阿旺綿羊種公羊精液冷凍保存技術(shù)的研究

李建強(qiáng)，楊志勇，林耀民，趙 赫，王幸栓，虞 蓮，雷安民

(1.天津津墾牧業(yè)集團(tuán)有限公司，天津300380；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)；3.天津農(nóng)墾龍呈嘉益國(guó)際貿(mào)易有限公司；4.天津天食牛種業(yè)有限公司)

阿旺綿羊是西藏具有代表性的藏系綿羊(周雨等，2018)，全身各部結(jié)合勻稱(chēng)，體軀呈長(zhǎng)方形，在“三江”型綿羊中體格最大，生產(chǎn)性能最好(宋天增等，2016)，具有適應(yīng)在海拔高、氣溫低、晝夜溫差大、牧草生長(zhǎng)期較短、氧氣壓低等環(huán)境地區(qū)生存的特點(diǎn)，是青藏高原高寒牧區(qū)或半農(nóng)半牧區(qū)放牧或舍飼飼養(yǎng)的優(yōu)良肉用綿羊品種類(lèi)群(扎西等，2016)，是西藏寶貴的優(yōu)良遺傳資源(德慶卓嘎，2015)。阿旺綿羊主要分布于西藏昌都地區(qū)貢覺(jué)縣境內(nèi)的阿旺鄉(xiāng)、拉妥鄉(xiāng)、莫洛鄉(xiāng)等12個(gè)鄉(xiāng)(鎮(zhèn))及周邊的芒康縣、江達(dá)縣、察雅縣等地，是千百年來(lái)牧民在自然放牧條件下，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的閉鎖繁育和民間自然選育而形成的一個(gè)優(yōu)良綿羊類(lèi)群(洛桑催成等，2018)。阿旺綿羊的飼養(yǎng)管理主要是采取全年放牧方式進(jìn)行飼養(yǎng)(扎西等，2011)，且屬于季節(jié)性繁殖動(dòng)物(德慶卓嘎，2015)，以自然本交為主。但近年來(lái)，隨著西藏農(nóng)牧民生活水平的提高和飲食習(xí)慣的影響，阿旺綿羊雜交情況嚴(yán)重，數(shù)量急劇減少。而精液冷凍可大大提高種公畜的利用率，減少公畜的飼養(yǎng)量，節(jié)約成本且不再受地域、時(shí)間的限制。不僅有利于家畜品種改良，也是家畜育種和珍惜瀕危物種保護(hù)的有效技術(shù)手段。本試驗(yàn)研究，通過(guò)調(diào)教純種阿旺綿羊種公羊進(jìn)行人工采集精液，制成冷凍精液，探索優(yōu)質(zhì)阿旺綿羊種公羊遺傳資源的保護(hù)，提高其利用率，并為阿旺綿羊快速擴(kuò)繁奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及地點(diǎn)

1.1.1 動(dòng)物選擇 從位于4 200 m海拔的西藏昌都市畜牧總站覺(jué)擁種畜場(chǎng)選取符合阿旺綿羊品種特征的2～4周歲優(yōu)質(zhì)種公羊個(gè)體70只，身體健康，經(jīng)檢疫無(wú)傳染性疾病。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)地點(diǎn) 西藏昌都，昌都津墾牧業(yè)科技有限公司(海拔3 200 m)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備 干熱滅菌器(GRX-9123A，中器)；超凈工作臺(tái)(BBS-SDC，博科)；超凈水制作儀(CR-20N，杲森)；高壓滅菌鍋(SX-500，TOMY)；數(shù)顯水浴鍋(DK-S24，中器)；鏡檢加熱器(Sipert-jj0201，世博)；2～8 ℃醫(yī)用冰箱(YC-1006，澳柯瑪；精液采集器(康力)；相差顯微鏡(BX43，奧林巴斯)；分析天平(Q65，賽多利斯)；自增壓液氮罐(230MP，CHART)；密度儀(羊)(Accucell，卡蘇)；超低溫程序降溫儀(007263 Min-Digitcool，卡蘇)；低溫操作柜、全自動(dòng)單頭精液細(xì)管灌裝機(jī)(022989 MRS1，卡蘇)；日糧制備機(jī)(ST70，北京國(guó)科誠(chéng)泰農(nóng)牧設(shè)備有限公司)等。

1.2.2 主要試劑 稀釋液(optixcell)(卡蘇)。

1.3 種公羊的調(diào)教

1.3.1 飼養(yǎng)管理按照種公羊營(yíng)養(yǎng)需要，以顆粒精料、燕麥草為主要原料，通過(guò)日糧制備機(jī)制成全混合日糧，撒料車(chē)送料，2次/d。羊欄內(nèi)懸掛礦物質(zhì)舔磚，隨意舔食。自來(lái)水，自由飲水。下午放牧運(yùn)動(dòng)2 h。

