NQO1對膀胱癌的生物學(xué)特性和預(yù)后的影響

矯賓賓，丁振山，黃 濤，徐 鑫，張 冠*

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院泌尿外科，北京 100020；2.中日友好醫(yī)院泌尿外科，北京 100029）

在我們前期研究中，基于腫瘤微環(huán)境中ROS（活性氧）響應(yīng)型納米載藥體系在膀胱癌的治療中取得了較好的療效[1]，為進(jìn)一步探究提升ROS 的水平是否造成腫瘤組織和正常組織中ROS 水平的差異，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)我們發(fā)現(xiàn)ROS 的產(chǎn)生與基因NQO1（NAD（P）H quinone oxidoreductase 1）的表達(dá)密切相關(guān)[2～5]。在后期研究中，我們擬通過激活NQO1 提高膀胱癌組織中ROS 水平。NQO1 在膀胱癌中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系、及其在膀胱癌中的生物學(xué)信息尚未闡明，本文就NQO1在膀胱癌中的詳細(xì)分子生物信息學(xué)特性展開研究，為后續(xù)進(jìn)一步利用其調(diào)控ROS 產(chǎn)生的能力設(shè)計制備級聯(lián)放大效應(yīng)的ROS 響應(yīng)性納米藥物在膀胱癌灌注化療中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集獲取

本研究從The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//cancergenome.nih.ov/，2022-02-03）下載了433 個BLCA 樣本的mRNA 測序數(shù)據(jù)，其中19 個樣本是正常樣本。并同時下載了相關(guān)臨床數(shù)據(jù)。本研究的全過程都遵守了TCGA 數(shù)據(jù)庫的相關(guān)準(zhǔn)則和政策。

1.2 差異表達(dá)和富集分析

通過選取腫瘤組織與正常組織樣本做關(guān)于NQO1的差異表達(dá)，同時通過配對信息，做腫瘤組與正常組的配對差異分析。對比NQO1的表達(dá)差異。

根據(jù)NQO1 的表達(dá)情況，由高到低排列，選取NQO1 表達(dá)的中間值為截斷點，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。對兩組進(jìn)行差異分析，通過得到的差異基因進(jìn)一步行富集分析。

1.3 相關(guān)分析

Cox 回歸模型log-rank 檢驗比較高、低表達(dá)組膀胱癌患者的總生存期（OS），通過預(yù)測網(wǎng)站對比無疾病進(jìn)展生存期（DFS）有無差異，并計算風(fēng)險比（hazard ratio，HR）。分析NQO1 與臨床相關(guān)信息（年齡、TNM、stage分期）的相關(guān)性等。

通過TIMER 軟件做NQO1與免疫細(xì)胞標(biāo)記物及免疫細(xì)胞的共表達(dá)分析，分析NQO1 在膀胱癌中與免疫浸潤的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計軟件R 語言（4.0.3 版本）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線并通過Log-rank檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1 NQO1基因在正常膀胱及膀胱癌組織中的表達(dá)

通過TCGA 膀胱癌mRNA 的數(shù)據(jù)，我們共得到433個樣本信息。其中腫瘤樣本424個，正常組織樣本19個。通過樣本名稱匹配，我們得到的19個正常樣本為腫瘤樣本中腫瘤的癌旁正常組織，可以行配對差異分析。NQO1 基因在膀胱癌組織中的表達(dá)與對應(yīng)的正常膀胱組織比較，NQO1 基因在膀胱癌組織中的表達(dá)顯著降低，無論是配對對比還是腫瘤樣本與正常組織樣本對比，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義，即NQO1 在腫瘤組織樣本中存在過表達(dá)現(xiàn)象。（圖1）。

圖1 A.腫瘤樣本與正常組織對比；B.配對樣本腫瘤組與癌旁正常組織的對比

2.2 差異分析和功能富集結(jié)果

以NQO1的表達(dá)量分為高低表達(dá)，2組進(jìn)一步做差異分析和功能富集，NQO1 編碼蛋白主要定位于細(xì)胞核，分子生物學(xué)功能主要為酶和蛋白結(jié)合，生物學(xué)過程主要為信號調(diào)控。而相關(guān)信號通路主要富集于癌癥相關(guān)信號通路如細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號通路等。如圖2所示。

圖2 以NQO1表達(dá)量分為高低2組后，差異基因的功能富集分析

2.3 NQO1的表達(dá)與臨床信息的相關(guān)性分析

我們分別就與年齡、TNM、分期做了進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)NQO1與上述無明顯統(tǒng)計學(xué)相關(guān)。如圖3所示。

