貴州地區(qū)基因分型指導下非瓣膜性房顫患者華法林預測模型的建立

徐詩佳、崔淼淼 許木麗 朱小涵 韋靈 侯淑敏 趙可仙 唐峰△

(1.貴陽市第二人民醫(yī)院心內(nèi)科,貴州 貴陽 550004；2.貴陽市第二人民醫(yī)院檢驗科,貴州 貴陽 550004)

心房顫動(簡稱房顫)可導致左房血栓形成，栓子脫落可引起動脈栓塞，以腦卒中危害最大[1]。華法林一直是臨床應用最廣泛的口服抗凝藥[2]。非瓣膜病房顫(NVAF)研究薈萃分析結果示，華法林可使卒中的相對危險度降低64%，全因死亡率降低26%[3]。華法林在臨床用藥過中存在治療窗狹窄、個體差異大、影響因素多、需頻繁抽血化驗等問題[4]，如何安全、快速地達到穩(wěn)定劑量一直是華法林抗凝研究的熱點。近年的研究發(fā)現(xiàn)VKORC1和CYP2C9基因多態(tài)性與華法林穩(wěn)定劑量的個體差異密切相關,大約可以解釋30%的差異，其中VKORC1解釋20%～25%，CYP2C9可以解釋5%～10%[5]。為了實現(xiàn)個體化用藥，減少不良反應，華法林穩(wěn)定劑量預測模型成為另一個研究熱點。隨著我國人口老年化的發(fā)展，非瓣膜性房顫患者正逐年增多，華法林給藥模型應根據(jù)區(qū)域人群不同而逐漸細化，建立起適合不同種族、區(qū)域的NVAF患者華法林的治療模型。我國目前對華法林穩(wěn)定計量預測模型及公式的研究以北方沿海地區(qū)為主，貴州屬于少數(shù)民族聚居地，有其獨特的地理條件及生活習慣，且不同的族群具有不同的基因多態(tài)性頻率，因此建立適合貴州地區(qū)的NVAF患者華法林日均劑量給藥公式，可讓更多貴州地區(qū)患者受益。報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年5月至2019年5月我院收治的150例NVAF患者。入選標準：貴州地區(qū)人群(三代以內(nèi)在本地居住)，年齡≥18歲；非瓣膜性房顫；CHA2DS2-VASc評分≥2；HAS-BLED評分≤2分；服用華法林>2個月，INR達標。排除標準：INR未達標；CHA2DS2-VASc<2；嚴重肝腎功能不全、顱內(nèi)出血史、妊娠、嚴重感染、嚴重心衰、貧血、惡性腫瘤、血液疾病、華法林過敏史、活動性消化性潰瘍。CHA2DS2-VASc評分標準：近期心力衰竭1分，高血壓病1分，年齡64～74歲1分，年齡75歲2分，糖尿病1分，腦卒中/短暫性腦缺血發(fā)作/血栓栓塞病史2分，血管疾病(如陳舊性心肌梗死、周動脈疾病、主動脈斑塊)1分。本試驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意，入選患者均簽署書面知情同意書。

1.2患者信息記錄 收集患者的年齡、性別、民族、身高、體質量、體表面積BSA、BMI、高血壓病史、糖尿病病史、華法林穩(wěn)定日均劑量及CYP2C9和VKORC1基因型。

近兩年來，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部（原農(nóng)業(yè)部）和云南省委、省政府高度重視云嶺牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展，將云嶺牛產(chǎn)業(yè)列入我省草食畜產(chǎn)業(yè)的重中之重予以精心培植，編制并印發(fā)了“十三五”云嶺牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃，進一步明確了發(fā)展思路、原則、目標及措施。全省多個地方已將云嶺牛產(chǎn)業(yè)列入當?shù)噩F(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的重點產(chǎn)業(yè)和脫貧摘帽的優(yōu)質產(chǎn)業(yè)來抓。

1.3INR達標標準 所有患者均采用初始劑量2.5 mg/d,隨后持續(xù)監(jiān)測國際標準化比值(INR)，該值連續(xù)3次檢測達到2.0～3.0即可達標，70歲以上的老年患者INR的標準是1.6～2.6。

