有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表達(dá)的影響

張明耀

前言

糖尿病是一種由于遺傳或后天因素共同體作用下，導(dǎo)致機(jī)體胰島素分泌不足或胰島素抵抗，而發(fā)生糖、脂肪、蛋白質(zhì)等代謝紊亂的慢性綜合征。根據(jù)2021年國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)(IDF)發(fā)布的最新糖尿病調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，全球20至79歲的成年人中，糖尿病患者數(shù)量約為5.37億人(患病率10.5%)。按目前的發(fā)展速度推算，到2030年全球成年人糖尿病患者人數(shù)將增至6.43億，2045年將上升到7.83億。目前，我國(guó)糖尿病患者數(shù)量仍居于世界首位，約為1.41億人，預(yù)計(jì)到2030年將達(dá)到1.64億人。糖尿病已成為21世紀(jì)主要公共衛(wèi)生問(wèn)題，給個(gè)人、家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)、生活負(fù)擔(dān)。目前，防治糖尿病的方法主要包括藥物治療、飲食療法、運(yùn)動(dòng)干預(yù)、糖尿病教育和自我血糖監(jiān)測(cè)等五個(gè)方面。在臨床上糖尿病治療仍是以藥物為主，然而藥物治療容易帶來(lái)一些副作用。近年來(lái)，運(yùn)動(dòng)已成為糖尿病預(yù)防和治療的有效手段，但有關(guān)運(yùn)動(dòng)防治糖尿病的具體機(jī)制尚未完全明確，還有待進(jìn)一步探索。因此，本研究通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)，注射小劑量鏈脲佐菌素建立糖尿病模型大鼠，并對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行8周游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)，觀察游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠血糖、血脂代謝和骨骼肌AMPK、GLUT4蛋白表達(dá)的影響，旨在為運(yùn)動(dòng)防治糖尿病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

選用6周齡的SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體重130±20g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCKX(粵)2013-0002。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC，n=10)和模型組(n=30)，NC組大鼠普通飼料喂養(yǎng)，模型組大鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)8周后，禁食12h，行腹腔注射小劑量的鏈尿佐菌素(STZ，30mg/kg)，最終形成糖尿病模型大鼠有25只(成模率83%)。再將糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病安靜組(DM，n=12)和糖尿病運(yùn)動(dòng)組(DME，n=13)。所有大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食，每日添加足夠的飼料，定期更換墊料，室內(nèi)溫度為24±2℃，相對(duì)濕度40%～60%，自然光照。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

糖尿病運(yùn)動(dòng)組(DME)大鼠進(jìn)行無(wú)負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)8周，先進(jìn)行適應(yīng)性游泳運(yùn)動(dòng)1周，前兩天每天運(yùn)動(dòng)20min，之后每天逐步增加10～20min。從第二周開(kāi)始每天運(yùn)動(dòng)60min，1次/天，6次/周。運(yùn)動(dòng)時(shí)間統(tǒng)一為每天晚上18:00～21:00，水溫30±2℃，水深﹥65cm，保證平均每只老鼠擁有足夠的活動(dòng)面積(≥200cm2)。

1.3 取材與指標(biāo)檢測(cè)

最后一次游泳運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，所有大鼠禁食，空腹12h，行腹腔注射水合氯醛(0.3ml/100g)，待大鼠麻醉后置于冰塊上，迅速采集血液、股四頭肌等組織。腹主動(dòng)脈取血于抗凝管內(nèi)靜置1h后，4℃、3000轉(zhuǎn)/min，離心10min，取血清分裝于EP管，-20℃冰箱保存待測(cè)血液指標(biāo)(FBG、FINS、血脂四項(xiàng)等)。大鼠股四頭肌用4℃生理鹽水清洗血漬，吸干，分成數(shù)段后錫箔紙包裹放液氮灌中速凍，之后轉(zhuǎn)存至-80℃超低溫冰箱，用于檢測(cè)骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表達(dá)。空腹胰島素(FINS)和血脂四項(xiàng)(TG、TC、LDL-C、HDL-C)的檢測(cè)采用聯(lián)酶免疫吸附測(cè)定法，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；AMPK和GLUT4蛋白表達(dá)采用Western Blot法。以上各實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行。

1.4 數(shù)理統(tǒng)計(jì)

運(yùn)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本研究中所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為顯著性水平，P<0.01為非常顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、ISI 的變化

如表1所示，與NC組相比，DM組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR均顯著升高(P<0.05)，而ISI顯著降低(P<0.05)。與DM組相比，DME組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR均顯著降低(P<0.05)，ISI顯著升高(P<0.01)。

表1 各組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR和ISI的變化(M±SD,單位：mmol/L)

