東亞孑遺植物柳杉屬的遺傳分化及其種群進化歷史*

李鑫玉 王敏求 袁美靈 Saneyoshi Ueno 武星彤 蔡夢穎, Yoshihiko Tsumura 文亞峰

(1.中南林業(yè)科技大學風景園林學院 長沙 410004； 2.日本森林綜合研究所森林分子遺傳學與生物技術(shù)部 筑波 305-8687；3.筑波大學生命與環(huán)境科學學院 筑波 305-8572)

植物現(xiàn)代地理分布和遺傳變異格局是多種生物與非生物因素協(xié)同作用的結(jié)果 (Harrisonetal., 2001; Wangetal., 2013)，其中，地理和環(huán)境氣候變化是最關(guān)鍵的驅(qū)動因素，會對物種形成、遺傳分化、種群進化產(chǎn)生顯著影響 (Hewitt, 1996; 2004; Begonetal., 2006)。地理因素主要包括山脈隆起、陸地變遷、海水退卻等地質(zhì)事件，而全球氣候變化則以第四紀冰期-間冰期的循環(huán)最為劇烈，其對植物物種形成和現(xiàn)代地理分布所造成的影響極其深刻 (Bennett, 1997)。

現(xiàn)代植物類群中，第三紀孑遺植物以其起源古老、形態(tài)特殊、進化緩慢吸引了眾多研究者的關(guān)注(Tiffney, 1985, Tiffneyetal., 2001; Milneetal., 2002)，被稱為植物“活化石”。晚第三紀和第四紀期間，受全球氣候變化的影響，這些曾在第三紀廣泛分布的植物逐漸退縮至東亞、北美和歐洲西南部三大冰期避難所 (Milneetal., 2002)。這些區(qū)域中，東亞植物區(qū)系是全球植物多樣性最為豐富和復雜的地區(qū)，擁有全球最古老和最完整的植物多樣性演化系列。同時，現(xiàn)代東亞植物區(qū)系反映了重大的古地質(zhì)和環(huán)境氣候變化 (邱英雄等，2017)，是研究北半球植物起源和進化的關(guān)鍵地區(qū)。杉科 (Taxodiaceae) (現(xiàn)歸屬于柏科)是第三紀孑遺植物中獨特的裸子植物類群，多為單型屬或寡型屬。著名的活化石植物水杉在該區(qū)域的發(fā)現(xiàn)，也使其成為中國-日本植物區(qū)系的譜系代表 (Chenetal., 2018)。鑒于杉科植物悠久的演化歷史，獨特的生活習性，及其在東亞地區(qū)的廣泛分布，研究它的進化歷史和地史分布對于揭示整個松杉類植物的系統(tǒng)演化、地理分布及全球古植物地理區(qū)系和古氣候變化均有重要意義。

柳杉屬(Cryptomeria)樹種為東亞特有，是現(xiàn)存杉科植物中最原始的類群，祖先的大多數(shù)原始性狀在該屬得到保留 (于永福，1995)。柳杉屬間斷分布于我國和日本，長期的人工栽培與廣泛利用，使其起源、天然分布地和分類都存在很大爭議。有的認為日本和我國東部的天目山、武夷山是該屬的起源地和天然種群分布中心 (王江等，2007； 袁美靈等，2019)，但也有認為柳杉原產(chǎn)日本，柳杉在我國屬外來物種 (Chenetal., 2008)。柳杉屬的分類存在1個種和2個種的爭議，較多學者認為柳杉屬是單種屬，包括柳杉(Cryptomeriajaponicavar.sinensis)和日本柳杉(Cryptomeriajaponicavar.japonica)兩個變種 (Hayashi, 1960； Fuetal., 1999)，也有認為長期的地理隔離和種群分化，使柳杉和日本柳杉產(chǎn)生了可遺傳的表型變異，其應屬于2個獨立的種(Cryptomeriafortunei和Cryptomeriajaponica) (王江等，2007)。

