維生素類(lèi)物質(zhì)在豬精液常溫保存中的應(yīng)用研究進(jìn)展

李雨晴，胡冰艷，龐衛(wèi)軍

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

目前，人工授精技術(shù)在大多數(shù)生豬生產(chǎn)國(guó)中的應(yīng)用高達(dá)90%以上，是應(yīng)用最廣泛、最有效的生豬繁殖生物技術(shù)。豬人工授精技術(shù)以種豬培育和商品豬生產(chǎn)為目的，提高了生產(chǎn)繁育的安全性，降低在自由交配過(guò)程中的疾病傳播，從而提高養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，是科學(xué)養(yǎng)豬、實(shí)現(xiàn)養(yǎng)豬生產(chǎn)現(xiàn)代化的重要手段。由于豬的精液保存是實(shí)施人工授精的重要環(huán)節(jié)，且公豬的精液品質(zhì)直接決定著母豬的受胎率和產(chǎn)仔數(shù)，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)種公豬的精液質(zhì)量要求更高。然而豬精液在常溫保存下容易受到溫度、滲透壓、pH、微生物和活性氧等影響，導(dǎo)致精子活性和受精能力下降。此外，公豬精子細(xì)胞膜中多不飽和脂肪酸(PUFAs)的含量較高，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化特別敏感，極易受到氧化損傷。

近年研究發(fā)現(xiàn)，維生素B12、C和E等物質(zhì)因其較強(qiáng)的抗氧化特性，可以有效降低精液中氧化物的濃度，減少精子在儲(chǔ)存過(guò)程中對(duì)氧化應(yīng)激的影響，從而提高精子質(zhì)量。維生素類(lèi)物質(zhì)，是人和動(dòng)物生長(zhǎng)所必需的少量有機(jī)化合物，目前因具有較強(qiáng)的抗氧化活性而備受關(guān)注。Vamawskij等發(fā)現(xiàn)在綿羊精液稀釋液中添加維生素E有利于提高冷凍后精子的活力，人們開(kāi)始意識(shí)到維生素在精液保存中的重要作用。研究表明，在精液稀釋液中加入適當(dāng)?shù)木S生素類(lèi)物質(zhì)能夠增加精子頂體完整率，有效減緩活性氧(ROS)過(guò)量積累對(duì)精子細(xì)胞造成的損傷。

本文主要就維生素類(lèi)物質(zhì)在豬精液常溫保存中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為豬精液常溫保存稀釋劑的改進(jìn)和人工授精技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 豬精液常溫保存技術(shù)概述

隨著人工授精技術(shù)在生豬養(yǎng)殖業(yè)的廣泛應(yīng)用，精液保存的研究也成為了各方關(guān)注的焦點(diǎn)。目前精液保存方法有3種：(1)在15～25 ℃下進(jìn)行的常溫保存；(2)在0～4 ℃下進(jìn)行的低溫保存；(3)在-196℃環(huán)境下進(jìn)行的冷凍保存。由于豬精子細(xì)胞膜的膽固醇/磷脂較低，精子對(duì)低溫的耐受能力較差，且經(jīng)過(guò)冷凍保存后的精子活力不易恢復(fù)、受精能力和受孕率都低，所以我國(guó)大多數(shù)規(guī)?；i場(chǎng)在進(jìn)行人工授精時(shí)選擇常溫保存的精液。公豬精液一般保存在16～18 ℃的環(huán)境中，此溫度降低了精子新陳代謝和能量消耗，使精子處于一個(gè)可逆性的靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)溫度回升至37 ℃時(shí)，又可以恢復(fù)正常的活力和代謝水平，精子受精能力不會(huì)受到太大的影響。且常溫保存技術(shù)對(duì)設(shè)備、生產(chǎn)成本要求低和人員操作簡(jiǎn)單。因此，與其他方法相比，常溫保存精液是在生產(chǎn)實(shí)踐中進(jìn)行豬人工授精的首要選擇。

然而常溫保存的精液同樣存在一定問(wèn)題，比如精子壽命有限，在體外只能保存7 d左右，但保存有效期一般僅為2～3 d；隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，精子活力明顯下降, 嚴(yán)重影響豬的受精率、受胎率和胚胎早期死亡等。據(jù)報(bào)道，豬精液體外保存的時(shí)效與ROS自由基的累積密切相關(guān)，如超氧陰離子、羥基自由基和H2O2等。ROS可通過(guò)誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化、損傷DNA和蛋白質(zhì)以及耗盡ATP等直接損傷精子，導(dǎo)致精細(xì)胞凋亡和死亡，還可以破壞精子的酶防御系統(tǒng)，使其無(wú)法忍受在精液保存過(guò)程中遇到的氧化攻擊，間接地對(duì)精子產(chǎn)生氧化損傷?？傊?，ROS可以通過(guò)多種途徑對(duì)精子造成不同程度的損傷，進(jìn)而影響精液品質(zhì)。豬精子質(zhì)膜中PUFAs含量高，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的敏感性也高于其他物種，更易受到氧化應(yīng)激傷害。因此需要在豬精液稀釋劑中添加適當(dāng)?shù)目寡趸镔|(zhì)以緩解不利因素對(duì)精子造成的毒害作用，提高常溫保存的精液品質(zhì)。