2.2患者臨床特征與華法林穩(wěn)定劑量的關系 通過統(tǒng)計學軟件對影響華法林穩(wěn)定劑量的相關臨床因素進行分析，其結果如表1、表2所示，由此可見，華法林穩(wěn)定劑量分別與患者民族、年齡、體質量、BSA、吸煙史相關(rs分別為0.273、-0.713、0.190、0.199、0.176，P均<0.05)，與患者性別、飲酒史、高血壓病史、糖尿病病史、身高均不相關，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。針對不同民族間華法林穩(wěn)定劑量差異比較的事后檢驗證明，漢族華法林穩(wěn)定劑量明顯低于布依族(P=0.001)和苗族、侗族等其他民族(P=0.031)，布依族和其他少數(shù)民族之間的華法林穩(wěn)定劑量無明顯差異(P=0.791)。年齡和華法林穩(wěn)定劑量呈負相關，年齡越大，華法林穩(wěn)定劑量越低。體質量、BSA和法林穩(wěn)定劑量均呈正相關，體質量、BSA越大，華法林穩(wěn)定劑量越高。有吸煙史的病例華法林穩(wěn)定劑量明顯高于不吸煙的。

1.4.2基因檢測方法 抽取合格入選患者的外周靜脈血于枸櫞鈉抗凝抽血管內(nèi)，采用血液基因組柱式小量提取試劑盒提取基因組DNA，用人類CYP2C9和VKORC1基因檢測試劑盒在實時熒光定量PCR儀中進行CYP2C9 和VKORC1基因型測定，剩余DNA置于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。采?5ul的PCR-熒光探針法反應體系：23ul的反應液+2ul的基因組DNA。擴增程序：37℃ UNG處理10 min 1個循環(huán)；95℃預變性5 min 1個循環(huán)；95℃變性15 s，62℃退火延伸60 s，共40個循環(huán)，通過采集熒光信號判斷基因型。

1.4.1藥品試劑與儀器 華法林藥片(齊色制藥有限公司,國藥準字H37021314)，實時熒光定量PCR擴增儀(上海透景生命科技股份有限公司)，血液基因組柱式小量提取試劑盒(江蘇康為世紀生物科技有限公司)，人類CYP2C9和VKORC1基因檢測試劑盒(武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司)，無水乙醇。

2 結 果

2.1患者基本情況分析 根據(jù)設定的標準，納入150例患者，其中男79例(52.66%)，女71例(47.34%)，平均年齡(71.83±10.59)歲，平均身高(160.73±7.76)cm，平均體質量(60.46±11.93)kg，平均BSA(1.61±0.20)m2，平均BMI(23.29±3.61)kg/m2，飲酒44例(29.33%)，吸煙54例(36.00%)，高血壓77例(51.33%)，糖尿病42例(28.00%)。

影像學指標包括測量的頸椎生理曲度（Cobb角）和頸椎活動度（ROM）（頸椎動力性攝片測量法，將過伸和過屈位X線片上的Cobb角絕對值相加）。隨訪時如果過屈過伸位片上相鄰棘突間距改變＜2 mm、側位片上假體和相鄰椎體間沒有透亮線、側位片及CT上可見骨小梁通過假體與鄰近終板，可以認為已達到融合標準。

1.4研究方法

表1 不同民族、性別、高血壓史、糖尿病史、吸煙史及飲酒史的華法林穩(wěn)定劑量比較

表2 各影響因素和華法林穩(wěn)定劑量的相關分析

邀請3位專家給出杭州市運河引配水系統(tǒng)指標體系（表1）中各個因子的兩兩判斷矩陣，計算各因子主觀權重及相應的專家自身權重，融合得到各因子權重。

2.3.1CYP2C9和VKORC1基因型頻率符合Hardy-weinberg平衡，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),表明該研究人群具有代表性。

小組合作學習模式中最重要的是小組成員的分配。合作小組并不是單純地將位置緊挨在一塊的學生組建起來。合理的分配小組成員，組建積極和諧有影響力的小組隊伍是至關重要的。因此，在語文課程學習中，教師在分配組建小組時，一定要根據(jù)組內(nèi)異質，組間同質的分組原則，將學生的整體學習能力、學習狀況、家庭情況、愛好興趣、性格優(yōu)勢等多方面情況綜合考慮，合理有效地搭配小組成員。通過這樣的小組分配方式，不僅充分考慮到小組成員之間的差異化存在，而且使小組成員之間能夠進行優(yōu)勢互補、相互協(xié)調，更加有利于促進小組間的和諧合作。

2.3.3CYP2C9和VKORC1基因型在不同民族的分布情況 漢族、布依族及其他民族基因頻率以AA型為主，AC型較為少見，未出現(xiàn)過CC型，等位基因頻率以A型為主，C型所占比重少。以上各組的 CYP2C9基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。漢族基因頻率以AA型為主，GA型較AA型少，GG型未出現(xiàn)；布依族AA和GA型相當，GA型多于AA型，GG型未出現(xiàn)；其他民族以AA和GG為主，AA型多于GG型，GA型未出現(xiàn)。以上各組的VKORC1基因型及等位基因分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3、表4。

