高敏HBV-DNA檢測在低病毒血癥患者抗病毒治療監(jiān)測中的應(yīng)用研究

龍黎 張卿 熊晏 羅新華 邵和軍

(貴州省人民醫(yī)院感染科，貴州 貴陽 550002)

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一項(xiàng)全球性公共衛(wèi)生問題，但不同地區(qū)的流行強(qiáng)度差異很大。據(jù)估計(jì)，目前我國一般人群HBsAg流行率為5%～6%，慢性乙型病毒性肝炎患者約2 000～3 000萬例[1]。HBV慢性感染現(xiàn)已成為我國肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最主要的原因[2]。核苷(酸)類抗病毒藥物通過抑制乙肝病毒復(fù)制，改善肝臟炎癥，能有效逆轉(zhuǎn)肝硬化并降低HCC的發(fā)生率。在抗病毒治療適應(yīng)癥選擇及療效判斷中，HBV-DNA檢測扮演重要角色。目前，國內(nèi)各醫(yī)療單位常用的HBV-DNA定量檢測方法的靈敏度在200～1000IU/mL之間，然而，隨著臨床研究的深入，發(fā)現(xiàn)許多經(jīng)過長期抗病毒治療的患者，HBV-DNA水平仍處于低水平復(fù)制狀態(tài)(常常低于現(xiàn)有檢測水平下限)，而這些患者肝硬化進(jìn)展及HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯大于取得持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答的患者[3]。因此，現(xiàn)有的HBV-DNA檢測精度已不能滿足臨床對慢乙肝患者病情評估的需要。我們的研究收集了采用普通熒光定量PCR檢測HBV-DNA水平低于檢測下限(<200 IU/mL)的慢乙肝患者血清標(biāo)本，采用高靈敏度熒光定量PCR試劑再次檢測HBV-DNA水平(檢測下限<10 IU/mL)，并將HBV-DNA水平與HBeAg定量結(jié)果以及肝硬度值進(jìn)行對照分析，以此探討高敏HBV-DNA檢測在慢乙肝低病毒血癥患者抗病毒治療監(jiān)測中的應(yīng)用及意義。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1研究對象 收集2019年12月至2021年6月于貴州省人民醫(yī)院感染科門診或住院治療的共175例慢乙肝患者的臨床資料。其中，男128例，女47例，年齡18～52歲，平均年齡(32±9)歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡為 18 周歲及以上，性別不限；HBsAg陽性至少6個(gè)月；接受抗病毒治療且應(yīng)用國產(chǎn)試劑檢測HBV-DNA均低于檢測下限(<200IU/mL)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他肝炎病毒或人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的患者；合并自身免疫性疾病的患者；肝硬化患者；原發(fā)性肝癌患者；妊娠或哺乳期患者；合并其他嚴(yán)重的慢性疾病患者；目前正在參與其它臨床試驗(yàn)研究患者。所有患者均簽署了知情同意書。

1.2主要儀器與試劑 普通熒光定量PCR檢測試劑為國產(chǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，應(yīng)用Mx3000P型熒光定量PCR儀(美國安捷倫/Agilent Technologies)。高敏熒光定量PCR檢測試劑應(yīng)用Abbott RealTime HBV Amplification Reagent Kit(美國雅培)。Cobas E602 電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)(瑞士羅氏)。乙肝兩對半定量試劑盒(瑞士羅氏)。肝硬度值由FibroScan 502 Touch(ECHOSENS)測量。

1.3方法 將普通熒光定量PCR檢測結(jié)果低于檢測下限(<200IU/mL)的175份血清標(biāo)本采用高敏熒光定量PCR檢測試劑再次進(jìn)行檢測，具體操作和結(jié)果判定參照試劑盒說明書進(jìn)行。同時(shí)對所收集的血清標(biāo)本進(jìn)行HBeAg定量檢測。對所有患者進(jìn)行肝硬度值測量。