2 維生素類(lèi)物質(zhì)在豬精液常溫保存中的應(yīng)用

在豬常溫精液保存中常用的抗氧化劑有酶類(lèi)抗氧化劑，比如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)和過(guò)氧化氫酶(CAT)等；非酶類(lèi)抗氧化劑，比如氨基酸及多肽類(lèi)、維生素類(lèi)、生物類(lèi)黃酮和類(lèi)胡蘿卜素等。研究發(fā)現(xiàn)，維生素作為一類(lèi)抗氧化物質(zhì)，可以有效降低溶液中氧化物的濃度。目前維生素B12、C和E在豬精液常溫保存中的研究較多，但其他維生素類(lèi)化合物如D-異抗壞血酸鈉、維生素P、番茄紅素和煙酸等在一定程度上也會(huì)影響精液質(zhì)量。

2.1 維生素B12

維生素B12，又稱(chēng)鈷胺素，主要存在肉類(lèi)、魚(yú)和奶制品中，是目前人體內(nèi)唯一含金屬的維生素。據(jù)研究，維生素B12具有抗氧化性，可保護(hù)DNA免受自由基的損傷，同時(shí)作為一種生物活性物質(zhì)，可以改善體外精子周?chē)h(huán)境，提升精子活力和生存率等。研究表明，在稀釋液中添加海藻糖和維生素B12可以使保存3 d的精子成活率仍保持在70%左右。2018年馬紅發(fā)現(xiàn)，在民豬的精液常溫保存中添加45 mmol/L維生素B12處理組的精子成活率和質(zhì)膜完整性顯著高于空白對(duì)照組，表明補(bǔ)充維生素B12對(duì)精子活力、精子發(fā)生和維持正常精子功能都至關(guān)重要。據(jù)報(bào)道，維生素B12的缺乏或過(guò)量對(duì)精子內(nèi)DNA的合成會(huì)造成嚴(yán)重影響，致使功能下降，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了缺乏維生素B12可阻滯精子發(fā)生。綜上，維生素B12可以通過(guò)提高精子活力、維持精子發(fā)生和保護(hù)質(zhì)膜完整性等作用，改善豬常溫保存中精子的質(zhì)量。此外，維生素B12的濃度含量也會(huì)在一定程度上影響保存效果，因此在實(shí)際生產(chǎn)中要嚴(yán)格控制維生素的濃度，以免對(duì)精子產(chǎn)生不利影響。

2.2 維生素C

維生素C，是一種多羥基化合物，廣泛存在新鮮蔬菜和水果中，因具有酸的性質(zhì)，又被稱(chēng)為抗壞血酸。維生素C是血漿中主要的水溶性抗氧化劑，具有高效的自由基清除能力，可以防止精子DNA的氧化損傷、減少脂質(zhì)過(guò)氧化、中和H2O2和O2-的不利影響和有效提高精子的成活率和頂體的完整度等功能。研究發(fā)現(xiàn)，在民豬精液常溫稀釋液中添加30 mmol/L維生素C可以顯著提高民豬精子質(zhì)膜完整性、精子成活率等指標(biāo)。在大白公豬常溫精液保存劑中添加維生素C，對(duì)常溫保存6 d后精子的相關(guān)抗氧化酶和凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，稀釋劑中添加維生素C組的總抗氧化能力(T-AOC)、還原型谷胱甘肽(GSH)、SOD和CAT活性均顯著高于對(duì)照組，表明維生素C可以減少精子細(xì)胞凋亡的數(shù)量，提高精子抗氧化能力。據(jù)研究，在大白公豬常溫精液稀釋劑中添加0.068 g/L維生素C可以提高豬精子活率、質(zhì)膜完整性率和頂體完整率。此外，任子利等在改進(jìn)豬精液稀釋液中添加5.0 g/L維生素C可以明顯改善藏豬精液在4 ℃條件下保存的效果，顯著提高精子活率、頂體完整性和質(zhì)膜完整性，并且可以明顯降低4 ℃保存對(duì)藏豬精子畸形率和精子全基因組DNA甲基化的影響?？梢?jiàn)，維生素C在豬精液液體保存技術(shù)中發(fā)揮重要作用(表1)，在維持和保護(hù)精子抗氧化功能的同時(shí)，也可能作為一種抗菌抑菌物質(zhì)以調(diào)節(jié)精子細(xì)胞免疫功能，降低精子保存過(guò)程中因多種因素造成的損傷。