2.2 各組大鼠TG、TC、HDL-C、LDL-C的變化

如表2所示，與NC組比，DM組大鼠TC、TG和LDL-C含量均顯著增加(P<0.01)，而HDL-C含量顯著減少(P<0.01)；與DM組相比，DME組大鼠TC、TG、LDL-C含量均顯著降低(P<0.01)，而HDL-C含量顯著增加(P<0.05)。

表2 各組大鼠TG、TC、HDL-C和LDL-C的變化(M±SD單位：mmol/L)

2.3 各組大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表達(dá)量的變化

如表3所示，與NC組比，DM組大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)；與DM組相比，DME組大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)。

表3 各組大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表達(dá)量的變化(M±SD)

3 討論

3.1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠血糖及胰島素抵抗的影響

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，其發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前認(rèn)為，胰島素分泌不足和/或胰島素抵抗均有可能引起糖尿病。糖尿病患者以高血糖為主要特點(diǎn)，典型的臨床癥狀是“三多一少”癥，即多飲、多尿、多食和體重減少。正常生理情況下，機(jī)體糖代謝的調(diào)節(jié)是由胰島素和胰高血糖素共同完成。進(jìn)食后，胰島素分泌增多，有利于細(xì)胞組織對(duì)葡萄糖的攝取利用，促進(jìn)糖合成，減少糖異生；饑餓時(shí)，胰高血糖素分泌增多，糖分解和糖異生加強(qiáng)。胰島素和胰高血糖素的協(xié)調(diào)控制維持著機(jī)體糖代謝的平衡。研究表明，長(zhǎng)期高脂飲食結(jié)合鏈脲佐菌素能使大鼠形成糖尿病[1]。本研究結(jié)果顯示(見(jiàn)表1)，與NC組相比，DM和DME組，F(xiàn)BG、FINS和HOMA-IR均顯著升高(P<0.05)，ISI顯著降低(P<0.05),提示8周高脂飲食和注射小劑量鏈脲佐菌素使大鼠血糖明顯升高，并且出現(xiàn)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，說(shuō)明成功誘導(dǎo)出糖尿病大鼠模型，符合糖尿病動(dòng)物模型制備要求，為后續(xù)運(yùn)動(dòng)干預(yù)提供了基礎(chǔ)。

運(yùn)動(dòng)作為多種慢性疾病干預(yù)手段，發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。研究表明，不管是有氧運(yùn)動(dòng)還是抗阻運(yùn)動(dòng)，都能有效改善血糖調(diào)節(jié)和胰島素抵抗[2、3]。合理的運(yùn)動(dòng)鍛煉可以減輕體重，降低人和大鼠FBG、FINS，增加胰島素敏感性和糖耐量，改善胰島素抵抗癥狀[4]。Motahari等[5]發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)不僅可以降低糖尿病患者血糖、胰島素水平和胰島素抵抗，還能增強(qiáng)胰島素敏感性，減輕高胰島素血癥。Snowling和Hopkins對(duì)糖尿病患者進(jìn)行有氧、抗阻和聯(lián)合訓(xùn)練干預(yù)研究發(fā)現(xiàn)，三種運(yùn)動(dòng)模式都可以改善患者HbA1c、空腹和餐后血糖水平、胰島素敏感性和空腹胰島素水平，并且不同運(yùn)動(dòng)模式之間干預(yù)效果差異較小[6]。Jelleyman等[7]研究表明，高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練可以增加骨骼肌氧化能力、血糖控制和胰島素敏感性。本研究結(jié)果顯示(見(jiàn)表1)，與DM組相比，DME組，F(xiàn)BG、FINS和HOMA-IR均顯著降低(P<0.05)，ISI顯著升高(P<0.05)；說(shuō)明游泳運(yùn)動(dòng)能使糖尿病大鼠FBG、FINS水平和HOMA-IR顯著下降，ISI顯著升高，大鼠高血糖、高胰島素和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)得到緩解，游泳運(yùn)動(dòng)能夠改善糖尿病大鼠血糖代謝狀況及胰島素敏感性。運(yùn)動(dòng)可以增加骨骼肌線粒體含量和氧化酶，通過(guò)胰島素依賴(lài)和胰島素非依賴(lài)機(jī)制增強(qiáng)骨骼肌葡萄糖攝取，改善血糖調(diào)節(jié)，增加的胰島素敏感性[8、9]。

