多酚交聯(lián)的殼聚糖水凝膠的制備及其性質(zhì)研究

＊胡亞云 張英萍 陳琳

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西 712100）

水凝膠是由水溶性高分子經(jīng)過交聯(lián)后形成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能夠吸收并保持大量的水，其具有良好的生物相容性和親水性[1]，類似生物體軟組織，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[2]。殼聚糖基水凝膠具有良好的細(xì)胞相容性、可降解性和低毒性，在食品生物醫(yī)藥領(lǐng)域被廣泛研究[3]。以單一的殼聚糖為原料制成的水凝膠存在機(jī)械性能及保水性差等不足使其應(yīng)用受限。將多酚物質(zhì)和殼聚糖混合后制備的多酚/殼聚糖水凝膠綜合了多酚生物活性及殼聚糖的優(yōu)良特性，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

1.材料與方法

(1)材料與儀器

殼聚糖（CS），脫乙酰度＞95%，黏度100～200mPa·s上海麥克林生化科技有限公司；沒食子酸（GA）和MTT，Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司；30%過氧化氫（30% H2O2），深圳華大基因科技有限公司。

M4 Victor X3多功能酶標(biāo)儀，上海美谷分子儀器有限公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)薩里穩(wěn)定微系統(tǒng)有限公司；BSC-1500IIA2-X生物安全柜，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

①氧化沒食子酸的制備。將沒食子酸和過氧化氫混合，然后將該溶液體系放入90℃的水浴鍋中加熱2h，取出后在室溫冷卻30min。隨后將GA溶液冷凍干燥，以完全除去H2O2。

②水凝膠的制備。將殼聚糖溶液與不同質(zhì)量濃度的沒食子酸混合，分裝到12孔板，在-18℃冰箱中放置12h后取出，室溫解凍2h得到水凝膠。

③水凝膠的表征。A.傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）。參考Thanyacharoen[4]的方法，用傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）對(duì)樣品官能團(tuán)信息進(jìn)行測(cè)定。

B.流變測(cè)試。參考Guaresti[5]的方法，用美國(guó)Waters TA流變儀（DHR-1）進(jìn)行測(cè)定。

C.質(zhì)構(gòu)測(cè)試。參考Qi[6]的方法，使用英國(guó)STABLEMICVO公司TA.XT PLUS/50進(jìn)行循環(huán)壓縮測(cè)試。

D.差示掃描量熱儀（DSC）。參考Kandile[7]的方法進(jìn)行測(cè)定。

E.溶脹率。水凝膠溶脹率的測(cè)定首先將在室溫下在去離子水中平衡的冰凝膠稱重（WE），然后將其凍干并再次稱重（WO）。溶脹率SR（%）通過公式(1)計(jì)算：

式中：SR表示溶脹率，%；WE表示冰凝膠在室溫下在去離子水中平衡重量，g；Wo表示冰凝膠凍干后的重量，g。

④體外細(xì)胞毒性測(cè)定。根據(jù)先前的方法[8]對(duì)水凝膠體外細(xì)胞毒性進(jìn)行測(cè)定。細(xì)胞活性按照公式（2）計(jì)算：

式中：Ap表示處理組在490nm處的吸光度值；Ac表示對(duì)照組在490nm處的吸光度值。

(3)數(shù)據(jù)處理

單項(xiàng)實(shí)驗(yàn)最少重復(fù)3次，結(jié)果表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS V18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)性分析，如果方差分析差異性顯著（p＜0.05），則使用Duncan進(jìn)行多重比較。

2.結(jié)果與分析

(1)傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析

圖1顯示，與CS的峰相比，6種樣品在1631cm-1附近顯示出明顯的峰，對(duì)應(yīng)于CS和GA之間的C=N鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰，表明CS與GA之間形成了席夫堿鍵[9]。而沒食子酸或殼聚糖單獨(dú)存在時(shí)，不能檢測(cè)到酯鍵和C=N鍵。這些結(jié)果表明水凝膠中沒食子酸與殼聚糖的綴合[10]。887cm-1的吸收峰為糖環(huán)伸縮振動(dòng)吸收峰，說明CS和OGA反應(yīng)并沒改變CS的骨架。

