羊支原體山羊肺炎亞種在兩種培養(yǎng)基上的生長特性比較

張潔慧

(甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 武威 733006)

自1976年證明 Mccp 是 CCPP 病原以來，Mccp 菌體滅活苗在世界多個國家和地區(qū)研制成功并投入使用。但Mccp培養(yǎng)營養(yǎng)要求高，培養(yǎng)除基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)外，還需要一定量動物血清提供支原體生長代謝過程中所必需的膽固醇物質(zhì)。培養(yǎng)適宜溫度37 ℃，pH 7.2～7.6，生長較為緩慢。PPLO瓊脂固體培養(yǎng)基上3～4 d可形成典型的直徑為10～16 μm 圓形“煎蛋樣”菌落，核心部分較厚，向下長入培養(yǎng)基，周圍形成一層較薄的透明顆粒區(qū)。實驗室常用改良Thiaucourt’s肉湯培養(yǎng)基(MTB)成本高、生長滴度不高等缺陷。為篩選出適合于Mccp制苗用的液體培養(yǎng)基，本試驗測定繪制了Mccp F38株在不同基礎(chǔ)配方的液體支原體培養(yǎng)基中的生長曲線，為下一步Mccp滅活疫苗培養(yǎng)基的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗器材 超凈工作臺、隔水式恒溫培養(yǎng)箱、CO2培養(yǎng)箱、光學(xué)顯微鏡、pH計、pH試紙、15 mL離心管、振蕩器、 BIORAD酶標(biāo)儀。

1.1.2 試驗藥品 PPLO Broth、PPLO Agar、丙酮酸鈉、民海滅活馬血清、Hyclone滅活馬血清、青霉素、葡萄糖、酵母浸出液、醋酸鉈等。

1.2 菌株和培養(yǎng)基

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國家重點實驗室保存和提供山羊支原體山羊肺炎亞種F38株。

改良Thiaucourt’s肉湯培養(yǎng)基(MTB)：25% 酵母浸出液(100 mL/L)、PPLO Broth(21 g/L)、丙酮酸鈉(2 g/L)、葡萄糖(2 g/L)、1% 酚紅(2.5 mL/L)、滅活民海馬血清(200mL/L)、青霉素(10萬IU/L)，使用1 mol/L NaOH將培養(yǎng)基pH調(diào)至7.2～7.6。

改良Thiaucourt’s瓊脂培養(yǎng)基(MTA)：25% 酵母浸出液(100 mL/L)、PPLO Agar(35 g/L)、丙酮酸鈉(2 g/L)、葡萄糖(2 g/L)、1% 酚紅(2.5 mL/L)、滅活Hyclone馬血清(200 mL/L)、10% 醋酸鉈(1mL/L)、青霉素(10萬IU/L)，用1 mol/L NaOH將pH調(diào)至7.2～7.6。

5%馬血清改良培養(yǎng)基(HF3)部分成分：PPLO Broth，滅活海馬血清(50 mL/L)等藥品，采用1 mol/L NaOH將pH調(diào)至7.2～7.6。

1.3 方法

1.3.1 菌液的培養(yǎng) 將甘油與菌液按1:1比例在 -40℃凍存的F38株與培養(yǎng)基以1:9的比例無菌操作接種于4.5 mL上述兩種不同的液體培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)箱復(fù)蘇。24～48 h后待培養(yǎng)基變黃后，分別連續(xù)傳代2～3次，待其生長穩(wěn)定之后，將菌液與培養(yǎng)基按照相同比例再傳代培養(yǎng)，作為待測菌液， 37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

