復合益生菌發(fā)酵飼料對大白公豬精液品質(zhì)的影響

杜朝暉，孫昌輝，張 眉，梁國棟，孫世鐸，史新娥，李 曉，楊公社,*，胡建宏,*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院,陜西 楊凌712100；2.陜西省畜牧技術(shù)推廣總站；3.大荔縣眾康家畜良種繁育有限公司)

近年來，人工授精技術(shù)的飛速發(fā)展，使其在降低疾病傳播風險、提高優(yōu)良公豬的利用率、促進優(yōu)良品種選育等方面發(fā)揮了重要作用，但是也對精液的品質(zhì)提出了更高的要求，精液品質(zhì)的好壞不僅是種公豬遺傳性能的體現(xiàn)，也是影響公豬繁殖力和母豬繁殖性能的重要因素。通過在日糧中添加抗生素的營養(yǎng)調(diào)控措施雖然有效提高了公豬精液質(zhì)量，但是長期的使用也導致出現(xiàn)了許多耐藥細菌。益生菌發(fā)酵飼料是能夠有效提高飼料適口性、營養(yǎng)利用度、畜禽生長性能和肉品質(zhì)，且更容易被畜禽采食、消化、吸收的新型環(huán)保飼料。飼料發(fā)酵之后既能改善飼料的營養(yǎng)價值和利用率，還能起到預消化，維持腸道微生物平衡，增強機體免疫力和促進生長的作用。沈?qū)W懷研究發(fā)現(xiàn)，母豬飼喂復方中藥發(fā)酵飼料有助于蛋白質(zhì)的代謝吸收和免疫功能的改善。任強等人研究證實，母豬飼喂益生菌發(fā)酵飼料可以提高采食量、飼料消化率以及繁殖性能，同時改善泌乳母豬乳品質(zhì)，緩解妊娠母豬便秘等等。但是目前益生菌發(fā)酵飼料影響公豬精液品質(zhì)的研究較少。

本試驗旨在探究復合益生菌發(fā)酵飼料對大白公豬血液生化指標、機體免疫力以及精液質(zhì)量的影響，從而為益生菌發(fā)酵飼料提高公豬精液品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計及日糧

試驗在大荔縣種公豬站進行，采取單因素試驗設(shè)計，選擇12頭日齡、體況相近的大白公豬，隨機分為2組，分別飼喂基礎(chǔ)日糧和發(fā)酵飼料?；A(chǔ)日糧參照NRC(2012)配制，日糧營養(yǎng)成分如表1。

表1 試驗日糧及其營養(yǎng)水平

1.2 飼養(yǎng)管理

正式試驗之前對豬舍、各種設(shè)備和器械全部進行清洗消毒。采用單欄飼養(yǎng)，每天分別于06：00、16:00飼喂2次，自由飲水。其他管理措施遵循常規(guī)操作。

1.3 公豬血液生理生化指標測定

耳緣靜脈法采血10 mL, 5 mL用Sysmex XT-4000自動全血細胞計數(shù)分析儀(日本希森美康公司)測定血常規(guī)參數(shù)。其余5 mL離心后吸出血清分裝標記，-20 ℃保存。用全自動生化分析儀(日立-7180，日本)測定血清常規(guī)生化指標。

1.4 公豬血清免疫球蛋白測定

采用ELISA試劑盒(上海恒遠)，嚴格按照試劑盒說明書操作，利用酶標儀在250nm波長測量各孔的OD值，然后根據(jù)公式換算得出結(jié)果，計算血清中Ig A、Ig G、Ig M含量。

1.5 精液BTS稀釋劑的制備以及豬精液的采集

精確稱量葡萄糖37.15 g，檸檬酸鈉6.00 g， EDTA1.25 g，碳酸氫鈉1.25 g，氯化鉀0.75 g，加入到1 L去離子水中，待完全溶解后過濾，4 ℃保存待用。

在第60 d和120 d，用手握法無菌采精，將所采精液混勻，經(jīng)過4層無菌濾紙過濾雜質(zhì)后用BTS稀釋劑對其稀釋，然后進行檢測。

1.6 公豬精液品質(zhì)測定指標與方法

1.6.1 精液量 收集公豬精液，過濾去除雜質(zhì)后采用電子秤(可精確到0.1 g)進行稱重測定，1 g相當于1 mL。

1.6.2 精子活率和密度的檢測 采用計算機自動分析系統(tǒng)(CASA)分別檢測第60 d和120 d的精子活率和密度。

1.6.3 精子頂體完整性檢測 使用FITC-PNA染色試劑盒(上海哈靈)分別檢測精子頂體完整性。

1.6.4 精子質(zhì)膜完整性檢測 使用SYBR-14/PI試劑盒(上海羽哚)分別檢測精子質(zhì)膜完整性。

1.6.5 線粒體膜電位檢測 使用線粒體膜電位檢測試劑盒(北京索萊寶)，根據(jù)Zhu等人的方法進行檢測。

1.6.6 精液總抗氧化能力檢測 采集第60 d和120 d的大白公豬精液，使用總抗氧化能力檢測試劑盒(A015)、丙二醛檢測試劑盒(A004)和活性氧檢測試劑盒(E004)(北京索萊寶)檢測精液的總抗氧化能力水平、丙二醛含量以及活性氧水平。

