改良的熒光標(biāo)記菊粉清除率檢測法在糖尿病小鼠腎損傷評估中的應(yīng)用

劉 琳，姜世敏，張浩軍，李 鴻，楊 悅，卓 莉，李文歌

（1.中日友好醫(yī)院腎病科，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029）

菊粉是一種完全經(jīng)腎小球自由濾過而不被腎小管重吸收，也不被腎小管分泌的惰性物質(zhì)，是用于腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）檢測的理想物質(zhì)之一。然而由于小鼠血、尿標(biāo)本有限、收集困難，傳統(tǒng)方法菊粉清除率操作復(fù)雜，實驗條件要求高[1，2]。近年來，Zhonghua Qi 等人報道了通過檢測異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的菊粉（FITC-菊粉）熒光衰減速率反映GFR 的方法[5]，但其應(yīng)用并未得到廣泛開展，尤其國內(nèi)幾乎無人使用。本研究首先嘗試改進該方法，希望為小鼠GFR 測定提供準(zhǔn)確性高同時可行性強的方法。此外，db/db是先天性2 型糖尿病小鼠，目前尚缺少關(guān)于其GFR 變化的長期觀察研究，因此本文在建立穩(wěn)定方法后連續(xù)測定了db/db 小鼠在28 周齡內(nèi)的GFR 變化，同時評估了其蛋白尿、腎臟病理等改變，為確證db/db小鼠作為糖尿病腎病腎小球高濾過狀態(tài)研究的動物模型提供有益的嘗試。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

FITC-菊粉（瑞典TDB 公司）、HEPES 緩沖液（pH 7.4）、一次性使用微量采血吸管（江蘇康健華醫(yī)療用品有限公司）、肝素包被的1.5ml EP 管（江蘇康健華醫(yī)療用品有限公司）

1.2 實驗動物

SPF 級6 周齡雄性db/db 小鼠10 只及同窩雄性對照db/m 小鼠5 只，購買于南京模式動物研究所，實驗動物質(zhì)量合格證號：SCXK（蘇）2018-0008，飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院SPF 級動物房，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后開始實驗。血糖數(shù)據(jù)為禁食8h后檢測的空腹血糖。

1.3 小鼠清醒狀態(tài)下GFR的檢測方法

0.9%生理鹽水配制濃度為2.5%的FITC-菊粉，振蕩器充分攪拌溶解后用0.22μm 濾器過濾，于4℃冰箱避光保存。檢測前小鼠自由活動、自由飲食飲水，檢測前10min 內(nèi)將0.3ml 飲用水灌胃以避免檢驗過程中因攝入不足造成血容量減少而影響GFR。將上述配制好的FITC-菊粉以3.7μl/g體重的劑量對清醒小鼠進行內(nèi)眥靜脈叢勻速彈丸式注射，并計時為0 點。分別在注射后1、2、3、4、5、7、10、15、35、55、75min 使用一次性微量采血吸管于尾靜脈采血5μl，裝入肝素包被的EP 管避光保存。以3000r/min 離心后取上清（血漿）2μl，每個標(biāo)本使用HEPES 緩沖液（pH 7.4）稀釋至40μl（稀釋20 倍）置于96 孔板中，于熒光酶標(biāo)儀上檢測熒光強度，激發(fā)波長485nm，吸收波長583nm。同時將配制的FITC-菊粉以1：200 稀釋為40μl置于96孔板，設(shè)置3 個復(fù)孔，與血漿標(biāo)本同時檢測熒光強度后取平均值，計算1μl FITC-菊粉對應(yīng)的熒光值。每個檢測標(biāo)本最終均以40μl 體積平鋪于96孔板中進行檢測，以避免體積對熒光讀數(shù)的影響。

應(yīng)用GRAPH Pad Prism 8.0 中的two-phase exponential decay 進行統(tǒng)計分析，通過公式GFR=I/（A/α+B/β）計算GFR。其中I 為所測試小鼠實際注射的FITC 菊粉所對應(yīng)的熒光值，A 和B 是2 個衰減對應(yīng)的y 軸截距，α 和β 是2 段曲線的衰減常數(shù)（在GRAPH Pad Prism 8.0 中稱為Kfast、Kslow）。因FITC-菊粉在180min 以后血藥濃度趨近于0，在“contrain”欄中將“plateau”設(shè)置為“constant equal to 0”。