圖3 NQO1的表達(dá)與臨床信息的相關(guān)性

在與預(yù)后相關(guān)性的研究中，我們基于TCGA發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與總體生存期無明顯相關(guān)性。通過網(wǎng)站分析工具（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）結(jié)合TCGA 及GTX 數(shù)據(jù)庫，在疾病無進(jìn)展生存期方面，NQO1 與預(yù)后有明顯相關(guān)性，并對相關(guān)臨床因素做了獨立風(fēng)險因素分析，NQO1 非影響膀胱癌總體生存期的獨立風(fēng)險因素。需要額外說明的是，因為此網(wǎng)站分析工具是基于TCGA 及GTX 數(shù)據(jù)庫，所以部分?jǐn)?shù)據(jù)可能與TCGA 實時數(shù)據(jù)庫的信息有少許出入，如圖4所示。

圖4 A.NQO1高低表達(dá)2組在膀胱癌中總體生存期的比較；B.NQO1高低表達(dá)2組在腫瘤無進(jìn)展生存期中的比較

2.4 NQO1在膀胱癌中的表達(dá)與免疫浸潤的關(guān)系

通過線上工具TIMER，我們發(fā)現(xiàn)NQO1 的表達(dá)與部分免疫細(xì)胞存在相關(guān)性，如B 細(xì)胞（正相關(guān)），CD8+T 細(xì)胞（負(fù)相關(guān)），CD4+T 細(xì)胞（負(fù)相關(guān)），與巨噬細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞無明顯相關(guān)性；我們進(jìn)一步探究了NQO1 在膀胱癌中的表達(dá)與免疫細(xì)胞標(biāo)記物的共表達(dá)分析，我們發(fā)現(xiàn)NQO1的表達(dá)與大多數(shù)各類免疫細(xì)胞的標(biāo)記物存在共表達(dá)相關(guān)性。具體如下,B 細(xì)胞標(biāo)記物：CD19（負(fù)相關(guān)），CD79A（負(fù)相關(guān)）；CD8+T 細(xì)胞：CD8A（負(fù)相關(guān)），CD8B（負(fù)相關(guān)）；CD4+T 細(xì)胞：CD4（負(fù)相關(guān)）；巨噬細(xì)胞：NOS2（負(fù)相關(guān)），IRF5（正相關(guān)），PTGS2（負(fù)相關(guān)）；中性粒細(xì)胞：CEACAM8（負(fù)相關(guān)），ITGAM（負(fù)相關(guān)），CCR7（負(fù)相關(guān)）。如圖5、圖6所示。

圖5 NQO1表達(dá)與免疫細(xì)胞的關(guān)系

圖6 NQO1表達(dá)與免疫細(xì)胞標(biāo)記物的關(guān)系

3 討論

在我們前期研究中，我們通過設(shè)計ROS 響應(yīng)型的納米載藥體系，在膀胱癌灌注化療中取得了較好的療效，但我們發(fā)現(xiàn)僅僅依靠膀胱癌腫瘤組織中自有的較高的ROS 水平來實現(xiàn)腫瘤組織和正常組織的ROS 水平的差異依然相對不足。所以，我們希望通過進(jìn)一步提高腫瘤組織中的ROS水平擴(kuò)大與正常組織的差異來實現(xiàn)ROS 響應(yīng)性藥物對腫瘤組織的高選擇性殺傷。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)NQO1 與ROS 的產(chǎn)生密切相關(guān)。NQO1 是一種黃素蛋白，作為同型二聚體發(fā)揮作用，與FAD 結(jié)合的每個單體都會催化多種醌的強(qiáng)制性雙電子還原為它們的氫醌形式，會消耗細(xì)胞輔助因子NADH或NADPH[6]。這些對氫醌的形式通常非常不穩(wěn)定，會自發(fā)與氧氣反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化回母體醌。這種無效循環(huán)會導(dǎo)致顯著的NAD（P）H 氧化并產(chǎn)生ROS，包括最終導(dǎo)致過氧化氫（H2O2）形成的超氧化物。H2O2的產(chǎn)生會產(chǎn)生氧化應(yīng)激并促進(jìn)細(xì)胞死亡[7]。基于此，我們希望通過選擇合適的方法進(jìn)一步擴(kuò)大腫瘤組織與正常組織二者之間ROS 水平的差值，增大藥物的治療窗口，實現(xiàn)級聯(lián)放大效應(yīng)。NQO1 底物如蘭雪醌、β-拉帕酮（LAPA）、丹參酮IIA 可通過NQO1 介導(dǎo)的氧化還原循環(huán)觸發(fā)過量的ROS 形成誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，并已成為一種有前途的選擇性抗癌療法[8]。有研究指出，在PEG-PMAN 嵌段共聚物膠束中共包封LAPA 和ROS響應(yīng)前藥BDOX，有效地建立了級聯(lián)放大藥物釋放系統(tǒng)[9]。但LAPA 存在藥代動力學(xué)弱、生物利用度有限、水溶性差、半衰期短、需要給藥系統(tǒng)等障礙[10～12]。仍需尋找更為合適的NQO1底物。