日本柳杉作為日本的“國樹”，不僅占據(jù)了44 %的人工林資源，而且其天然林分布廣泛 (Tsumuraetal.,2011)，從北部的青森縣至南部的屋久島都有較大面積分布。迄今為止，柳杉屬的遺傳學和譜系地理學研究多以日本柳杉為主。早期的表型分析和現(xiàn)代分子遺傳學研究表明，日本柳杉天然種群間存在顯著的遺傳分化 (Kojo, 1987； Tsumuraetal., 2007；2012； 2014; Kimuraetal., 2013)，可分為Omote-sugi和Ura-sugi2個地理變種，分別分布于日本島的太平洋沿岸和日本海沿岸。日本柳杉的種群進化歷史也廣受關(guān)注，花粉化石資料顯示，170萬年前的氣候變化使日本柳杉產(chǎn)生了適應性特征，種群分化可能發(fā)生在30萬年前。Kimura等(2014)基于SSR數(shù)據(jù)和貝葉斯計算方法，認為日本柳杉不同地理譜系的分化時間為8萬年前。利用核基因組序列數(shù)據(jù)，Moriguchi等(2019)得到的日本柳杉分化時間為30萬年前。在化石資料不足的情況下，估算物種的分化時間，既與不同的標記方法有關(guān)，也與遺傳分化模型和基因突變率的選擇有直接關(guān)系。雖然以上2個研究的分化時間略有差異，但共同顯示日本柳杉譜系分化發(fā)生在末次盛冰期(LGM)之前的較近時間，類似于“活化石”植物銀杏(Ginkgobiloba)，中國現(xiàn)存銀杏種群的遺傳足跡僅可追溯至39萬年前 (Hohmannetal., 2018)。最近的研究也表明，第四紀冰期氣候變化，特別是末次盛冰期對東亞地區(qū)柳杉的遺傳多樣性和遺傳分化產(chǎn)生了深刻影響 (Tsumuraetal., 2020)，但該研究只用了1個柳杉天然種群，對于分析柳杉和日本柳杉的種群進化歷史尚有不足。因此，東亞全域范圍內(nèi)的柳杉種群研究，特別是柳杉和日本柳杉的遺傳分化和種群歷史動態(tài)有待進一步深入。

基于此，本研究以東亞全域分布柳杉屬樹種的天然種群為研究材料，利用核基因組微衛(wèi)星標記技術(shù)，解析該屬的遺傳變異格局，以期掌握其遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)，闡明其種群進化歷史。在此基礎(chǔ)上，分析地理和氣候變化在柳杉遺傳分化中的作用，進一步探討柳杉屬的起源和分類等科學問題。

1 材料與方法

1.1 研究材料

根據(jù)我國柳杉資源分布現(xiàn)狀，選取浙江、福建和安徽等省區(qū)的柳杉天然林(或古樹林)種群為研究材料。2017—2018年采集到10個種群共189個單株(胸徑大于100 cm)樣本(表1、圖1)，取嫩葉適量，利用改良CTAB法提取基因組DNA (張景麗，2014)，符合質(zhì)量要求的DNA稀釋至20～30 ng·μL-1用于試驗分析。日本柳杉樣本來源于日本青森縣、秋田縣和新瀉縣等8個天然種群的109個單株，其DNA由日本森林綜合研究所提供(表1、圖1)。