表1 維生素C在豬精液液體保存技術(shù)中的應(yīng)用

2.3 維生素E

維生素E，又名α-生育酚，作為人和動(dòng)物機(jī)體一種必需的營(yíng)養(yǎng)素，具有保護(hù)機(jī)體組織結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗菌、抗氧化和抗應(yīng)激等多方面的生物學(xué)功能。近年研究發(fā)現(xiàn)，維生素E作為親脂性抗氧化劑，帶有過(guò)氧化氫自由基清除基團(tuán)，通過(guò)與脂質(zhì)過(guò)氧化鏈中產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基反應(yīng)來(lái)保護(hù)精子膜不被氧化，維持精細(xì)胞膜的穩(wěn)定性；還能抑制精子中自由基的形成，提高精子頂體完整率及降低精子的畸形率。Cerolini等在豬精液稀釋液中添加維生素E能防止常溫保存5 d的精液中不飽和脂肪酸22：6 n-3的氧化還原，提高精子活力。研究表明，在精液中添加200 μmol/L維生素E可以有效降低在15 ℃條件下儲(chǔ)存72 h的公豬精液中丙二醛(MDA)含量。研究發(fā)現(xiàn)，添加200 μmol/L維生素E有助于豬精液常溫保存中精子的質(zhì)膜完整，使精液中的ROS維持在較低水平。據(jù)研究，在常溫保存精液中添加25 mmol/L維生素E的精子成活率和質(zhì)膜完整性顯著高于對(duì)照組，而且保存5 d的精子仍可在生產(chǎn)中使用。此外，在公豬常溫保存精液稀釋粉中添加適量的維生素E可以減緩精子頂體畸形率的發(fā)生, 增加頂體完整率，有效減緩?fù)饨鐚?duì)精子的傷害作用。除抗氧化作用外，維生素E可以通過(guò)減少凋亡基因的表達(dá)來(lái)抑制ROS的生成，說(shuō)明維生素E添加至精液保存液中可能會(huì)提高精細(xì)胞的免疫活性。然而公豬若缺乏維生素E會(huì)導(dǎo)致精子活力降低、數(shù)量減少和質(zhì)量低下等?？傊S生素E在豬常溫精液保存中發(fā)揮重要作用(表2)，具有提高精子活力、增加頂體完整率、降低精子畸形率、減少M(fèi)AD和ROS含量等多樣性功能，可有效提升豬精液儲(chǔ)存過(guò)程中的精子品質(zhì)，有利于人工授精技術(shù)的廣泛推廣應(yīng)用。此外，維生素E含量也會(huì)在一定程度上影響保存效果，因此在實(shí)際生產(chǎn)中要嚴(yán)格控制維生素的添加量，以免對(duì)精子產(chǎn)生不利影響。

表2 維生素E在豬精液常溫保存技術(shù)中的應(yīng)用

2.4 其他

D-異抗壞血酸鈉(表3)，又名異抗壞血酸鈉、赤藻糖酸鈉和異維生素C鈉，是一種新型生物助色劑，因抗氧化、無(wú)毒副作用，廣泛用于肉類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、蔬菜和罐頭等食品中防腐保鮮助色。D-異抗壞血酸鈉是一種水溶性抗氧化劑，它的分子結(jié)構(gòu)易于脫氫，容易與ROS發(fā)生反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在豬常溫保存的基礎(chǔ)精液中添加0.006 mg/mL D-異抗壞血酸鈉時(shí)效果最好，能夠有效提升精子活率、精液總抗氧化能力和保護(hù)質(zhì)膜完整性等指標(biāo)，同時(shí)可降低ROS水平。表明D-異抗壞血酸鈉在豬精液常溫保存中可以全面綜合改善精液質(zhì)量。

維生素P(表3)，又稱(chēng)蘆丁、路通和蕓香甙等，為黃酮類(lèi)化合物，來(lái)源于蕓香葉、煙葉、橙皮和蕎麥花等，是清除自由基的強(qiáng)氧化劑，具有增強(qiáng)機(jī)體對(duì)傳染性疾病的抵抗力及協(xié)同其他類(lèi)維生素共同發(fā)揮抗氧化等作用。劉亞偉等發(fā)現(xiàn)在豬三種精液稀釋液中添加維生素P對(duì)精子具有保護(hù)作用，可以明顯延長(zhǎng)豬精子常溫保存的時(shí)間，顯著提高精子的活力、成活率和頂體完整性等相關(guān)指標(biāo)，但是維生素P的最佳適宜添加濃度并不一樣，可能是由于三種稀釋液種類(lèi)及成分的影響。目前對(duì)于維生素P在精液保存中的研究還比較少，未來(lái)將會(huì)是一個(gè)重要研究方向。