1.3.2 顏色變化和CCU的測定 從0 h起MTB培養(yǎng)基的菌液每隔6 h取一支樣，HF3培養(yǎng)基的菌液每隔12 h取一支樣，分別進(jìn)行活菌計數(shù)。具體方法如下：將兩種培養(yǎng)基以4.5mL/管分裝至15 mL的離心管中，取各自對應(yīng)的待測菌液0.5 mL分別加入對應(yīng)的1號管中，充分震蕩混合后，從1號管中吸取出0.5 mL菌液加入2號離心管中充分震蕩混勻，再從2號管中吸取0.5mL菌液加入到3號離心管震蕩混勻，以此類推，倍比稀釋到第11號離心管，將第11管震蕩混勻后吸取0.5mL菌液棄去，并取一支對應(yīng)液體培養(yǎng)基為陰性對照，放置37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。每個時間點設(shè)置兩組平行。每隔24 h查看記錄一次培養(yǎng)基顏色變化狀況，直到不再發(fā)生變化為止，最后一個變黃離心管就是待測菌液的生長滴度，使用顏色變化單位(color change units,CCU)表示，同時測定變黃后菌液pH值。計算出兩組平行試驗的平均滴度，然后以取樣時間點為橫坐標(biāo)，生長滴度對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.3.3 菌落形態(tài)和CFU的測定 取不同時間點的待測菌液，按照1.3.2的方法梯度稀釋為10-1，10-2，10-3……10-11，然后選擇兩個合適的滴度，吸取100 μL稀釋菌液以涂布的方法接種于MTA培養(yǎng)基平皿，先將平皿倒置于濕盒內(nèi)，放進(jìn)含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。每個滴度設(shè)置3組平行組，3～5d后進(jìn)行計數(shù)，在顯微鏡下觀察菌落的形態(tài)。然后以取樣時間為橫坐標(biāo)，CFU對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.3.4 蛋白濃度的測定 取每個時間點菌液1 mL于EP管內(nèi)，-20 ℃凍存。待所有CCU、CFU測定完成后，取出菌液12 000 rpm/min離心10 min，將上清液棄去，吸取適量0.1 mol/L PBS(pH 7.2)吹打沉淀使其懸浮混勻，12 000 rpm/min 離心10 min后以同樣方法洗滌一次，離心后棄去上清液，用200 μL相同的PBS懸浮沉淀，最后使用BCA蛋白定量分析試劑盒(購自賽默飛世而科技公司)測定相應(yīng)時間點蛋白濃度。以取樣的時間點為橫坐標(biāo)，菌液蛋白的濃度為縱坐標(biāo)，繪制出蛋白濃度曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 顏色及pH變化

使用1 mol/L的NaOH將兩種液體培養(yǎng)基得pH調(diào)至7.2～7.6，發(fā)現(xiàn)HF3的顏色要比MTB的偏黃一些(圖1A)，待兩種培養(yǎng)基上的菌液在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d，顏色不再變化時，比較發(fā)現(xiàn)MTB培養(yǎng)基顏色變化更為明顯(圖1B)。而再次測定變黃后的菌液pH(表1)，MTB培養(yǎng)基菌液的為5.83左右，HF3培養(yǎng)基菌液的為6.82左右，與顏色變化情況相符。所以僅從顏色和pH變化角度分析，MTB培養(yǎng)基的pH值變化區(qū)間大，更容易觀察計數(shù)，表明Mccp在MTB培養(yǎng)基中發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸更多。

表1 培養(yǎng)基變黃后pH測定結(jié)果

圖1 液體培養(yǎng)基顏色變化情況

2.2 CCU的測定結(jié)果

根據(jù)測得的F38在兩種培養(yǎng)基上的生長滴度變化繪制了生長曲線，結(jié)果如圖2?？芍狹ccp F38株在MTB培養(yǎng)基中最高生長滴度可達(dá)到109CCU/mL，6～24 h內(nèi)滴度可維持在109CCU/mL數(shù)量級；在HF3培養(yǎng)基中最高滴度可達(dá)1010CCU/mL，可從12 h維持到84 h，平臺期持續(xù)時間比MTB培養(yǎng)基更長。

圖2 Mccp F38株在MTB和HF3上的CCU計數(shù)結(jié)果

2.3 菌落形態(tài)觀察結(jié)果

涂布在PPLO瓊脂平皿上的菌液在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，生長72～96 h后均可形成針尖大小帶中心臍的菌落，顯微鏡低倍鏡下觀察菌落大小不一，直徑在10～20 μm之間。(圖3A、3C)。

圖3 Mccp F38株菌落形態(tài)

2.4 CFU的測定結(jié)果

采用不同時間點取樣測得的CFU繪制出生長曲線，結(jié)果如圖4。可知Mccp F38株在MTB和HF3兩種培養(yǎng)基上的菌液在0～30 h的CFU計數(shù)結(jié)果基本一致，維持在平臺期。而從30 h后，MTB培養(yǎng)的菌液CFU計數(shù)開始下降，最高可達(dá)7.0×108CFU/mL。HF3培養(yǎng)基的菌液CFU計數(shù)30 h后仍維持在平臺期，最高可達(dá) 2.62×109CFU/mL，72 h后CFU值開始下降，但到144h時仍然較高，達(dá)2.23×103CFU/mL，表明Mccp F38株在HF3培養(yǎng)基上生長更為良好，平臺期持續(xù)時間更長。

圖4 Mccp F38株在MTB和HF3上的CFU計數(shù)結(jié)果

2.5 蛋白濃度的測定結(jié)果

采用不同時間點取樣的處理后的菌液按照BCA蛋白定量分析試劑盒(購于賽默飛世爾科技公司)要求操作(圖5.1)：(1)將不同濃度稀釋的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和待測蛋白質(zhì)樣品各25 μL加入到96孔板中。(2)在每一個孔中加入200 μL的工作液，在振蕩器上震蕩30 s，使其充分混合。(3)將微96孔板密封，在37 ℃的溫箱中培育30 min。