1.2 基因分型

從日本柳杉核基因微衛(wèi)星(nSSR)中篩選14個多態(tài)性豐富的位點用于基因分型 (Tanietal., 2003； Moriguchietal., 2003; Moriguchietal., 2014) (表2)，這些位點經(jīng)檢測分析均不含無效等位基因。正向引物5′端加熒光接頭FAM，HEX或TAMRA。PCR擴增體系為15 μL，含2 × Taq PCR MasterMix (Tiangen) 7.5 μL，正向引物(F)和反向引物(R)各0.75 μL(10 μmol·L-1)，DNA模板3 μL，ddH2O 3 μL。PCR反應程序為： 94 ℃預變性4 min； 94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。1.6 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，利用ABI3730xL分析儀進行基因分型(Liz 500為內(nèi)標)，GeneMarker version 2.20軟件 (Hulceetal., 2011)統(tǒng)計基因分型結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 遺傳多樣性與遺傳分化 利用GenAlEx6.5 (Peakalletal., 2012)統(tǒng)計等位基因數(shù)(Na)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和基因流(Nm)等遺傳參數(shù)。HP-Rare 1.1 (Kalinowski，2005)計算各種群等位基因豐富度(Ar)和私有等位基因豐富度(PAr)。FSTAT (Goudet，1995)用于估算近交系數(shù)(FIS)、總的遺傳多樣性(Ht)、種群內(nèi)遺傳多樣性(Hs)和遺傳分化系數(shù)(GST和FST)?；蛄鞲鶕?jù)公式Nm= (1/FST-1)/4計算獲得。

1.3.2 遺傳結(jié)構(gòu) 根據(jù)地理來源將東亞地區(qū)的柳杉屬植物樣本分為柳杉和日本柳杉2個組群，利用Arlequin 3.0 (Excoffieretal.，2005) 按組群間、種群間和種群內(nèi)進行遺傳變異分子方差分析(AMOVA)。STRUCTURE 2.3.3 (Pritchardetal.，2000) 用于遺傳結(jié)構(gòu)分析，在混合模型 (Admixture model)下，設(shè)置Burn in period和MCMC (Markov Chain Monte Carlo) 的迭代參數(shù)分別為50 000和100 000，K值設(shè)定為1～18，每個K值運算10次，其余使用默認設(shè)置(Q值為0.9)。根據(jù)STRUCTURE HARVESTER (Earletal.，2012)計算ΔK數(shù)值的分布，確定最優(yōu)K值。利用CLUMPP軟件 (Jakobssonetal., 2007) 計算對應K值的最優(yōu)Q-matrix結(jié)果，并利用Distruct軟件 (Rosenberg, 2004) 輸出可視化圖形?；诜N群間FST矩陣，利用MEGA 7軟件(Kumaretal.，2016)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(鄰接法neighbor-joining, NJ)。基于R語言平臺，執(zhí)行‘a(chǎn).score’主成分判別分析(DAPC) (Jombart, 2008)。用GenAlEx6.5軟件(Peakalletal., 2012)進行Mantel檢驗，檢測地理距離和遺傳距離的相關(guān)性，設(shè)置999次隨機置換。

1.3.3 種群歷史動態(tài) 利用DIY ABC軟件 (Cornuetetal.，2014)基于近似貝葉斯算法，模擬分析柳杉屬種群的歷史動態(tài)。95%置信水平下，采用Logistic回歸，使用最接近模擬數(shù)據(jù)的1%觀測數(shù)據(jù)，估算每個進化事件的后驗概率(posterior probability, PP)，后驗概率最大的進化事件為最優(yōu)進化事件。根據(jù)STRUCTURE、主成分判別分析(DAPC)和NJ聚類分析結(jié)果，按不同的基因庫分別構(gòu)建東亞地區(qū)柳杉的種群進化事件。

表1 柳杉屬種群地理位置及樣本數(shù)量Tab.1 Locality information and sample size of Cryptomeria populations

圖1 柳杉屬種群地理分布及基于CLUMPP結(jié)果的基因庫分布圖(K = 4)Fig. 1 Geographic distribution of Cryptomeria populations and gene pool distribution map of each population based on CLUMPP results (K = 4)