1.3.2 種公羊調(diào)教 (1)調(diào)教前適應(yīng)工作：阿旺綿羊以放牧為主，膽小易驚，怕人。所以，對(duì)阿旺綿羊進(jìn)行調(diào)教，首先是增加人羊的接觸，降低其恐懼感。通過(guò)人工飼喂草料、人與羊主動(dòng)接觸等，減少羊與人之間的陌生感和恐懼感，增強(qiáng)其與人近距離接觸的適應(yīng)性。(2)臺(tái)羊的選擇：選擇身體健壯、個(gè)體適中、性情溫順的阿旺綿羊母羊?yàn)榕_(tái)羊，頸部固定到臺(tái)羊架上，左右有欄桿限制臺(tái)羊活動(dòng)。發(fā)情母羊效果更好。(3)采精器械準(zhǔn)備：在調(diào)教的前一天，用75%的酒精棉消毒假陰道內(nèi)胎，注入適量水后，放入干熱滅菌器(45℃)。調(diào)教當(dāng)天，采精人員身穿工作服，佩戴口罩和一次性采精手套，將假陰道從干熱滅菌器中拿出，并用滅菌玻璃棒在其上端2/3處涂抹適量潤(rùn)滑油，吹起加壓使其內(nèi)胎外口呈三角形狀，安裝集精杯后，手持假陰道安靜等待。(4)采精調(diào)教：選擇2～3只不相互攻擊的種公羊，將其驅(qū)趕至采精區(qū)域后，離開(kāi)，并間歇性進(jìn)入以保證待調(diào)教公羊位于臺(tái)羊附近。待調(diào)教公羊爬跨臺(tái)羊且穩(wěn)定時(shí)，采精人員迅速將公羊陰莖導(dǎo)向精液采集器上口處，待公羊完成射精動(dòng)作后，隨公羊陰莖而下，移除精液采集器。將假陰道放平并旋松閥門(mén)放氣，擰緊并將豎直、輕拍，以使精液全部流入集精杯，再將集精杯通過(guò)窗口遞到精液處理室做進(jìn)一步原精質(zhì)量檢查和記錄。

1.4 冷凍精液制作

1.4.1 技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)參照 《羊冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》(NY/T 3186-2018)進(jìn)行阿旺綿羊精液采集、檢驗(yàn)及冷凍精液制作。

1.4.2 采精前的準(zhǔn)備 (1)采精前一天，假陰道的處理同調(diào)教，其他準(zhǔn)備主要包括：①分裝精液所需的灌裝軟管、精液漏斗經(jīng)75%酒精浸泡消毒處理后烘干放置到超凈工作臺(tái)中；②長(zhǎng)灌裝針頭、錐形瓶、集精管、量筒等經(jīng)高溫消毒后備用；③集精杯、移液槍吸頭經(jīng)超凈工作臺(tái)紫外線照射消毒；④計(jì)算第二天稀釋液的用量需求，用錐形瓶接取超純水，用牛皮紙封口后放入高壓滅菌鍋中滅菌(121 ℃，30 min)。(2)采精當(dāng)天，在采精之前，需要做如下準(zhǔn)備：①密度儀、數(shù)顯水浴鍋(34 ℃)、鏡檢加熱器(上面有潔凈的載玻片、蓋玻片，37 ℃)、低溫操作柜(4 ℃)等通電、開(kāi)機(jī)；②密度儀預(yù)熱后，將盛有3.99 mL生理鹽水的比色皿放入其中進(jìn)行空白對(duì)照測(cè)定；③將集精管安裝到集精杯中，經(jīng)分析天平稱(chēng)量重量(初重)后，放置在已備好精液采集器的干熱滅菌器內(nèi)；④稀釋精液所需的錐形瓶放置到盛有34 ℃水的500 mL塑料燒杯內(nèi)，將燒杯放到水浴鍋中水浴加熱；⑤細(xì)管(0.25 mL)裝入燒杯后紫外線消毒；⑥稀釋液的準(zhǔn)備：按照需求，依據(jù)說(shuō)明書(shū)將稀釋液(optixcell)用滅菌超純水稀釋后，將其放置到水浴鍋中水浴加熱備用；⑦臺(tái)羊固定，并將調(diào)教好的種公羊和待調(diào)教的公羊驅(qū)趕至待采欄。