道路是國有林場林區(qū)生產(chǎn)生活的基礎性、先導性服務設施，是國有林場林區(qū)經(jīng)濟社會轉型發(fā)展的重要推動力，是改善民生、脫貧致富的重要手段，對保障生態(tài)安全和社會穩(wěn)定十分重要。中發(fā)[2015]6號文件明確提出“各級政府要將國有林場林區(qū)道路按屬性納入相關公路網(wǎng)規(guī)劃”，“國家結合現(xiàn)有渠道，加大對國有林區(qū)基礎設施建設的支持力度”等具體要求。因此，通過對道路發(fā)展現(xiàn)狀和存在問題的分析，將為國有林場林區(qū)道路建設與發(fā)展，努力改善國有林場林區(qū)道路交通條件，提高交通服務能力和水平，提供基礎依據(jù)，為政策的制定提供可靠的遵循。

2.3患者基因型與華發(fā)林穩(wěn)定劑量的關系

2.3.2不同基因型華法林穩(wěn)定劑量比較 CYP2C9基因型 AA和AC華法林穩(wěn)定劑量分別為(2.83±0.81)mg，(2.05±0.59)mg，AC型穩(wěn)定劑量低于AA型，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；VKORC1 AA、GA、GG型華法林穩(wěn)定劑量分別為(2.58±0.62)mg，(3.24±1.16)mg，(4.44±0.97)mg， AA型華法林穩(wěn)定劑量低于GA、GG型，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 CYP2C9在不同民族的基因型頻率分布

表4 VKORC1在不同民族的基因型頻率分布

2.3.4基因型結果的判斷 該研究主要運用實時熒光定量PCR擴增儀(上海透景生命科技股份有限公司，SLAN-96)對CYP2C9和VKORC1基因進行多態(tài)性檢測，一個反應體系通過兩種不同的檢測通道檢測一個基因位點的多態(tài)性(FAM通道采集藍色熒光，表示野生型位點，VIC通道采集綠色熒光，表示突變型位點，同時還需一個ROX通道，主要用于采集橙色熒光，表示內(nèi)標基因)。在反應體系中含有不同基因型模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放不同的熒光信號，利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，從而進行結果的分析。見圖1，圖2，圖3。

2.4模型的建立 根據(jù)前文華法林穩(wěn)定劑量影響因素相關分析結果，進一步使用線性回歸分析對影響因素進行定量探究，構建線性回歸模型成立(F=49.183，P<0.001)，模型R2=0.680，說明構建的模型能解釋68.0%的原始信息，證明模型構建比較合理。回歸分析結果顯示：華法林劑量=6.843+0.190×民族-0.058×年齡-0.024×體重-1.033×CYP2C9+0.719×VKORC1。對于民族，當患者為漢族時為1，布依族時為2，其他民族時為3；對于CYP2C9，AA時為1，AC時為2；對于VKORC1，AA時為1，GA時為2，GG時為3。

表5 患者華法林劑量影響因素分析

2.5預測劑量與實際劑量的對比 采用配對樣本t檢驗的方法比較華法林的實際劑量與本研究所建立模型的預測劑量，結果顯示華法林的實際劑量為(2.75±0.82)，模型預測劑量為(2.74±0.74)，與實際劑量相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討 論