(1)K=2時，分為柳杉(CHN)和日本柳杉(JAN)2個基因庫，構(gòu)建3種進化事件：

事件1： 柳杉(CHN)和日本柳杉(JAN)由同一祖先種群分化而來(t1)；

事件2： 日本柳杉(JAN)在t1時間由柳杉(CHN)分化而來；

事件3： 柳杉(CHN)在t1時間由日本柳杉(JAN)分化而來。

(2)K=4時，分為中國東南部種群(CHS)、廬山種群(LS)、日本海沿岸種群(Ura-sugi)和太平洋沿岸種群(Omote-sugi) 4個基因庫，構(gòu)建4種進化事件：

事件1： 日本海沿岸種群(Ura-sugi)于t1時分化出太平洋沿岸種群(Omote-sugi)，隨后t2、t3時間依次分化出廬山種群(LS)和中國東南部種群(CHS)；

事件2： 中國東南部種群(CHS)和日本海沿岸種群(Ura-sugi)由同一祖先種群分化而來(t1)，隨后，二者于t2時間發(fā)生混合事件，產(chǎn)生太平洋沿岸種群(Omote-sugi)，t3時間，太平洋沿岸種群(Omote-sugi)與中國東南部種群(CHS)混合，分化出廬山種群(LS)；

事件3： 中國東南部種群(CHS)、廬山種群(LS)、日本海沿岸種群(Ura-sugi)和太平洋沿岸種群(Omote-sugi)由同一祖先種群分化而來(t1)；

事件4： 廬山種群(LS)、日本海沿岸種群(Ura-sugi)和太平洋沿岸種群(Omote-sugi)種群于t1時間從同一祖先種群分化而來，隨后t2時間中國東南部種群(CHS)由廬山種群(LS)分化而來。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性與遺傳分化

14個nSSR位點共檢測到219個等位基因，不同位點的等位基因數(shù)(Na)從2到33不等，平均為15.643。柳杉屬總的遺傳多樣性(Ht)為0.570，種群內(nèi)遺傳多樣性(Hs)為0.508 (表2)。不同種群的平均等位基因數(shù)(Na)在2.714～9.286之間，平均期望雜合度(He)和觀測雜合度(Ho)分別為0.488和0.472。以最小種群樣本數(shù)6為基數(shù)，廬山種群(LS)具有最高的等位基因豐富度和私有等位基因豐富度 (Ar = 5.271，(PAr = 0.976)，天寶巖高海拔種群(TB)的等位基因豐富度最低(Ar = 2.453)。柳杉屬種群遺傳分化系數(shù)(FST)為0.136，基因流(Nm)為1.588 (表4)，近交系數(shù)(FIS)從-0.100到0.294，平均值為0.060。在組群水平，柳杉的遺傳多樣性(Na= 4.571，Ho= 0.442)低于日本柳杉(Na= 4.634，Ho= 0.510) (表3)，但柳杉的遺傳分化程度(FST= 0.121)明顯高于日本柳杉(FST= 0.028)。

2.2 遺傳結(jié)構(gòu)

根據(jù)AMOVA分析結(jié)果，柳杉屬的遺傳變異主要來自種群內(nèi)的個體間，種群內(nèi)遺傳變異占總變異的86.37% (P< 0.001) (表4)。STRUCTURE分析表明，K= 2時出現(xiàn)明顯拐點并取得最大值，說明柳杉屬種群最有可能劃分為2個基因庫(gene pool) (圖2a、b)，分別對應柳杉(除LS種群)和日本柳杉。K= 3時，柳杉種群中出現(xiàn)新的基因庫(黃色)，日本柳杉種群未出現(xiàn)新的基因庫。K= 4時，日本柳杉分為Ura-sugi和Omote-sugi兩個明顯的地理譜系，而中國廬山種群(LS)與Omote-sugi屬同一基因庫(綠色) (圖2c)。NJ系統(tǒng)發(fā)育樹與主成分判別分析(DAPC)結(jié)果顯示柳杉屬可分為中國東南部(CHS)、中國廬山(LS)、日本海沿岸(Ura-sugi)和太平洋沿岸(Omote-sugi)四個譜系(圖3、4)。