1.4.3 人工精液采集 (1)采精步驟：與調(diào)教時(shí)相似，不同之處在于，對(duì)于膽子較大的種公羊空爬兩次后，再采集精液；而膽子較小的種公羊爬跨就采精，否則很有可能當(dāng)日不再爬跨。并對(duì)待調(diào)教的公羊繼續(xù)調(diào)教。(2)采精頻率：一般每只羊每周采精兩次。如果羊只采精的精液量顯著少于其正常精液量范圍，可以間隔30 min以上，再采精一次。

1.4.4 原精品質(zhì)檢測(cè)、稀釋及記錄 :(1)射精量(精液體積，mL)計(jì)算：將人工精液采集完成后的集精杯放到分析天平內(nèi)稱(chēng)重(總重)，精液體積(mL)=(總重-初重)/1.03(精液比重)。(2)密度檢測(cè)：用移液器在稱(chēng)重后集精杯中取精液(原精)10 μL，并用面巾紙擦去吸頭外沾到的精液，然后在比色皿的生理鹽水中反復(fù)吹打并將原精注入其中，將集精杯放置到鏡檢加熱器上，再按照密度儀操作步驟檢測(cè)得出阿旺綿羊精液的密度(億/mL)、分裝支數(shù)(支)和加液量(mL)。(3)稀釋及原精活力檢測(cè)：待計(jì)算出加液量后，量取稀釋液后，反復(fù)2～3次涮洗集精管，并倒入已準(zhǔn)備好的錐形瓶中進(jìn)行稀釋?zhuān)p輕晃動(dòng)搖勻，取6 μL原精放到顯微鏡的載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下評(píng)判原精活力?；蛘呤窍蚣脑邢燃尤?～10 mL稀釋液并倒入錐形瓶，判斷活力≥65%之后，再按照加液量進(jìn)行加液。之后，將稀釋完畢的精液(錐形瓶，燒杯中)放到低溫操作柜內(nèi)平衡3～4 h。(4)信息記錄：在檢測(cè)過(guò)程中，應(yīng)及時(shí)記錄羊只的耳號(hào)、體積、密度、分裝支數(shù)、加液量、原精活力等。

1.4.5 精液分裝和冷凍 (1)信息打?。喊凑彰恐还虻姆盅b支數(shù)使用多米諾噴墨打印機(jī)打印所需0.25 mL細(xì)管(打印信息包括：地區(qū)、公司、耳號(hào)、生產(chǎn)日期)，每只公羊的細(xì)管放入不同盒內(nèi)。(2)分裝：將打印信息后的細(xì)管碼裝到冷凍架上，碼放時(shí)應(yīng)注意細(xì)管擺放方向，把棉塞封口端靠近操作者，超聲波封口端遠(yuǎn)離操作者。然后將平衡后的精液輕輕晃動(dòng)混勻后倒入精液漏斗內(nèi)，同時(shí)將長(zhǎng)灌裝針頭、罐裝軟管和細(xì)管進(jìn)行組裝，再將細(xì)管放置到精液漏斗里并直達(dá)底部，然后通過(guò)全自動(dòng)單頭精液細(xì)管灌裝機(jī)分裝精液，并記錄每只公羊細(xì)管精液的冷凍架數(shù)字。如此反復(fù)循環(huán)，將所有羊只精液進(jìn)行分裝。(3)冷凍：將冷凍柜的所有冷凍架放置到冷凍柜內(nèi)，有細(xì)管的冷凍架放在上面，無(wú)細(xì)管的冷凍架放在下面。然后按照超低溫程序降溫儀的程序，完成精液冷凍。(4)暫存：冷凍完成后，打開(kāi)冷凍柜蓋子，冷凍精液(凍精)細(xì)管的超聲波封口端在上，棉塞封口端在下，不得倒置，以免細(xì)管棉塞端的暴脫，按公羊號(hào)投入盛滿(mǎn)液氮的不同提筒中，并迅速浸泡在液氮罐中暫存。

1.4.6 凍后活力檢測(cè)及貯存 (1)凍后活力檢測(cè)：預(yù)先把水浴箱水溫、鏡檢加熱器加熱至 37 ℃，將裝有試管的試管架放置其中，并標(biāo)記上需要質(zhì)檢的羊只耳號(hào)。然后用鑷子取每個(gè)日期每只羊的一支冷凍細(xì)管精液迅速浸泡于水中并迅速晃動(dòng)3～4下，然后取出，用紗布擦干水珠 ，然后剪去超聲波封口端，用推針推動(dòng)棉塞端將細(xì)管內(nèi)的精液全部置于小試管內(nèi)，混均勻后，取6 μL精液置于載玻片上，加蓋玻片進(jìn)行活力檢測(cè)和評(píng)定。 (2)分裝貯存：將質(zhì)檢合格的冷凍精液分裝到拇指管中，再裝入紗布袋中，并在紗布袋的標(biāo)簽上標(biāo)注羊只耳號(hào)、生產(chǎn)單位、冷凍精液支數(shù)和冷凍制作日期。然后將其浸泡到液氮罐的液氮中貯存。并且，根據(jù)液氮揮發(fā)情況，專(zhuān)人負(fù)責(zé)加添液氮，每周1～2次，以保證冷凍精液始終浸入液氮內(nèi)。同時(shí)注意庫(kù)房通風(fēng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