3.2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠TG、TC、HDL-C、LDL-C的影響

脂代謝在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色，脂代謝紊亂會(huì)引起超重、肥胖、胰島素抵抗等，導(dǎo)致糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生。研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)有利于維持脂代謝平衡，改善糖尿病及其并發(fā)癥[10]。血漿中FFA、TG、LDL含量增加，是導(dǎo)致IR的重要原因之一[11]，F(xiàn)FA和TG升高會(huì)抑制胰島素介導(dǎo)的葡萄糖的攝取、氧化和利用。本研究結(jié)果顯示(見(jiàn)表2)，糖尿病大鼠血清TG、TC和LDL-C含量均明顯高于NC組(P<0.05)，而HDL-C含量明顯低于NC組(P<0.01)。提示長(zhǎng)期的高脂飲食攝入過(guò)多的能量，使體內(nèi)FFA和TG、TC、LDL-C含量升高，導(dǎo)致大鼠脂代謝異常。以往研究表明，運(yùn)動(dòng)可以改善機(jī)體的糖脂代謝，降低血清TG、TC、LDL含量，提高HDL，減輕肥胖造成高血脂現(xiàn)象[12]。8周以上的游泳運(yùn)動(dòng)不但具有減肥、降低血脂、改善胰島素敏感性的作用，而且還可以使2型糖尿病大鼠機(jī)體的高血糖水平明顯減低[13]。本研究結(jié)果顯示(見(jiàn)表2)，與DM組比較，DME組大鼠HDL-C顯著升高(P<0.05)，F(xiàn)FA、TG、TC和LDL-C水平均顯著均降低(P<0.01)，提示運(yùn)動(dòng)能降低大鼠血清TG、TC和LDL-C水平，增加HDL-C含量。結(jié)合本研究糖尿病大鼠FBG、FINS和ISI，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)能增加大鼠胰島素敏感性，降低空腹胰島素和胰島素抵抗指數(shù)，運(yùn)動(dòng)改善高脂飲食大鼠糖尿病癥狀的機(jī)制可能與糾正脂代謝紊亂有關(guān)。運(yùn)動(dòng)使骨骼肌對(duì)脂肪酸氧化能力增強(qiáng)，減少脂質(zhì)異位沉積，改變血清脂蛋白的成分比例，降低血脂F(xiàn)FA和TG濃度，進(jìn)而改善脂代謝紊亂。

3.3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表達(dá)水平的影響

AMPK(腺苷酸活化蛋白激酶)在調(diào)節(jié)生物能量代謝中起到關(guān)鍵作用，是主要的非胰島素依賴(lài)型葡萄糖攝取調(diào)節(jié)劑，通過(guò)運(yùn)動(dòng)激活骨骼肌中的AMPK可誘導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)合成以及營(yíng)養(yǎng)代謝[14]。AMPK在運(yùn)動(dòng)后保持短暫激活，并調(diào)節(jié)涉及線粒體生物功能以及氧化能力的幾個(gè)下游靶標(biāo)，有氧運(yùn)動(dòng)增加骨骼肌線粒體含量和氧化酶，從而改善葡萄糖和脂肪酸氧化，并增加參與胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的AMPK蛋白表達(dá)[15、16]。Stephens等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)骨骼肌細(xì)胞時(shí)，應(yīng)用AMPK作為特異性激活劑，能夠增加胰島素刺激后葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。另外，骨骼肌對(duì)葡萄糖的利用效率影響到機(jī)體血糖調(diào)節(jié)，胰島素介導(dǎo)下葡萄糖的攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制比較復(fù)雜，GLUT4(葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4)對(duì)維持骨骼肌細(xì)胞葡萄糖穩(wěn)態(tài)起到重要作用[18、19]。研究顯示，降低脂肪組織GLUT4表達(dá)，胰島素刺激的骨骼肌對(duì)脂肪攝取能力會(huì)下降，胰島素抵抗與肥胖大鼠骨骼肌GLUT4下降有關(guān)[20、21]。運(yùn)動(dòng)可以誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞內(nèi)GLUT4易位，促進(jìn)骨骼肌對(duì)葡萄糖的攝取，耐力訓(xùn)練、高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練和力量訓(xùn)練均可引起糖尿病患者骨骼肌GLUT4蛋白含量增加[22-24]。本研究結(jié)果顯示(見(jiàn)表3)，與DM組相比，DME組大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.01)，提示DME組大鼠血糖、胰島素敏感性及血脂(TG、TC、LDL-C)改善可能與AMPK和GLUT4蛋白表達(dá)增加有關(guān)。有氧運(yùn)動(dòng)能夠激活A(yù)MPK、增加骨骼肌細(xì)胞GLUT4轉(zhuǎn)位，通過(guò)AMPK信號(hào)通路或PI3K/AKT/GLUT4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)葡萄糖的攝取、利用和脂肪酸的氧化，減少糖原合成與脂質(zhì)的堆積，特別是骨骼肌和肝臟脂肪的異位堆積，AMPK還可能通過(guò)非胰島素依賴(lài)途徑調(diào)節(jié)糖脂代謝，改善大鼠胰島素抵抗[25-27]。

4 結(jié)論

8周游泳運(yùn)動(dòng)能夠較好地控制糖尿病大鼠血糖、血脂水平，提高大鼠胰島素敏感性；游泳運(yùn)動(dòng)能夠增加大鼠骨骼肌AMPK和GLUT4的蛋白表達(dá)，改善糖尿病大鼠的胰島素抵抗。