Mantel檢驗結(jié)果顯示，柳杉屬種群的遺傳距離和地理距離之間不具有顯著相關(guān)性(R2=0.008 5，P=0.171) (圖5a)。在組群的水平上，柳杉(排除廬山種群)中沒有發(fā)現(xiàn)二者之間的顯著相關(guān)性(R2=0.016 4，P=0.226) (圖5b)，但日本柳杉中則具有顯著相關(guān)性(R2=0.223 5，P=0.018) (圖5c)。

表2 14個nSSR位點的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity parameters of 14 nSSR loci

表3 柳杉屬種群的遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity parameters of the Cryptomeria populations

表4 柳杉屬種群間分子方差分析(AMOVA)Tab.4 Analysis of molecular variance (AMOVA) of Cryptomeria populations

圖2 柳杉屬種群STRUCTURE分析結(jié)果Fig. 2 Results of STRUCTURE analysis of the Cryptomeria populationsa: K值與Delta K關(guān)系圖; b: K值與Mean LnK關(guān)系圖; c: 當K=2, 3, 4時, STRUCTURE分析結(jié)果的直方圖。 CHS: 中國東南部種群; LS: 中國廬山種群; Ura-sugi: 日本海沿岸種群; Omote-sugi: 太平洋沿岸種群。a: Relationship between Delta K and K value; b: Relationship between Mean LnK and K value; c: Histogram of the STRUCTURE analysis for the model with K=2, K=3 and K=4;； CHS: the populations of Southeastern China; LS: the populations of Lushan China; Ura-sugi: the populations of the Japan Sea coast; Omote-sugi: the populations of the Pacific coast.

圖3 基于成對FST矩陣的柳杉屬種群系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ法)Fig. 3 Phylogenetic tree of the Cryptomeria populations based on pairwise FST values (NJ method)CHS: 中國東南部種群; LS: 中國廬山種群; Ura-sugi: 日本海沿岸種群; Omote-sugi: 太平洋沿岸種群。CHS: the populations of Southeastern China; LS: the populations of Lushan China; Ura-sugi: the populations of the Japan Sea coast; Omote-sugi: the populations of the Pacific coast.

圖4 柳杉屬種群的主成分判別分析圖(DAPC)Fig. 4 Principal component discriminant analysis (DAPC) of the Cryptomeria populationsCHS: 中國東南部種群; LS: 中國廬山種群; Ura-sugi: 日本海沿岸種群; Omote-sugi: 太平洋沿岸種群。CHS: the populations of Southeastern China; LS: the populations of Lushan China; Ura-sugi: the populations of the Japan Sea coast; Omote-sugi: the populations of the Pacific coast.

圖5 柳杉屬種群地理距離與遺傳距離相關(guān)性檢驗Fig. 5 Geographical distance against genetic distance for the Cryptomeria populationsa: 柳杉屬種群; b: 柳杉種群(除廬山LS); c: 日本柳杉種群。a: Cryptomeria populations; b: C. japonica var. sinensis populations (except LS); c: C. japonica var. japonica populations.

2.3 種群歷史動態(tài)

為闡明柳杉屬樹種的種群歷史動態(tài)，根據(jù)STRUCTURE與DAPC分析結(jié)果，按不同的基因庫分2步對其種群歷史進行模擬分析。當K=2時，3個進化事件的后驗概率(PP)分別為0.994 9，0.005 0和0.000 1，事件1為最優(yōu)事件，即柳杉和日本柳杉在t1(1 010代)時從同一祖先種群分化而來，其有效種群分別為N1= 3 880；N2= 9 240；NA= 92 (圖6)。當K=4時，最優(yōu)事件為3 (PP=0.991 9)，即中國東南部種群(CHS)、中國廬山種群(LS)、日本海沿岸種群(Ura-sugi)和太平洋沿岸種群(Omote-sugi)由同一祖先種群分化而來，分化時間t1為1 140代，其有效種群分別為N1= 3 820；N2= 7 840；N3= 4 850；N4= 7 350；NA= 44.6 (圖7、表5)。