番茄紅素(表3)，又稱(chēng)茄紅素，具有抗氧化、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和降低核酸損傷等多種重要功效。研究表明，番茄紅素是維生素類(lèi)化合物中有效的抗氧化劑，有極強(qiáng)的抗氧化性和自由基清除能力，它去除單線(xiàn)態(tài)氧(1O2)的能力是β-胡蘿卜素的2倍、維生素E的100倍。豬冷凍稀釋液中添加一定濃度的番茄紅素，可以顯著提高解凍后的精子質(zhì)量，且當(dāng)添加濃度為2.0 μmol/L時(shí)，豬精子活率、線(xiàn)粒體活性、質(zhì)膜完整性和頂體完整性較好。因此，番茄紅素作為一種安全無(wú)毒的天然抗氧化劑，未來(lái)可以考慮添加到豬精液常溫保存稀釋劑中研究其抗氧化效果。煙酸(表3)，又稱(chēng)尼克酸，是維生素B3的衍生物，是人體中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分，具有抗氧化、保護(hù)細(xì)胞膜、穩(wěn)定自由基和活性氧等功能。研究證明，煙酸不僅能提高野豬精子在常溫保存中的存活率和頂體完整性，也能提升冷凍解凍后精子的生存能力和線(xiàn)粒體活性，同時(shí)可以抑制頂體反應(yīng)，進(jìn)而改善精子質(zhì)量。Lee等發(fā)現(xiàn)煙酸可以提高凍融豬精子質(zhì)膜完整性，增加PUFAs含量，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。綜上，由于精子對(duì)溫度相對(duì)敏感，低溫或冷凍保存下的精子活力會(huì)受到抑制，煙酸可以減輕豬精液在儲(chǔ)存過(guò)程中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，通過(guò)抑制頂體反應(yīng)和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等途徑，提升精液品質(zhì)。

表3 其他類(lèi)維生素在豬精液保存技術(shù)中的應(yīng)用

3 總結(jié)與展望

豬精液保存作為人工授精中的關(guān)鍵步驟，對(duì)提高生豬繁殖性能具有重要意義。維生素類(lèi)物質(zhì)作為抗氧化劑在精液保存中的研究具有廣闊的應(yīng)用前景，尤其對(duì)于提高人工授精的精子受精率也有非常重要意義。目前維生素類(lèi)物質(zhì)在豬精液保存中的應(yīng)用存在以下問(wèn)題，并提出相應(yīng)的建議。

3.1 改變維生素理化性質(zhì)

維生素物質(zhì)本身穩(wěn)定性差，且部分脂溶性維生素具有高度親脂性，水溶解度低，很難將營(yíng)養(yǎng)成分混合到以水為基礎(chǔ)的精液稀釋劑中。未來(lái)可基于新型納米技術(shù)的制備以產(chǎn)生納米活性分子，從而改變維生素的溶解度、溶解速率、表面積和穩(wěn)定性等理化性質(zhì)。

3.2 研發(fā)生產(chǎn)復(fù)合維生素

現(xiàn)多數(shù)集中于研究單個(gè)維生素對(duì)豬精液保存的影響，但某單一維生素已不能有效發(fā)揮抗氧化作用。因此在實(shí)際生產(chǎn)中可通過(guò)多次科學(xué)配比實(shí)驗(yàn)，將兩種或兩種以上維生素同時(shí)添加至精液稀釋劑中，可能更有利于延長(zhǎng)精液體外保存時(shí)間。此外，研發(fā)生產(chǎn)復(fù)合維生素能有效降低養(yǎng)豬成本，促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)更好發(fā)展。

3.3 探究維生素類(lèi)物質(zhì)對(duì)精子保護(hù)作用機(jī)制

已證明維生素作為一種抗氧化劑可以顯著改善精液質(zhì)量，但其對(duì)于精子保護(hù)作用機(jī)制并不是十分清楚。在未來(lái)研究中，可將分子生物技術(shù)和精子品質(zhì)分析技術(shù)聯(lián)合起來(lái)探究作用機(jī)理，更進(jìn)一步探索維生素類(lèi)物質(zhì)對(duì)精子的分子調(diào)控機(jī)制，這也是未來(lái)重要研究方向。