1.4 非同日GFR重復(fù)性檢測

使用上述GFR 檢測方法，隨機選取4 只db/db小鼠和4 只db/m 小鼠在非同日進行GFR 檢測，作為該方法的重復(fù)性檢測。

1.5 生化檢驗

在20 周齡、28 周齡隨機選取db/db 小鼠5 只和db/m 小鼠5 只，使用代謝籠留取12h 尿液標(biāo)本用于檢測尿糖、尿微量白蛋白/肌酐。

1.6 小鼠腎組織病理檢查

處死20 周齡、28 周齡db/db 小鼠和db/m 小鼠各5 只，腎臟標(biāo)本固定于4%福爾馬林后石蠟包埋，2μm切片后行PAS染色，光鏡下觀察。腎小球直徑：每只小鼠的PAS 染色切片在光鏡下隨機選取10 個帶血管極和（或）尿極的腎小球，測量經(jīng)尿極和（或）血管極的直徑記為腎小球直徑，最后計算平均直徑[6]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

同一標(biāo)本2 次結(jié)果的對比采用配對t檢驗。2組小鼠不同時間點體重、血糖及GFR 的比較采用兩因素重復(fù)測量方差分析，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗。連續(xù)變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 改良版小鼠FITC-菊粉清除率的計算過程解析及穩(wěn)定性評估

在內(nèi)眥靜脈叢注射FITC-菊粉之后1、2、3、4、5、7、10、15、35、55、75min 的小鼠血漿稀釋至40μl，實測熒光值減去空白對照平均熒光值（40μl HEPES 液所測得的熒光值，設(shè)置至少3 個復(fù)孔），再除以稀釋倍數(shù)，得到該時間點每微升血漿產(chǎn)生的熒光值，該值隨時間變化的曲線如圖1所示，符合兩室模型（two-phase exponential decay）。使用FITC-菊粉原液稀釋200倍，取40μl檢測熒光（設(shè)3 個復(fù)孔）用于計算每微升FITC-菊粉對應(yīng)的熒光值，與注射的體積相乘得到小鼠注入的熒光總量I。以公式GFR=I/（A/α+B/β）計算GFR。

隨機選取4 只db/db 小鼠和4 只db/m 小鼠在非同日進行GFR 檢測，結(jié)果如圖2 所示，2 次檢測的GFR 一致性較好，雖均值略有差別，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（配對t檢驗，P＞0.05）。因小鼠在清醒狀態(tài)下尾靜脈采血進行檢測，且時間點有固定要求，容易因不能配合等因素造成某個時間點采血失敗，因此本研究改良了文獻報道的方法，增加了時間點設(shè)計以保證獲得足夠的GFR 有效數(shù)據(jù)。為了驗證本方法的穩(wěn)定性及可操作性，我們隨機選取10次小鼠的GFR 檢測數(shù)據(jù)，每次檢測的全部數(shù)據(jù)中任意去掉1個時間點，觀察缺少1個時間點對GFR 計算結(jié)果的影響。經(jīng)GRAPH Pad Prism 8.0軟件驗證，缺少1 個時間點的數(shù)據(jù)所得的熒光衰減曲線符合兩室模型，能夠進行GFR 計算。如表1 所示，注射后1min 時間點的數(shù)據(jù)缺少使得GFR結(jié)果的偏差最大，平均達到31.0μl/min（范圍1～130μl/min），與原始GFR 的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。注射后2min 數(shù)據(jù)缺少計算GFR 結(jié)果的偏差為11μl/min（范圍3～24μl/min），但與原始GFR 相比差異仍具有統(tǒng)計學(xué)意義。從第3min 之后的數(shù)據(jù)缺少，對結(jié)果的影響差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），雖然15min 以后數(shù)據(jù)缺少所致GFR偏差達45～113μl/min，但主要發(fā)生在GFR＞1000μl/min 的檢測中，＜1000μl/min 檢測的差異仍然較小，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 同一小鼠非同日檢測GFR結(jié)果對比

表1 不同時間點缺少數(shù)據(jù)后的GFR數(shù)值（μl/min）

2.2 小鼠的血糖、體重及尿糖、尿蛋白變化

db/db 小鼠體型肥胖、毛色順滑，活動量顯著少于對照小鼠。圖3示，觀察組小鼠8周齡體重為42.5±4.9g，與正常對照組（22.9±1.5g）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），并且在8～28 周齡期間2 組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），在28 周齡時體重達到最大值，為61.5±9.4g。db/db 小鼠在8 周時空腹血糖20.4±10.0mmol/L，與正常對照組（9.2±2.0mmol/L）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），血糖水平在28 周內(nèi)基本保持穩(wěn)定，2 組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。20 周齡和28 周齡db/db 小鼠的尿糖也顯著高于對照組小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。20 周齡時db/db 小鼠的尿微量白蛋白/肌酐為38.07±27.73mg/mmol Cr，顯著高于對照小鼠0.04±0.01mg/mmol Cr（P=0.008）。28 周齡時db/db 小鼠的尿微量白蛋白/肌酐仍維持較高水平，為24.33±10.74mg/mmol Cr，顯著高于對照小鼠（P=0.029）。