圖6 基于近似貝葉斯算法的柳杉屬進化事件模型(K = 2)Fig. 6 The scenarios of Cryptomeria populations based on Approximate Bayesian Computation (K = 2)CHN: 柳杉種群; JAN: 日本柳杉種群; PP: 事件的后驗概率; t1: 事件的分化代數(shù); N1, N2, NA: 有效種群的大小。CHN: C. japonica var. sinensis; JAN: C. japonica var. japonica; PP: the posterior probability of scenario; t1: the generation of scenario; N1, N2, NA: the size of effective population.

圖7 基于近似貝葉斯算法的柳杉進化事件模型(K = 4)Fig. 7 The scenarios of Cryptomeria populations based on Approximate Bayesian Computation (K = 4)CHS: 中國東南部種群; LS: 中國廬山種群; Ura-sugi: 日本海沿岸種群; Omote-sugi: 太平洋沿岸種群; t1, t2, t3: 事件的分化代數(shù); N1, N2, N3, N4, NA: 有效種群的大小。CHS: the populations of Southeastern China; LS: the populations of Lushan China; Ura-sugi: the populations of the Japan Sea coast; Omote-sugi: the populations of the Pacific coast; t1, t2, t3: the generation of scenario; N1, N2, N3, N4, NA: the size of effective population.

表5 基于DIY ABC的各進化事件的后驗分布的中值估計(K = 4)Tab.5 Median estimation of posterior distributions for each scenario based on DIY ABC (K = 4)

3 討論

3.1 種群遺傳多樣性與遺傳分化

本研究表明，柳杉屬樹種的遺傳多樣性水平中等(Ho= 0.472，He= 0.488)，其值低于杉木(Cunninghamialanceolata) (He= 0.687) (李霞等，2020) 和長苞冷杉(Abiesgeorgei) (He= 0.751) (程小毛等，2016)，但高于水松(Glyptostrobuspensilis) (Ho= 0.317，He= 0.272) (Wuetal.，2019) 、臺灣杉(Taiwaniacryptomerioides) (Ho= 0.231，He= 0.370) (李江偉，2014) 等杉科孑遺植物。種群間存在較高的遺傳分化(FST= 0.136)，可分為柳杉和日本柳杉2個地理種群。柳杉具有遺傳多樣性低、種群間遺傳分化大、基因流小的特點(Na= 4.571，Ho= 0.442，F(xiàn)ST= 0.121)。

植物遺傳多樣性會受繁育系統(tǒng)、遺傳漂變、基因流和人為干擾等因素的影響 (文亞峰等，2010)，近交繁殖、遺傳漂變、基因流受限、種群規(guī)模變小都會導致遺傳多樣性的降低。和日本柳杉相比較，柳杉表現(xiàn)出明顯的近交繁殖特性(FIS= 0.123)，種群間基因流十分有限(Nm= 1.816)，遠低于日本柳杉的基因流指數(shù)(Nm= 8.679)，更低于針葉樹種基因流平均值(Nm> 3) (Ledig，1998)?？紤]到86.37%的變異發(fā)生在種群內(nèi)，我們認為有限的基因流以及由此所導致的近交繁殖是造成柳杉遺傳多樣性低的主要原因。根據(jù)Cai等(2020)的研究結(jié)果，柳杉的種群數(shù)量自中更新世以來呈持續(xù)下降的趨勢，而全新世以來人類活動的增強使柳杉生境片斷化日趨嚴重，這些因素進一步加劇了其遺傳多樣性的衰減。相比較而言，日本柳杉天然林分布廣泛，且得到了較好地保護，人為干擾少，保持了較高的遺傳多樣性。日本島中部的山地阻隔，太平洋和日本海兩側(cè)環(huán)境氣候的差異，從而導致日本柳杉種群產(chǎn)生了顯著的遺傳分化，分為Omote-sugi和Ura-sugi兩個地理變種 (Kojo, 1987； Tsumuraetal.，2007, 2012, 2014)，本文基于東亞地區(qū)全域的柳杉屬種群研究也支持這一結(jié)論。