1.6.7 精漿睪酮和果糖含量的測定 采集第60 d和120 d的大白公豬精液，置于4℃的離心機(3 000 r/min)離心15 min后取精漿，用果糖試劑盒(A085，南京建成)和豬睪酮酶聯(lián)免疫分析試劑盒(m1002339，上海酶聯(lián))測定果糖和睪酮含量。

1.7 數(shù)據(jù)分析與處理

用SPSS 22.0軟件進行單因素ANOVA分析，結(jié)果以平均值±標準差表示，用GraphPad Prim6作圖，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵飼料對大白公豬血液生化指標的影響

如表2，試驗組公豬血清BUN的含量比對照組顯著降低(P<0.05)，其他指標差異都不顯著(P>0.05)。

表2 發(fā)酵飼料對大白公豬血液生化指標的影響

2.2 發(fā)酵飼料對大白公豬血液生理指標的影響

由表3可知，與對照組相比，試驗組WBC和MCV顯著提高(P<0.05)；而血液NEUT和NEUTP顯著降低(P<0.05)。

表3 發(fā)酵飼料對大白公豬血液生理指標的影響

2.3 發(fā)酵飼料對大白公豬免疫球蛋白的影響

如表4所示，與對照組相比，試驗組血清IgA和IgM有升高的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 發(fā)酵飼料對大白公豬免疫球蛋白IgA、IgM和IgG的影響

2.4 發(fā)酵飼料對大白公豬精液質(zhì)量的影響

2.4.1 精液常規(guī)指標 根據(jù)圖1可知，試驗組和對照組公豬的射精量無明顯變化(P>0.05)。在表5中，試驗組公豬精子密度、活率比對照組極顯著提高(P<0.01)。

圖1 發(fā)酵飼料對豬射精量影響

表5 發(fā)酵飼料對大白公豬精液質(zhì)量的影響

2.4.2 精子頂體完整性 圖2(a)中頂體完整精子顯示綠色熒光。圖2(b)中，在第60 d，試驗組精子頂體完整率比對照組顯著提高(P<0.05)。

圖2 FITC-PNA和DAPI聯(lián)合染色(a)以及發(fā)酵飼料對豬精子頂體完整性的影響(b)

2.4.3 精子質(zhì)膜完整性 圖3(a)中質(zhì)膜完整的精子顯示綠色熒光。圖3(b)中，試驗組精子質(zhì)膜完整率比對照組顯著提高(P<0.05)。

圖3 SYBR和PI聯(lián)合染色(a)以及發(fā)酵飼料對豬精子質(zhì)膜完整性的影響(b)

2.4.4 精子線粒體膜電位 圖4(a)中紅色熒光為膜電位正常的精子。圖4(b)中，試驗組精子線粒體膜電位活性比對照組顯著提高(P<0.05)。

圖4 熒光探針JC-1檢測(a)以及發(fā)酵飼料對豬精子線粒體膜電位的影響(b)

2.4.5 精漿睪酮和果糖濃度 如圖5所示，在試驗的第120 d，試驗組中豬精漿果糖含量比對照組極顯著提高(P<0.01)，而睪酮含量無明顯變化(P>0.05)。

圖5 發(fā)酵飼料對豬精漿中睪酮(a)和果糖(b)水平的影響

2.4.6 精液抗氧化狀態(tài) 如圖6所示，試驗組和對照組T-AOC水平無顯著差異(P>0.05)。在第120 d，試驗組中的MDA和SOD含量比對照組極顯著降低(P<0.01)。

