(Linn.) Merr.]、水稻、擬南芥中嘗試了同源基因的精準編輯。例如，Svitashev等成功通過基因槍轉化法對米未成熟胚中的、等基因進行精準編輯。Zhao 等利用雙元RNA向?qū)У?CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對基因的一個特定區(qū)段進行了定點替換。因此，開發(fā)出高效、精準的CRISPR/Cas9基因編輯技術將是現(xiàn)代基因組學靶向修飾工作的巨大進步，且具有廣闊的應用前景。

本研究以銀腺楊84K為研究材料，從中克隆獲得、、基因的基因組部分序列，設計靶點，構建基因編輯載體，轉化84K楊，獲得轉基因株系，以期為分析基因功能提供研究材料，奠定研究基礎，為深入研究CRISPR/Cas9系統(tǒng)在木本植物中的應用和技術改良提供線索，為楊樹分子育種及品種改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

銀腺楊84K(×84K)無菌苗，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學林木遺傳育種教研室保存；pEn-Chimera入門載體和pDE-CAS9-NPTⅡ表達載體質(zhì)粒由美國農(nóng)業(yè)部林務局西南太平洋工作站林木遺傳所贈送；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞和農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，由筆者所在實驗室制備。

1.2 LAZY1基因克隆及靶點設計

使用BioEdit軟件，以銀腺楊84K的全基因組DNA數(shù)據(jù)庫創(chuàng)建本地數(shù)據(jù)庫，以沙柳、、基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS)序列分別作為查詢序列，進行本地BLAST搜尋，獲得3個同源基因序列，分別命名為、、。根據(jù)這3個同源基因的序列設計上下游引物，預期產(chǎn)物長度分別為1 836、2 074、1 374 bp。試驗用到的引物序列詳見表1。

表1 本研究所用引物

采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取野生84K楊基因組DNA為模板，利用-F和-R、-F和-R、-F和-R分別為引物，進行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收后與pMD 19-T載體連接并測序獲得84K楊中、、基因在2條同源染色體上的序列。

利用銀腺楊84K基因組數(shù)據(jù)庫及克隆獲得的完整序列信息，將、、基因的第1個外顯子序列分別在基因編輯靶點在線設計網(wǎng)站(https：//zlab.bio/guide-design-resources)上設計、篩選出得分最高的靶點序列，將靶點正向序列5′端添加ATTG堿基，靶點的反向互補序列5′端添加AAAC堿基，送至中美泰和生物技術(北京)有限公司合成引物。

1.3 LAZY基因敲除載體構建

對pEn-Chimera入門載體質(zhì)粒進行酶切，回收酶切產(chǎn)物，獲得線性化pEn-Chimera入門載體。采用重組PCR的方法將添加接頭的2條靶點序列進行雙鏈互補，并與線性化pEn-Chimera載體連接，轉化DH5α大腸桿菌，測序鑒定。將構建成功的入門載體pEn-Chimera和表達載體pDE-CAS9-NPTⅡ進行同源置換，轉化DH5α大腸桿菌，對菌落進行PCR鑒定，并測序檢測。將成功構建的表達載體轉化農(nóng)桿菌GV3101菌株。

1.4 銀腺楊84K葉盤法轉化及轉基因植株的檢測

活化攜帶有表達載體的農(nóng)桿菌菌株，振蕩培養(yǎng)至吸光度為0.6～0.8時，重懸菌液，用于侵染。取培養(yǎng)3～4周無菌苗中上部葉片，垂直葉脈劃傷，置于重懸液中，50 r/min振蕩侵染15 min。將葉片置于共培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3 d。轉移至分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，2～3周繼代1次。待葉片長出愈傷組織并分化出芽，芽高2～3 cm時，切下置于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3周即可生根，同時利用生根培養(yǎng)基進行單株增殖擴繁。對獲得的抗性株系分別提取DNA，以SS61引物和靶點反向序列為引物進行PCR擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，篩選陽性植株。

1.5 基因編輯效率的檢測

以轉基因株系DNA為模板，加入引物-F和-R進行PCR序列擴增，獲得目標產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后與pMD 19-T載體連接，轉化DH5α大腸桿菌，對菌落進行PCR鑒定，并測序檢測。利用DNAMAN(Version 7.0)對測序結果與靶點序列進行比對，分析編輯效率。

2 結果與分析

2.1 LAZY-1基因組序列的克隆與靶點設計

利用銀腺楊84K的基因組數(shù)據(jù)庫結合沙柳、、基因的CDS序列，經(jīng)比對獲得3個基因的同源序列，分別命名為、、。以野生型84K楊的DNA為模板，-F和-R、-F和-R、-F和-R 分別為上下游引物，克隆獲得、、基因組部分同源序列，該序列為包含上述基因前2個外顯子完整序列的基因組序列。