圖1 CS、GA和不同濃度CS-GA水凝膠的FTIR光譜

(2)流變學(xué)測(cè)試

由圖2可知?dú)ぞ厶撬z的儲(chǔ)能模量值均隨著OGA濃度的增加呈上升趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著殼聚糖和沒食子酸濃度的增加，二者所提供的交聯(lián)位點(diǎn)增加，使得交聯(lián)后分子鏈纏繞聚集更加緊密。同時(shí)在ω=0.01～100rad/s范圍內(nèi)，儲(chǔ)能模量＞損耗模量，即G′＞G″，這說明6種水凝膠表現(xiàn)為粘彈性固體。

圖2 不同濃度CS-GA水凝膠的儲(chǔ)能模量(a)和損耗模量(b)隨角頻率(0.1～100rad/s)的變化曲線圖

(3)質(zhì)構(gòu)測(cè)試

圖3所示，隨著GA濃度的增加，顯著提高了水凝膠的硬度，形成更堅(jiān)固耐用的水凝膠。另外，2% CS比1.5% CS制備的水凝膠硬度顯著提高，這是由于高濃度殼聚糖可以形成更致密的結(jié)構(gòu)。其次，2%的殼聚糖由于其結(jié)構(gòu)更加致密，含水量減小。

圖3 不同濃度CS-GA水凝膠的硬度圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）

(4)溶脹性

圖4可知，6種水凝膠的溶脹率均在60%以上，最高溶脹率可達(dá)到332.89±20.5%，說明6種水凝膠均具有良好的溶脹性能。水凝膠樣品的溶脹率均隨著GA濃度的升高而降低，這主要是因?yàn)樗z網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)交聯(lián)纏結(jié)加劇導(dǎo)致水凝膠內(nèi)部更高的交聯(lián)強(qiáng)度，削弱了水分子正常滲透。2% CS水凝膠溶脹率顯著小于1.5% CS，這是更高的濃度提供更多的交聯(lián)位點(diǎn)，使分子間存在更高的交聯(lián)密度，形成了更加緊密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖4 不同濃度CS-GA水凝膠的溶脹率圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）

(5)熱穩(wěn)定性

圖5為6種水凝膠在20～250℃的升溫程序內(nèi)的熱流變化。CS1.5%-GA1%、CS1.5%-GA2%、CS1.5%-GA3%、CS2%-GA1%、CS2%-GA2%、CS2%-GA3%水凝膠的最大降解溫度分別為113℃、113℃、116℃、114℃、113℃、116℃。100℃附近的降解變化可能歸因于殼聚糖解聚產(chǎn)物的降解。6種凝膠的熱降解溫度結(jié)果相差不大，但總體而言，更高的GA濃度即更高的交聯(lián)程度，可能使CS結(jié)晶度提高使其熱穩(wěn)定性提高。

圖5 不同濃度CS-GA水凝膠的DSC曲線

(6)體外細(xì)胞毒性

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，6種CS-GA水凝膠的細(xì)胞存活率均在100%以上。結(jié)果說明水凝膠對(duì)C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯抑制作用，而且能夠促進(jìn)C2C12細(xì)胞的增殖，具有良好的細(xì)胞相容性。另外隨著GA濃度的增加，細(xì)胞存活率顯著降低，原因可能是隨著水凝膠內(nèi)部交聯(lián)程度的進(jìn)一步增加，內(nèi)部供細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的孔隙進(jìn)一步減小，從而導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低。

圖6 不同濃度CS-GA水凝膠的細(xì)胞存活率圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）

3.結(jié)論

研究結(jié)果表明，使用CS和GA通過冷凍-解凍的方法來制備水凝膠是切實(shí)可行的。CS與OGA通過席夫堿反應(yīng)進(jìn)行交聯(lián)，冷凍解凍進(jìn)一步形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。GA的加入不僅水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度得到了改善，還具有良好的熱穩(wěn)定性，較好的溶脹性能。體外細(xì)胞毒性結(jié)果表明，CS-GA水凝膠能促進(jìn)C2C12細(xì)胞的增殖，具有良好的細(xì)胞相容性。以上結(jié)果表明，含有CS-GA水凝膠在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有很大的應(yīng)用前景，尤其適用于作為傷口敷料。