華法林是一種維生素K拮抗劑，進入體內(nèi)即可被吸收，并具有良好的生物利用度,臨床上常用來治療和預防血栓性疾病，影響華法林的因素分為非遺傳因素和遺傳因素[6]。遺傳因素主要與CYP2C9和VKORC1基因有關，其中CYP2C9是細胞色素氧化酶P450超家族中第二亞家族中的重要成員，位于染色體10q24[7]，作為華法林的代謝位點參與抗凝過程，其編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)決定了該基因具有高度多態(tài)性，最常見的突變是1075位的A堿基替換為C堿基(1075A>C)，導致終止密碼提前出現(xiàn)，亮氨酸突變?yōu)楫惲涟彼醄7]，使酶的活性降低，延遲了華法林的清除代謝。該位點最常見的突變是CYP2C9*3和CYP2C9*2，亞洲人最常見的是CYP2C9*3，而CYP2C9*2極為少見[8]。VKORC1是維生素K環(huán)氧化物還原酶復合體的第一個亞基，位于16p11.2[7]，作為華法林的作用位點參與抗凝過程，該基因的編碼區(qū)和非編碼區(qū)均存在影響華法林劑量的多態(tài)性位點，最常見的突變是1639位的G堿基替換為A堿基(1639G>A)，該突變將導致維生素K依賴的凝血因子缺乏和華法林抵抗[9]，該基因突變與種族關系密切，亞洲人AA基因型頻率最高(86%)，歐洲人居中(37%)，非洲人最低(10%)，GA及GG與高劑量華法林有關，這也在一定程度上解釋了亞洲人所需華法林劑量較低有關[10]，維吾爾族和高加索人群的突變率低于漢族人群[11]。本研究共納入150名貴州地區(qū)NVAF患者，并結合患者的性別、年齡、身高、體重及吸煙史等臨床特征和其遺傳因素，通過多元線性回歸分析建立了華法林劑量預測模型，可以解釋臨床上68%的華法林差異。本研究所建立的模型共納入的影響因素中，性別、身高、BMI、BSA、吸煙史、飲酒史、高血壓史及糖尿病史對華法林劑量無顯著影響，但吳超君等模型[11]認為華法林穩(wěn)定劑量與BSA呈正相關，而范芳芳等模型[12]還認為有吸煙史的需要更高的華法林劑量。這可能與納入的標本量少有關，需要進一步增加樣本量進一步研究。年齡與華法林穩(wěn)定劑量呈負相關，隨著年齡的增長，人體的身體機能也會隨之衰退，肝臟清除功能和腎臟排泄功能減退，從而導致華法林代謝速率和清除速率減慢，需要的維持劑量也因此減少，而且年齡越大，對華法林的敏感性越高，抗凝治療風險越大，幾乎所有的模型都能證實這個觀點。在本研究中，體質量與華法林穩(wěn)定劑量成負相關，與肖成等模型[7]與華法林穩(wěn)定劑量呈正相關、Tejasvita Gaikwad模型[13]體質量對華法林穩(wěn)定劑量無顯著影響不同，可能與納入不同民族、地域差異及標本量例數(shù)較少相關。該研究中，民族與華法林劑量呈正相關，少數(shù)民族患者需要更高的華法林穩(wěn)定劑量，根據(jù)統(tǒng)計學計算，CYP2C9基因在漢族和少數(shù)民族之間無統(tǒng)計學意義，但VKORC1基因具有統(tǒng)計學意義，說明少數(shù)民族VKORC1基因型突變率不同于漢族，在針對新疆維吾爾族建模的范芳芳等模型[12]中，VKORC1基因型以GA型為主，占比47.8%，突變率低于漢族人群，貴州作為一個少數(shù)民族聚集地，少數(shù)民族種類多，也有相應的趨勢，但該研究納入少數(shù)民族病例比例少，無法對改因素進行系統(tǒng)的分析。華法林穩(wěn)定劑量相關的遺傳因素主要是CYP2C9及VKORC1的基因多態(tài)性引起的，在本研究中，納入的150例標本中，CYP2C9 AA基因型共133例(88.67%)，AC基因型17例(11.33%)，未出現(xiàn)CC型，華法林穩(wěn)定劑量分別為(2.83±0.81)mg，(2.05±0.59)mg，AA型華法林穩(wěn)定劑量明顯高于AC型，攜帶一個突變基因，所需華法林穩(wěn)定劑量可顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；VKORC1 AA基因型共有117例(78.0%)，GA基因型31例(20.67%)，GG基因型2例(1.33%)，突變率低于肖成等模型[7]，而明顯低于范芳芳等模型[12]，VKORC1AA、GA、GG各基因型華法林穩(wěn)定劑量分別為(2.58±0.62)mg，(3.24±1.16)mg，(4.44±0.97)mg，AA型華法林穩(wěn)定劑量明顯低于GA基因型和GG基因型，攜帶突變基因的個體所需較低的華法林穩(wěn)定劑量，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該模型的建立在一定程度上優(yōu)化了華法林用藥方案，可縮短患者達到穩(wěn)定劑量的時間，并減少副作用的風險，能較好的指導華法林的臨床用藥。

但本研究有樣本量偏少、納入的少數(shù)民族樣本量少、缺乏臨床驗證等局限性，因此需要進一步增加樣本量、納入更多少數(shù)民族樣本或針對性的研究某個民族，觀察更多的影響因素及遺傳位點多態(tài)性，以使華法林在臨床上的運用能更加精確有效。