2 結(jié) 果

2.1普通熒光定量PCR與高敏熒光定量PCR檢測慢乙肝患者HBV-DNA結(jié)果比較 175份采用普通 PCR 檢測結(jié)果為陰性的慢乙肝患者標(biāo)本中，采用高敏PCR 試劑進(jìn)行復(fù)查，根據(jù)血清HBV-DNA定量水平(IU/mL)，存在以下5種結(jié)果，即>200IU/mL共15例，占比8.5%，100～200IU/mL共17例，占比9.7%，10～100IU/mL共49例，占比28%，<10IU/mL共26例，占比14.9%，陰性68例，占比38.9%。

2.2慢乙肝患者血清HBV-DNA載量與血清HBeAg的關(guān)系 隨著血清HBV-DNA水平的增高，各組血清HBeAg陽性率和水平也存在升高的趨勢。其中，HBV-DNA陰性組血清 HBeAg定量水平顯著低于100～200IU/mL組和>200IU/mL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 慢乙肝患者HBV-DNA載量與HBeAg狀況的關(guān)系

2.3慢乙肝患者血清HBV-DNA載量與肝臟硬度值的關(guān)系 HBV-DNA>200IU/mL組肝硬度值與HBV-DNA陰性組肝硬度值有明顯差異(P=0.023)，其余各組之間比較，差值均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 慢乙肝患者HBV-DNA載量與肝硬度值關(guān)系

3 討 論

通過分泌HBeAg等自身蛋白干擾抗病毒信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而抑制非特異性免疫應(yīng)答的強(qiáng)度以及HBV特異性T細(xì)胞的凋亡及耗竭是乙肝感染慢性化的重要機(jī)制[4]。HBV并不直接殺傷肝細(xì)胞，其引起的免疫應(yīng)答是導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷及炎癥壞死的主要機(jī)制，而炎癥壞死持續(xù)存在或反復(fù)出現(xiàn)是肝硬化甚至HCC發(fā)生發(fā)展的重要因素。隨著恩替卡韋、替諾福韋等一線抗病毒藥物可及性的提高，越來越多的患者得到了有效的抗病毒治療，從而降低了肝硬化和HCC的發(fā)生發(fā)展[5]。

HBV-DNA是HBV病毒學(xué)檢測的重要內(nèi)容，用于評估HBV感染者病毒復(fù)制水平、抗病毒適應(yīng)癥的選擇以及療效的判斷。HBV-DNA的檢測閾值直接影響了對抗病毒療效及停藥指導(dǎo)甚至患者預(yù)后的判斷。國內(nèi)目前大部分醫(yī)療機(jī)構(gòu)HBV-DNA常規(guī)檢測的靈敏度范圍已經(jīng)越來越不能滿足臨床需求。從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，經(jīng)普通熒光定量PCR檢測低于下限(200IU/mL)的175份血清標(biāo)本，通過高敏HBV-DNA檢測，發(fā)現(xiàn)僅有68份為陰性，提示仍有相當(dāng)部分患者經(jīng)過抗病毒治療后仍處于低病毒血癥狀態(tài)。目前，低病毒血癥的危害已經(jīng)得到越來越多的認(rèn)識。例如，韓國一項(xiàng)納入875名慢乙肝患者的回顧性研究中，經(jīng)過長期恩替卡韋抗病毒治療后，仍有高達(dá)377名患者HBV-DNA處于低水平復(fù)制狀態(tài)，在這些HBV-DNA低水平復(fù)制狀態(tài)的慢乙肝感染者，尤其是肝硬化患者中，HCC的發(fā)生率明顯高于那些獲得持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答的患者[6]。國內(nèi)的研究也顯示持續(xù)的低病毒血癥是肝纖維化進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]。因此，高敏HBV-DNA的檢測對于精準(zhǔn)把握乙肝抗病毒治療療效、準(zhǔn)確判斷患者預(yù)后等顯得至關(guān)重要。