(4)將微孔板冷卻至室溫。用微孔板讀數(shù)儀，測量樣品在562 nm波長或該波長附近(本試驗波長為595 nm)的吸光值。讀取的數(shù)據(jù)(圖2.5.1 B)使用CurveExpert 1.4 漢化版軟件建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2.5.1C、D)并計算每個時間點的蛋白濃度，繪制的蛋白含量變化曲線，見圖5、圖6。

圖5 蛋白含量測定過程

圖6 Mccp F38株在MTB和HF3上的蛋白含量變化曲線

Mccp F38株在MTB培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h后蛋白濃度開始增加，30 h時達(dá)到76.126 μg/mL，以后蛋白濃度維持在66.001～76.416 μg/mL之間。在HF3培養(yǎng)基中從0 h就開始增加，最高可達(dá)到71.313 μg/mL，60 h后一直維持在54.375～71.313 μg/mL之間。比較發(fā)現(xiàn)Mccp F38株在MTB培養(yǎng)基中生長時的蛋白濃度要略高于HF3培養(yǎng)基。

3 討論

由于支原體本身沒有細(xì)胞壁，所以部分抗生素不敏感，在CCPP流行早期，用四環(huán)素、氟喹諾酮(達(dá)諾沙星)及大環(huán)內(nèi)酯類在早期治療中有效。但藥物防治往往是很難做到徹底消除，治愈動物經(jīng)常是潛在的傳染源；其次長期大量使用抗生素易形成耐藥性。目前，預(yù)防 Mccp 感染的主要措施是使用滅活疫苗進(jìn)行免疫，又疫苗中抗原的含量是決定滅活疫苗免疫效力的主要因素之一，準(zhǔn)確掌握制苗菌株的生長曲線是疫苗生產(chǎn)工藝的重要環(huán)節(jié)之一，據(jù)此才能獲得最高的抗原產(chǎn)量?；罹嫈?shù)法為疫苗研制中常用的抗原定量技術(shù)。

為驗證Mccp F38株在新改良培養(yǎng)基上的生長情況，測評其效果，從而篩選出適合大批量制作滅活疫苗的培養(yǎng)基。本試驗以酚紅作為指示劑，采用Mccp在生長代謝中分解葡萄糖產(chǎn)酸，使得培養(yǎng)基顏色變黃，據(jù)此比較山羊支原體山羊肺炎亞種F38株在MTB和HF3兩種液體培養(yǎng)基上的生長情況。結(jié)果表明，F(xiàn)38株在HF3液體培養(yǎng)基中顏色變化的單位(color change units, CCU)、菌落形成的單位(Colony forming units, CFU)計數(shù)均高于MTB液體培養(yǎng)基，且對數(shù)期維持時間更長，在培養(yǎng)144 h后仍有較多活菌數(shù)，只是蛋白濃度略低于MTB液體培養(yǎng)基，由此可初步說明HF3培養(yǎng)基更有利于Mccp F38株的生長，可選用于滅活疫苗生產(chǎn)中菌體的培養(yǎng)，從而使成本更為低廉。另一方面本次試驗活菌計數(shù)(CCU、CFU)出現(xiàn)了較為一致的生長曲線，即兩種計數(shù)結(jié)果顯示Mccp F38株各個生長時間段一致，因此可初步判斷出Mccp F38株在MTB、HF3兩種培養(yǎng)基上的抗原收獲時間的大致范圍，同時也為滅活疫苗的大批量生產(chǎn)提供參考。

支原體體外培養(yǎng)時營養(yǎng)條件相對于其他細(xì)菌要求更高， 除了供給所必需的膽固醇和酵母等營養(yǎng)物質(zhì)外，還要添加一定的馬血清或小牛血清，所以培養(yǎng)基成本較為昂貴，這使得大批量制苗的成本大大提高。本實驗室常用的液體培養(yǎng)基MTB含20%馬血清，牛支原體和羊的多種支原體生長均較為良好；而改良的新培養(yǎng)基HF3僅含5%馬血清，經(jīng)過初步核算HF3培養(yǎng)基成本較MTB大大降低。

當(dāng)然，本試驗在測定生長曲線時，由于初始菌液未稀釋，0 h時接種的菌液濃度過高，所以繪制的曲線沒有明顯的遲緩期，不能明確體現(xiàn)Mccp的生長曲線特征，試驗方案仍有待改進(jìn)。另一方面，就測得的生長曲線而言，本結(jié)果僅是在試驗室階段通過小量培養(yǎng)測得的數(shù)據(jù)，可作為規(guī)模化山羊支原體山羊肺炎亞種的培養(yǎng)或發(fā)酵罐生產(chǎn)的參考依據(jù)，但擴大規(guī)模后生長情況還需進(jìn)行進(jìn)一步有關(guān)工藝條件的研究，從而獲得更準(zhǔn)確直接的數(shù)據(jù)和結(jié)論。