將上述3個基因的第1個外顯子序列分別在基因編輯靶點在線設計網(wǎng)站(https：//zlab.bio/guide-design-resources)上提交設計；獲得3個高分靶點序列(圖1)。該靶點序列在目標基因上無單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點，GC含量為40%，前間隔序列鄰近基序(PAM)標識位點為NGG(N可以是A、T、G、C中的任意堿基)，與楊樹中同源關系較近的基因同源序列比對結果顯示，錯配堿基數(shù)為3～4個，說明該靶位點特異性較高，符合敲除靶點的設計要求。

2.2 LAZY1基因編輯載體構建

將互補雙鏈的靶點序列連接線性化的pEn-Chimera入門載體，經(jīng)PCR鑒定，目標條帶與預計的369 bp目標片段長度一致(圖2-a)。測序結果表明，、、靶點序列成功進入 pEn-Chimera 入門載體，可進行下一步表達載體構建。

將攜帶有基因靶點序列的pEn-Chimera入門載體與pDE-CAS9-NPTⅡ表達載體進行同源置換，PCR鑒定結果表明，目標條帶與預計的 933 bp 目標片段長度一致(圖2-b)。測序分析結果表明，靶點序列及其驅(qū)動元件已成功置換進 pDE-CAS9-NPTⅡ 表達載體中，可用于銀腺楊84K的基因轉化。

2.3 轉基因株系獲得及PCR鑒定

將構建的3個基因編輯表達載體(：：、：：、：：)，通過農(nóng)桿菌介導法轉化84K楊，分別獲得21、17、12株抗性株系(圖3)。為檢測單基因編輯的轉化效率，本研究對轉化：：載體的21株抗性植株進行PCR鑒定，檢測結果表明，共13個株系為陽性植株，PCR陽性鑒定陽性率為61.9%(圖4)。

2.4 轉基因植株靶點序列編輯效率分析

對的13個轉基因株系進行靶點序列測序分析，結果表明，在1號、5號、9號株系中均發(fā)生不同程度的堿基缺失，其中1號株系靶點的第16、17個堿基發(fā)生缺失，5號株系靶點的第15個堿基發(fā)生缺失，9號株系靶點的第18個堿基發(fā)生插入，靶點編輯效率為23.07%，均為雜合突變體(表2)。

表2 PagLAZY1a基因編輯株系的靶標位點序列分析

3 討論

植物分枝角度和分枝方向在植物形態(tài)建成過程中具有重要作用，與植物生物量和作物產(chǎn)量密切相關。其中，有關分枝角度調(diào)控的分子層面研究目前仍以高粱、水稻、小麥等草本模式植物為主，在木本植物中的研究相對較少，尚缺乏系統(tǒng)性研究。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對銀腺楊84K分枝角度相關基因基因進行敲除，獲得抗性植株，檢測靶標位點，分析編輯效率，旨在為后續(xù)基因家族在楊樹中的基因功能研究提供基礎參考數(shù)據(jù)。

CRISPR/Cas系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的能夠?qū)崿F(xiàn)對基因組精準定點編輯的技術，相對于其他基因編輯技術效率更顯著，操作更便捷，但在某些植物中編輯效率較低。本研究按照sgRNA的設計原則，設計基因靶標序列，長度均為20 nt，轉化銀腺楊84K后對陽性植株進行靶標序列檢測，發(fā)現(xiàn)靶點編輯效率僅為23.07%，效率較低，可能存在2個方面的原因。首先，靶標序列的長度對編輯效率有影響。據(jù)Fu等的研究顯示，采用小于20 nt的短sgRNA進行基因打靶試驗，可以有效降低脫靶風險，提高編輯效率。Chen等比較不同長度(18、19、20個堿基) sgRNA的切割效率，發(fā)現(xiàn)長度為 19 個堿基的sgRNA具有最高的切割效率。其次，選用合適的啟動子能夠有效提升CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯效率。本研究利用來自擬南芥的AtU6-26啟動子構建表達載體，雖然成功獲得基因編輯成功株系，表明該啟動子可應用于銀腺楊84K的CRISPR/Cas9系統(tǒng)研究，但編輯效率較低，可能有啟動子的影響。因此，在后續(xù)基因編輯工作中，將采用19 nt靶點序列，同時采用來自84K楊的啟動子來構建基因編輯載體，預計能夠有效提高基因編輯效率。

4 結論

本研究利用銀腺楊84K為材料，成功構建了3個同源基因的基因編輯表達載體，獲得13株轉化：：載體的陽性株系，其中3個株系基因編輯成功，編輯效率為23.07%。該研究結果可以為基因功能的研究和楊樹分子育種提供理論依據(jù)，為CRISPR/Cas9系統(tǒng)在銀腺楊84K中的應用做了初步探索，同時，為改良CRISPR/Cas9系統(tǒng)提供了參考。