HBeAg是乙肝病毒核心顆粒中的一種可溶性蛋白，由HBV-DNA開放讀碼框前C區(qū)編碼。HBeAg陽性被認(rèn)為是病毒復(fù)制活躍且具有較強(qiáng)傳染性的標(biāo)志，HBeAg陰轉(zhuǎn)、抗-HBeAg的出現(xiàn)，標(biāo)志著機(jī)體從免疫清除期進(jìn)入免疫控制期。和HBV-DNA一樣，HBeAg水平也被認(rèn)為是抗病毒治療過程中對核苷(酸)類似物治療反應(yīng)進(jìn)行預(yù)測的有效工具[7]。結(jié)合我們的研究結(jié)果也顯示了HBeAg與HBV-DNA定量水平總體上呈正相關(guān)趨勢。然而，在乙肝病毒感染過程中，在宿主免疫壓力下，可產(chǎn)生免疫逃避株，常見的如前C區(qū)G1896A點(diǎn)突變，這會導(dǎo)致HBeAg表達(dá)的終止，從而出現(xiàn)HBeAg陰性病毒血癥[8]，這與我們檢測結(jié)果中部分患者出現(xiàn)HBeAg陰性，但HBV-DNA仍然可檢出相符合。普通熒光定量PCR試劑一般采用S或C區(qū)等保守段基因進(jìn)行單靶標(biāo)擴(kuò)增，因此，不可避免的存在定量值偏低甚至漏檢可能，而我們的研究結(jié)果也證實(shí)了這種情況，即普通PCR檢測低于其下限(<200IU/mL)的標(biāo)本經(jīng)高敏熒光定量PCR復(fù)檢，有約8.5%標(biāo)本結(jié)果高于200IU/mL。因此，對這部分HBeAg陰性病毒血癥患者，高敏HBV-DNA檢測更能準(zhǔn)確反應(yīng)病毒復(fù)制狀態(tài)及評估抗病毒療效。

多數(shù)慢性乙肝感染所致肝纖維化及早期肝硬化并無特異性癥狀、體征，常規(guī)血液生化指標(biāo)也可能無明顯異常，如果不進(jìn)行肝臟組織病理學(xué)檢查則不易被及時(shí)發(fā)現(xiàn)。而肝臟瞬時(shí)彈性成像技術(shù)作為一種重要的肝纖維化無創(chuàng)診斷技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于臨床。為此，本文還對不同HBV-DNA水平組患者肝硬度值的差別進(jìn)行了分析比較。HBV-DNA是反應(yīng)病毒復(fù)制程度的標(biāo)志，持續(xù)的病毒復(fù)制導(dǎo)致機(jī)體免疫應(yīng)答，從而引起炎癥壞死的持續(xù)，因此，病毒載量也可在一定程度上反應(yīng)慢性乙型肝炎患者肝組織的炎癥及纖維化程度，對評估患者病情有重要意義[9]。我們的觀察結(jié)果也顯示了HBV-DNA水平與肝硬度值總體上的正相關(guān)趨勢。同時(shí)，我們的結(jié)果還顯示普通熒光定量PCR陰性但高敏熒光定量PCR陽性的患者，其肝硬度值高于纖維化診斷界值，這部分患者可能面臨纖維化進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，但有待于臨床進(jìn)一步密切觀察。同時(shí)，這也與目前報(bào)告的關(guān)于低病毒血癥患者纖維化進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)相一致。

總之，通過我們的研究，反映了高敏熒光定量PCR在慢性乙型病毒性肝炎尤其是低病毒血癥患者病毒復(fù)制、肝臟炎癥進(jìn)展監(jiān)測中的價(jià)值，為慢乙肝患者抗病毒治療過程中精準(zhǔn)的病情監(jiān)測提供了有力的支撐。由于我們樣本例數(shù)偏少，還需要多中心、大樣本以及長期隨訪觀察進(jìn)一步支持我們的論斷。同時(shí)，高敏熒光定量PCR在隱匿型乙肝、腫瘤患者放、化療后HBV再激活風(fēng)險(xiǎn)的評估等方面的應(yīng)用值得我們進(jìn)一步的探討。