3.2 種群遺傳結(jié)構(gòu)

從STRUCTURE分析結(jié)果可看出，除中國廬山種群(LS)外，與其地理來源一致，所有柳杉屬樹種種群可分為柳杉和日本柳杉2個地理種群(K= 2)，DAPC分析結(jié)果則分為更明顯的4個譜系，分別是中國東南部種群(CHS)、中國廬山種群(LS)、日本海沿岸種群(Ura-sugi)和太平洋沿岸種群(Omote-sugi)?；贔ST的NJ聚類結(jié)果，日本柳杉種群間有較近的親緣關(guān)系，而柳杉種群間的遺傳距離相對較遠，顯示出松散的聚類關(guān)系，分布地之間互有交叉。地理隔離(IBD)分析結(jié)果很好地證實了這一點，柳杉種群的地理距離與遺傳距離間相關(guān)性不顯著，而分布范圍較小的日本柳杉種群則存在地理隔離現(xiàn)象。

一般來說，如果沒有強烈的人為干擾和選擇作用，植物會表現(xiàn)出明顯的地理隔離。柳杉種群IBD消失的原因可能與人為干擾有關(guān)，古代頻繁的貿(mào)易活動和長期人工栽培為遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移提供了可能，從而使不同地理起源的柳杉種群產(chǎn)生了混雜。令人驚奇的是中國廬山種群(LS)并未歸入柳杉聚類群，而是與日本柳杉有更近的親緣關(guān)系。Cai等 (2020)認為中國廬山種群是日本柳杉引種而來，也有研究表明日本柳杉在20世紀初首先在廬山引種成功 (沈作奎等，2004)。但從我們分析結(jié)果來看，中國廬山種群不僅具有最高的遺傳多樣性，而且該種群的私有等位基因豐富度也顯著高于日本柳杉，且DAPC分析進一步顯示，中國廬山種群雖歸入日本柳杉類群，但仍與日本柳杉的兩個譜系Omote-sugi和Ura-sugi有較遠的遺傳距離。因此，關(guān)于中國廬山種群的起源和來源值得進一步深入研究。

