口蹄疫液相阻斷ELISA試驗三種加樣方式的效果比對

李世鳳,吳得瑞

(民樂縣畜牧獸醫(yī)工作站，甘肅 民樂 734500)

1 試驗背景

隨著“三聚氰胺毒奶粉 ”“瘦肉精羊肉” 等食品安全事件的曝光，人們對入口的食物是否安全越來越重視。糧食果蔬、肉蛋奶等農產(chǎn)品的安全性引起國家多部門的關注，于是農產(chǎn)品在入市前進行必要的實驗室檢測就成了保障食品安全的有力措施。

為保證畜產(chǎn)品的質量安全，2018年開始張掖市畜牧獸醫(yī)局要求全市的家畜必須在實驗室檢測合格的情況下才能出欄。牛羊須做口蹄疫抗體檢測、布魯氏菌病及小反芻獸疫檢測；豬做非洲豬瘟、口蹄疫抗體檢測；禽類做H7及H5亞型抗體檢測。民樂縣是甘肅省牛羊產(chǎn)業(yè)大縣之一，每年僅育肥牦牛出欄在10萬頭以上。據(jù)統(tǒng)計，民樂縣牦牛育肥的純利潤每頭300～500元不等，隨著飼料等因素價格上漲導致利潤空間進一步縮小，2021年每頭利潤壓縮在300元以內，而我縣目前牛出欄調運前的檢測費用在50元/頭左右，羊還要進行小反芻獸疫檢測，因此農戶養(yǎng)殖經(jīng)濟效益進一步縮減。

口蹄疫液相阻斷ELISA試驗是口蹄疫抗體檢測的國家標準方法(GB/T18935-2018)之一，因其實驗靈敏度高、操作簡單易行，已經(jīng)是基層獸醫(yī)實驗室口蹄疫抗體檢測的最主要手段。根據(jù)上級業(yè)務主管部門的要求，民樂縣農業(yè)農村局要求牛羊出欄按照15%比例進行的口蹄疫抗體合格率檢查，群體合格率在70%以上判定抗體合格。采用的是蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)的的改進型液相阻斷ELISA診斷試劑盒，每年僅?？谔阋逴型、A型抗體檢測耗費試劑盒600個，按照市場價1600元/盒計算，據(jù)估算我縣僅牛羊口蹄疫抗體檢測每年耗資在300萬以上,檢測費用占據(jù)了凈產(chǎn)值的十分之一。

2 口蹄疫液相阻斷ELISA試驗檢測過程

2.1 試驗步驟

根據(jù)試劑盒說明書，試驗步驟簡述如下：

2.1.1 抗原抗體反應 按照說明書加樣并對倍稀釋；

2.1.2 加病毒抗原 將稀釋后的病毒抗原每孔50μL加樣(空白對照2孔不加)。

2.1.3 加口蹄疫O型酶標抗體 每孔加口蹄疫酶標抗體50μL；

2.1.4 終止反應 每孔加底物50μL，停止反應；

2.1.5 結果分析 在酶標儀上讀OD450nm。

2.2 結果判定

1:128及以上抗體合格，1:128以下抗體不合格。

試劑盒說明書加樣方式有以下兩種，分別如下圖 。

按照圖1的加樣方式，每板加10份樣品，每盒可檢測50份樣品，樣品檢測均價32元。按照圖2的加樣方式，每板加20份樣品，每盒可檢測100份樣品，樣品檢測均價16元。再加上采樣所需要的一次性耗材，每頭牛的檢測費用在40～70元不等。

1 23 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 1:8S2S3S4S5S6S7S8S9S10+ 1:32- 1:4B 1:161:641:8C 1:321:128D 1:641:256E 1:1281:512F 1:2561:1024病毒抗原對照G 1:5121:2048H 1:10241:4096

1 23 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 1:16S2S3S4S5S6S7S8S9S10+ 1:32- 1:4B 1:321:641:8C 1:641:128D 1:1281:256E 1:16S12S13S14S15S16S17S18S19S201:512F 1:321:1024G 1:641:2048病毒抗原對照H 1:1281:4096

3 比對結果分析

通過分析液相阻斷ELISA試驗得出結論。試驗是通過檢測樣品在1:128稀釋倍數(shù)時，通過酶標儀檢測波長在450 nm的OD值來判斷是否有抗體。而其他孔OD450nm的數(shù)值參考意義不大。筆者在一次性96孔板上進行加樣稀釋，只移1∶64時的稀釋液至兔抗包被ELISA板，這樣每個兔抗包被ELISA板可檢測樣品80份，其他試驗過程不變。為了驗證這個想法是否具有可行性，筆者及其同事做了以下試驗。

取新鮮牛血清80份，采購同一廠家同一批號診斷試劑盒，對同一份樣品兩人分別采用圖1、圖2、圖3的加樣方式，則同一份樣品可產(chǎn)生6個OD450nm值，80份樣品可產(chǎn)生480個OD450nm值。通過逐一分析，80份樣品中僅有2份樣品的OD450nm值有誤差，并且誤差在±1滴度以內，整體符合率在97.5%以上。

1 23 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 1:128S2S3S4S5S6S7S8S9S10+ 1:32- 1:4B S11S12S13S14S15S16S17S18S19S201:641:8C S21S22S23S24S25S26S27S28S29S301:128D S31S32S33S34S35S36S37S38S39S401:256E S41S42S43S44S45S46S47S48S49S501:512F S51S52S53S54S55S56S57S58S59S601:1024G S61S62S63S64S65S66S67S68S69S701:2048病毒抗原對照H S71S72S73S74S75S76S77S78S79S801:4096

4 比對試驗結果

筆者認為在實際工作中可以用第三種加樣方式替代前2種加樣方式，作為基層獸醫(yī)實驗室判定口蹄疫免疫抗體群體合格性的依據(jù)，使每份樣品的檢測費用從32元降至4元，經(jīng)濟效益非常顯著，值得推廣應用。