圖3 db/db小鼠的體重和血糖變化

2.3 db/db小鼠GFR的變化

圖4 示，db/db 小鼠的GFR 均值在8～20 周齡期間高于正常對照組，其中第16周齡和20周齡分別為851.1±235.2μl/min 和796.0±338.7μl/min，與同期正常對照組（440.5±182.1μl/min 和299.6±74μl/min）相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），2 組間均值的差值達到410.6μl/min 和496.4μl/min。從第24 周齡開始，GFR 下降至與對照組接近，提示db/db小鼠的腎小球高濾過期持續(xù)至20周齡。

圖4 db/db小鼠的GFR動態(tài)變化

2.4 db/db小鼠腎臟病理改變

圖5（見封二）示，20 周齡的db/db 小鼠的腎臟病理表現(xiàn)為腎小球肥大，腎小球平均直徑為32.6±1.6μm，顯著高于對照小鼠（25.0±0.9μm），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.08）。28周齡的db/db小鼠不僅存在腎小球肥大，腎小球直徑為31.6±1.7μm，仍然顯著高于對照小鼠（26.4±1.4μm），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.016），而且部分腎小球出現(xiàn)系膜基質(zhì)增多（見圖5C）。

圖5 db/db小鼠和對照小鼠的腎臟病理表現(xiàn)及腎小球直徑（PAS×100）

3 討論

小鼠GFR 的檢測受到其血、尿標(biāo)本量少的限制，傳統(tǒng)的GFR 檢測方法如菊粉清除率、肌酐清除率等實施難度較大[1，2]，一些新型的檢測方法如經(jīng)皮小鼠GFR 檢測方法[3]、近紅外光熒光分析檢測法[4]則需特殊儀器才能實現(xiàn)。國外文獻報道的使用FITC 菊粉通過檢測血漿中熒光衰減速率計算GFR 的方法具有一定優(yōu)勢[5，7]，并且在為數(shù)不多的幾項研究中得到應(yīng)用[8～10]，但是相關(guān)報道仍然較少，尤其在國內(nèi)更未查到?？赡艿脑蛴校海?）既往的文章對該方法原理、操作過程及計算方法的描述欠清晰；（2）由于小鼠采血困難，在本文作者嘗試的過程中，發(fā)現(xiàn)個別時間點如果采血不成功將導(dǎo)致本次GFR 檢測整體失敗，增加了實驗難度。因此，我們仔細學(xué)習(xí)并復(fù)制該方法之后通過總結(jié)和改進，摸索出改良版的FITC-菊粉清除率測定方法，較原方法更為準(zhǔn)確，并具有更好的可操作性。第1min 和第2min 的熒光數(shù)據(jù)缺失對檢測的準(zhǔn)確性影響最大，文中作了詳細描述，供國內(nèi)學(xué)者參考。

db/db 小鼠是一種先天性2 型糖尿病小鼠，也常被用于糖尿病腎病相關(guān)的研究[11，12]。本文觀察到db/db 小鼠在28 周齡內(nèi)腎臟損傷的變化，使用改良的FITC-菊粉清除率測定方法檢測GFR 動態(tài)改變，同時觀察20周齡和28周齡時尿蛋白水平和腎臟病理表現(xiàn)，證實db/db 小鼠在20 周齡以后出現(xiàn)腎小球高濾過、微量白蛋白尿以及腎小球肥大、系膜基質(zhì)增多等糖尿病腎病的早期表現(xiàn)。

3.1 檢測原理的解讀

FITC-菊粉注射之后血漿熒光值隨時間的變化曲線符合藥代動力學(xué)中常用的兩室模型（twophase exponential decay）。其中快速衰減相（分布相）血藥濃度下降很快，主要源于2 個途徑，一個是藥物從血管內(nèi)轉(zhuǎn)移到血管外造成的血藥濃度顯著下降，另一個是機體代謝和排泄的消除；而慢速衰減相（消除相）曲線較為平坦，是因為藥物在血管內(nèi)外分布已達到平衡，僅有藥物的代謝和排泄因素主要參與血藥濃度的下降，菊粉在體內(nèi)的代謝符合這一規(guī)律。曲線的橫坐標(biāo)為時間（tx），縱坐標(biāo)為血漿中檢測到的熒光強度（Y）。該模型的曲線函數(shù)是Y=Ae-αtx+Be-βtx+平臺值。因在180min 后認為菊粉已經(jīng)完全清除，血藥濃度接近于0，故平臺值是0，函數(shù)簡化為Y=Ae-αtx+Be-βtx。GFR=I/（A/α+B/β），具體計算見方法部分。