3.3 種群進化歷史

DIY ABC基于近似貝葉斯算法估算種群分化時間和有效種群數(shù)量。不同基因庫(K= 2和K= 4)模擬分析結(jié)果共同顯示： 柳杉屬是由同一祖先種群(NA)分化而來，兩組進化事件所對應的分化時間也較為一致，分別為1 010代(K= 2)和1 140代(K= 4)。柳杉通常需要20-30年開花結(jié)實，自然條件下，由于光照，林間郁閉等因素影響，其開花結(jié)實時間會有所推遲。參考日本柳杉研究結(jié)果 (Kimuraetal.，2014； Tsumuraetal.，2020)，設(shè)定柳杉的自然更新時間為100～300年，最優(yōu)進化事件所對應的種群分化時間在11萬～34萬年前，即柳杉和日本柳杉的最早分化時間發(fā)生在34萬年前，結(jié)果與日本柳杉不同種群的分化時間大致相同 (Moriguchietal.，2019)。柳杉作為第三紀孑遺植物，其種的形成和分化可追溯至108.1百萬年前，但其譜系分化時間僅只有34萬年，類似于“活化石”銀杏 (Ginkgobiloba) (Hohmannetal.，2018)，其現(xiàn)存種群的譜系分化時間也僅39萬年，表現(xiàn)為古老的孑遺種，年輕的譜系分化。根據(jù)化石資料，柳杉在侏羅紀晚期或更早起源于東亞東北地區(qū) (于永福，1995)，隨后擴散至歐洲和北美各地，第三紀晚期和第四紀冰期的全球氣候變化導致柳杉在歐洲和北美相繼滅絕，僅在東亞有所保留，成為著名的第三紀孑遺植物。第四紀冰期的氣候變化對其種群分化和種群數(shù)量產(chǎn)生了顯著影響 (Tsumuraetal.，2020)。我們認為，11萬～34萬年前受第四紀三次亞冰期(廬山亞冰期)的影響，東亞地區(qū)柳杉種群數(shù)量迅速減少，退縮至中國東南部和日本西南部的避難所，分化為柳杉和日本柳杉種群，后隨著間冰期的到來，海平面的上升使東海作為地理屏障隔離并加劇了東亞地區(qū)柳杉譜系間的分化。在此期間，第四紀亞冰期多次暴露的東海陸橋 (200萬～130萬年前，20萬～1.5 萬年前) 起到了“擴散廊道”的作用，為柳杉和日本柳杉提供了二次接觸的機會。中國-日本植物區(qū)系中的很多植物，如蛛網(wǎng)萼(Platycraterarguta) (Qietal.，2014) 、領(lǐng)春木屬(Euptelea) (Caoetal.，2016)、黃山梅屬(Kirengeshoma) (Qiuetal.，2009； Yuanetal.，2014)也存在這種現(xiàn)象。綜合現(xiàn)有證據(jù)，中國廬山種群可能是冰期避難所交匯地的殘存種群，也可能是日本柳杉引種的結(jié)果 (Caietal.，2020)，還需要后續(xù)更深入的研究。

3.4 柳杉屬的分類及其科學保護

種群進化歷史分析表明，雖然柳杉屬樹種起源古老，但柳杉和日本柳杉的譜系分化時間并不是很長，地理隔離使2個種群之間產(chǎn)生了一定程度的遺傳變異和分化，但對于物種形成而言，34萬年的遺傳分化尚不足以形成新種。根據(jù)“整合物種概念”(劉建全，2016)，我們認為柳杉和日本柳杉屬于分化路上的姊妹種。與日本柳杉相比較，柳杉資源豐富，但總體遺傳多樣性不高，天然林破壞嚴重，使其遺傳資源亟待有效保護。浙江省天目山種群(XTM)擁有最著名、保存最好的柳杉種群，在中國東南部柳杉種群中遺傳多樣性最高(Ho= 0.508)，福建天寶巖(TBY)和福建武夷山種群(WYS)存在較多私有等位基因，種群變異特殊，應作為核心種群予以重點保護。安徽黃山(WT)、福建天寶巖高海拔地區(qū)(TB)以及福建南平(YTG)種群數(shù)量少，遺傳多樣性低，需優(yōu)先予以保護。針對其他散生柳杉資源或人工林，應采取就地和遷地保護相結(jié)合的措施，通過建立保護小區(qū)的方式，加強管理，減少人類活動干擾。同時，加強種質(zhì)資源的保護和收集，特別是大樹、古樹和風水林種群，以達到保護遺傳多樣性的目的。

4 結(jié)論

柳杉屬樹種可分為柳杉和日本柳杉2個地理種群，以及中國東南部種群(CHS)、中國廬山種群(LS)、日本海沿岸種群(Ura-sugi)和太平洋沿岸種群(Omote-sugi) 4個遺傳譜系。柳杉屬的總遺傳多樣性中等，種群間存在較高的遺傳分化。柳杉和日本柳杉是由同一祖先種群在11萬～34萬年前同時分化而成，分化后兩個地理種群擁有各自獨立的進化路線。第四紀氣候變化、地理隔離和全新世以來的人為干擾是東亞地區(qū)柳杉遺傳變異格局形成的主要原因。與日本柳杉相比較，柳杉資源豐富，但總體遺傳多樣性不高，天然林種群破壞嚴重，亟待科學有效保護。