圖6 發(fā)酵飼料對精液T-AOC(a)、ROS(b)和MDA(c)的影響

3 討論

血液生化指標的測定廣泛應用于人和動物，既可以反映機體的營養(yǎng)代謝和健康狀況，又能反映其品種特性。在本研究中，與對照組相比，試驗組公豬血清尿素氮水平極顯著降低，白細胞數(shù)和平均血細胞體積顯著升高，血液中間細胞絕對值和中間細胞百分比顯著降低。免疫系統(tǒng)的功能為抵抗入侵的外物，絕大多數(shù)疾病與動物免疫系統(tǒng)失調(diào)有關(guān)，提高免疫功能是克服疾病最有效的措施。有研究發(fā)現(xiàn)，利用發(fā)酵豆粕飼料飼喂仔豬，可以顯著提高仔豬血清中IgG、IgM和IgA水平。此外，復合益生菌發(fā)酵飼料還可以豐富腸道菌群的物種豐度，提高抗病菌的相對豐度，提高與抗病和抗真菌相關(guān)代謝產(chǎn)物的相對含量，具有潛在的益生功能。本試驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，試驗組公豬血清IgM和IgA含量雖有升高，但差異不明顯，血清IgG的水平與對照組相比差異也不顯著。表明復合益生菌發(fā)酵飼料能夠降低公豬疾病發(fā)生率，提高抗應激水平，改善公豬免疫功能。

公豬精液量與母豬受孕率和窩產(chǎn)子數(shù)緊密相關(guān)，其重要性不言而喻。但本試驗記錄了12頭大白種公豬從6月到12月的射精量，發(fā)現(xiàn)公豬射精量并沒有明顯變化。精子密度和活力是評價精液質(zhì)量、母豬受胎率和公豬繁殖力的重要指標。本試驗中，飼喂益生菌發(fā)酵飼料后公豬精子的密度和活力都極顯著提高。從以上結(jié)果可以看出，飼喂復合益生菌發(fā)酵飼料有助于改善公豬精子的密度和活力。

頂體完整性和質(zhì)膜完整性比精子活力更能體現(xiàn)精液的質(zhì)量。精子頂體是位于精子頭的一種溶酶體，對精子和卵子的結(jié)合發(fā)揮著重要作用，因此頂體完整率常作為評估雄性生育力的重要指標之一，可以用來衡量精子質(zhì)量。質(zhì)膜作為保護精子的屏障，與精子獲能和精卵結(jié)合密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在第60 d時，試驗組中精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率均有明顯提高。線粒體作為細胞動力室，在細胞生理學中發(fā)揮著不可或缺的作用。精子的活力越高其代謝越旺盛，而精子代謝能力又與線粒體功能緊密相連，因此，線粒體功能是精子活力和受精能力直接體現(xiàn)。本試驗證實，大白公豬飼喂復合益生菌發(fā)酵飼料可以改善線粒體功能，提高質(zhì)膜和頂體完整性，促進細胞的代謝，從而提高精子活力。

公豬精漿中的蛋白質(zhì)和果糖是精子運動、代謝的重要能量來源，當果糖含量減少時，精子的運動能力也隨之降低，進而影響受精率。然而果糖對于精液的影響存在著不同的看法。歐陽帆的研究證實，精漿果糖的濃度升高，精子運動能力也會提高。而郭群等人認為，果糖濃度與精子運動能力呈負相關(guān)。在本試驗中，與對照組相比，試驗組公豬第120 d的精漿果糖含量顯著提高，而果糖又為精子運動提供能量，且對精子具有一定的保護作用。所以飼喂益生菌發(fā)酵飼料有助于改善精液品質(zhì)。

氧化損傷是導致公豬精液質(zhì)量下降的主要因素之一，當機體的活性氧水平突破了其原有的抗氧化防御系統(tǒng)，則會導致細胞損傷甚至死亡，進而產(chǎn)生氧化應激。公豬精液中含有的多不飽和脂肪酸的濃度高，抗氧化性差，對氧化應激引起的損傷特別敏感?？偪寡趸芰捅┖颗c豬精液的抗氧化能力緊密相關(guān)?？偪寡趸芰υ綇?，公豬精子細胞越容易保存，同時也與繁殖結(jié)果和產(chǎn)仔數(shù)量呈正相關(guān)。丙二醛不僅會影響核酸的代謝功能，還會影響免疫損傷機制。因此可以用丙二醛的水平來反應脂質(zhì)過氧化的程度。試驗測定精子的總抗氧化能力、丙二醛含量和活性氧水平發(fā)現(xiàn)，試驗期間大白公豬精液總抗氧化能力無明顯變化，試驗期第120 d，試驗組中丙二醛和活性氧含量與對照組相比均顯著降低。表明復合益生菌發(fā)酵飼料可以降低精液中丙二醛和活性氧的產(chǎn)生，降低脂質(zhì)過氧化物損傷，進而改善公豬精液品質(zhì)。

4 結(jié)論

飼喂復合益生菌發(fā)酵飼料可改善大白公豬的免疫功能，并且顯著提高精子密度、活率、質(zhì)膜和頂體完整性以及精漿果糖含量，降低豬精液的氧化損傷，進而提高公豬精液品質(zhì)。