3.2 靜脈注射部位的選擇

小鼠靜脈注射的傳統(tǒng)方式是尾靜脈注射，但小鼠的尾靜脈較細，穿刺失敗率高，即使成功，因管徑太細，注射時間較長，不能滿足本研究彈丸式注射的要求。而且在清醒狀態(tài)下，小鼠尾部不易固定，極易跑針，難以保證藥物劑量。內(nèi)眥靜脈叢注射是近年來新興的小鼠靜脈注射方式，其優(yōu)勢是操作簡便、成功率高、能夠完成短時間大劑量注射，平均注射100μl 液體僅需1.49s，10 次注射的成功率能夠達到100%[13]。本研究采用內(nèi)眥靜脈注射，在預(yù)實驗充分練習(xí)注射后，正式實驗注射成功率也接近100%。需要注意的操作要點是，充分固定小鼠頭部，使眼球突出，于內(nèi)眥區(qū)域斜行負壓進針，刺入眼球后方，進針深度為2～3mm，避免傷及眼球，見回血時進行注射，注射完畢后迅速放開小鼠、解除頭部的壓力，避免藥液及血液外流。

3.3 檢測開始前增加灌胃步驟

因檢測過程長達75min，小鼠因緊張等因素飲水進食量均較小，為避免有效循環(huán)血量改變對GFR的影響，增加飲用水灌胃步驟。此外，糖尿病小鼠對水的需求較高，測試開始前灌注飲用水可避免脫水等不良事件的發(fā)生。

3.4 熒光檢測儀器和采血量的改進

文獻中的熒光檢測使用的是分光光度計，所需檢測樣本體積相對較大，且每次測量樣本量有限。因本實驗嘗試使用的熒光酶標(biāo)儀，精確度較高且樣本的最小體積能夠達到40μl，在預(yù)實驗中小鼠血漿成倍稀釋后熒光測定值的線性關(guān)系良好，故本實驗將每次的采血量降低到5μl，以最大限度減少對循環(huán)血量的影響。此外，該儀器可使用96孔板檢測，使得同時檢測的樣本量大大提升。

3.5 對檢測時間點的改進

文獻報道的采樣時間大多為3、7、10、15、35、55 及75min 共7 個時間點[5]，但我們在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)僅有7 個時間點不能保證每只檢測的小鼠得到符合兩室模型曲線，有時GRAPH Pad Prism 8.0會出現(xiàn)“Ambiguous”字樣。此時得到的參數(shù)計算結(jié)果誤差很大，尤其當(dāng)個別時間點采樣失敗時更易出現(xiàn)這種情況。因此，我們增加了檢測時間點。由于在前幾分鐘內(nèi)血漿熒光值衰減速率較快，因此為得到更準(zhǔn)確的曲線，我們在前5min 內(nèi)每min進行檢測，將時間點增加至11個，所有曲線未再出現(xiàn)“Ambiguous”字樣，且減少任意1 個時間點仍能得到合格曲線，除第1min和第2min的檢測結(jié)果缺失會產(chǎn)生有統(tǒng)計學(xué)意義的差異，其他時間點某一個數(shù)據(jù)缺失對GFR 結(jié)果影響不大。此外，在非同日重復(fù)檢測同一只小鼠的GFR，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示該方法具有良好的操作性和可重復(fù)性。

3.6 db/db小鼠高濾過狀態(tài)的觀察

糖尿病腎病最早期的表現(xiàn)為腎小球高濾過，之后隨著尿蛋白的增多，GFR逐漸下降，但國內(nèi)缺少對糖尿病小鼠GFR 的觀察。本文使用先天性2型糖尿病db/db 小鼠作為糖尿病小鼠模型，在28周齡內(nèi)觀察其GFR 的變化，為日后研究糖尿病腎病早期高濾過狀態(tài)的機制打下基礎(chǔ)。本文觀察到從8 周齡開始，db/db 小鼠的GFR 均值雖高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，到16 周齡和20 周齡，db/db 小鼠出現(xiàn)了具有統(tǒng)計學(xué)意義的高GFR 狀態(tài)，同時，在20 周齡以后db/db 小鼠出現(xiàn)微量白蛋白尿和輕度的腎臟病理損傷，符合糖尿病腎病的早期表現(xiàn)。

綜上所述，經(jīng)過增加采血時間點、減少采血量、改進熒光檢測方法、檢測前增加飲用水灌胃步驟等措施改良的FITC-菊粉清除率測定是一種更為準(zhǔn)確、穩(wěn)定的檢測清醒小鼠GFR 的方法，具有較高的應(yīng)用價值。經(jīng)過28周的觀察，證實db/db小鼠在20 周齡以后出現(xiàn)腎小球高濾過、微量白蛋白尿以及腎小球肥大、系膜基質(zhì)增多等病理損傷，該小鼠可作為研究糖尿病腎病早期的動物模型。