阿旺綿羊采精調(diào)教結(jié)果。通過(guò)反復(fù)多次調(diào)教訓(xùn)練，21只阿旺綿羊種公羊能夠進(jìn)行人工精液采集。

阿旺綿羊原精和凍精質(zhì)量(樣本數(shù)116個(gè)，1個(gè)月)總體情況見(jiàn)下表。

表1 阿旺綿羊原精和凍精質(zhì)量情況(樣本數(shù)116個(gè))

從表1中我們可以看出，阿旺綿羊原精和凍精的總體質(zhì)量情況顯著高于《羊冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》。

(3)不同阿旺綿羊個(gè)體間原精和凍精質(zhì)量(14只)的比較。

從表2中我們可以看出，在14只人工采集精液的阿旺綿羊原精和凍精質(zhì)量情況中，在體積方面，羊1與羊12，羊4、羊6、羊14與羊11，羊7、羊9、羊10與羊11、羊13，羊12與羊13，均差異顯著。在密度方面，羊1、羊2、羊4與羊8、羊10、羊12、羊14，羊3、羊11、羊13與羊7、羊8、羊12，羊5、羊9與羊6、羊7、羊8、羊12，羊6與羊8、羊9、羊10、羊12、羊14，羊7與羊8、羊9、羊10、羊11、羊12、羊13、羊14，羊8、羊12與羊9、羊11、羊13、羊14，羊12與羊14，均差異極顯著。原精活力中，羊7與羊13差異顯著。而凍后活力差異不顯著。

表2 阿旺綿羊個(gè)體原精和凍精質(zhì)量情況(14只)

3 討論

國(guó)外對(duì)于綿羊精液冷凍保存技術(shù)研究始于20世紀(jì)50年代，我國(guó)綿羊冷凍精液技術(shù)研究始于1974年(金森等，2008；金美林等，2017)，而阿旺綿羊至今未見(jiàn)有進(jìn)行冷凍精液制作研究的報(bào)道。通過(guò)此次研究，發(fā)現(xiàn)阿旺綿羊野性很強(qiáng)，不易與人接近，采精調(diào)教尤為困難，與池勝剛等(2013)的研究結(jié)果相似，這與其終年放牧的飼養(yǎng)方式有直接關(guān)系。通過(guò)采精操作者與公羊多接觸、臺(tái)羊性吸引、能采公羊相伴訓(xùn)練等辦法，最終能夠成功訓(xùn)練阿旺綿羊完成人工采集精液。而且，阿旺綿羊原精和凍精的品質(zhì)顯著高于《羊冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》中的相關(guān)要求，這說(shuō)明能夠常規(guī)開(kāi)展西藏阿旺綿羊冷凍精液的生產(chǎn)，為阿旺綿羊種質(zhì)資源保護(hù)和優(yōu)秀雄性阿旺綿羊廣泛應(yīng)用提供了技術(shù)基礎(chǔ)。在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，阿旺綿羊的原精活力非常好，訓(xùn)練采集至今尚未發(fā)現(xiàn)因原精活力而廢棄的精液，個(gè)別羊只精液凍后活力偶爾因?yàn)榛盍Φ陀跇?biāo)準(zhǔn)而廢棄。另外，在阿旺綿羊原精質(zhì)量檢測(cè)中，阿旺綿羊個(gè)體射精量之間存在不同程度的差異性，而精液密度差異極顯著。這表明，阿旺綿羊個(gè)體之間原精品質(zhì)在每次射精量與精子密度方面具有顯著差別,而在原精活力和解凍后活力則無(wú)顯著的差異。但在解凍后并進(jìn)行配種后的受孕方面還為進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，這將是冷凍精液后續(xù)應(yīng)用中另外的問(wèn)題。

4 結(jié)論

依照《羊冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》可以制作阿旺綿羊冷凍精液，一般情況下，阿旺綿羊的種公羊一次性射精量可以達(dá)到4.2 mL，精子密度一般在46億/mL左右,原精活力一般都在80%以上。依照上述凍精的生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程，一只優(yōu)質(zhì)的種用公羊，在每周2次有效采精的情況下，每年可以生產(chǎn)凍精1萬(wàn)支以上。