NQO1 是一類通常在真核細(xì)胞中表達(dá)的黃素蛋白酶。它通過電子還原反應(yīng)積極參與各種醌的代謝及其體內(nèi)生物活化[13]。與正常細(xì)胞相比，NQO1 的表達(dá)水平在許多實體瘤細(xì)胞中高度上調(diào)。相對于正常組織樣本，NQO1 水平在多種癌癥類型中表達(dá)水平顯著增加，如肺癌、結(jié)腸直腸癌和乳腺癌等[14～16]。NQO1 因其在腫瘤中的過表達(dá)和生物活性而被認(rèn)為是候選分子靶標(biāo)。但NQO1在膀胱癌中的表達(dá)情況及生物信息學(xué)特性尚未有過較為全面的探究，本文的研究結(jié)果為后續(xù)實驗奠定理論基礎(chǔ)。

目前對腫瘤微環(huán)境相對于正常組織的成分差異目前已成為智能納米藥物的介入點。所以，目標(biāo)成分在腫瘤組織和正常組織中的顯著差異是產(chǎn)生響應(yīng)以提高靶向性的前提基礎(chǔ)。在本研究中，通過TCGA 下載的膀胱癌的表達(dá)矩陣，無論從腫瘤樣本與正常樣本的常規(guī)對比，還是配對對比，均發(fā)現(xiàn)NQO1 在腫瘤標(biāo)本與正常標(biāo)本之間存在差異性表達(dá)，這為ROS 響應(yīng)性納米藥物基于NQO1 的差異表達(dá)在膀胱癌中的應(yīng)用提供了前提條件，也是本研究關(guān)注的主要研究結(jié)果。但目前的腫瘤微環(huán)境和正常組織中的差異是否足以產(chǎn)生有效的刺激響應(yīng)有待于進(jìn)一步實驗探究。

在臨床及預(yù)后的相關(guān)性研究中，我們發(fā)現(xiàn)NQO1 的表達(dá)與疾病無進(jìn)展生存期存在相關(guān)性，但與總體生存期無顯著相關(guān)性。同時，對于與臨床信息如TNM 分期及分級相關(guān)性方面，NQO1 的表達(dá)與其無明顯相關(guān)性。這可能對設(shè)計的納米藥物提出挑戰(zhàn)，是否注重應(yīng)用NQO1 本身的對膀胱癌細(xì)胞的殺傷作用，還是著重對NQO1 本身產(chǎn)生ROS 進(jìn)行重點設(shè)計，需要進(jìn)一步權(quán)衡。NQO1 對疾病的進(jìn)展相關(guān)，且NQO1 的高表達(dá)對應(yīng)更差的疾病進(jìn)展，基于此，是否可以設(shè)計一款針對NQO1的納米藥物，抑制NQO1 的表達(dá)，延緩疾病進(jìn)展，提高預(yù)后效果。

目前腫瘤微環(huán)境的概念逐漸成為研究熱點，免疫浸潤和腫瘤微環(huán)境對各種腫瘤發(fā)生、發(fā)展起重要作用，腫瘤分子特征和免疫微環(huán)境的動態(tài)相互作用可產(chǎn)生不同臨床結(jié)果。本研究顯示，NQO1與膀胱癌浸潤B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞顯著相關(guān)，即NQO1 的表達(dá)水平與免疫標(biāo)志物CD19、CD79A、CD8A、CD8B、CD4、NOS2、IRF5、PTGS2、CEACAM8、ITGAM、CCR7 等顯著相關(guān)，表明NQO1 在腫瘤免疫浸潤細(xì)胞中具有重要調(diào)節(jié)作用，可能與腫瘤免疫逃逸有關(guān)。這為后續(xù)我們制備納米載藥體系是否可以聯(lián)合免疫治療提供一個新思路。

雖然我們在本研究中，對NQO1 在膀胱癌中的生物信息學(xué)作用做了比較詳細(xì)的研究，但在應(yīng)用實際臨床樣本進(jìn)行驗證尚缺部分?jǐn)?shù)據(jù)，其次，對于NQO1 與腫瘤的重要預(yù)后指標(biāo)理論上無明顯相關(guān)性，這對后期的納米藥物設(shè)計的功能偏重方向提出挑戰(zhàn)。

綜上所述，本研究對于NQO1 在膀胱癌中的生物信息學(xué)作用進(jìn)行了較為詳細(xì)的闡述，基于NQO1 導(dǎo)致ROS 水平在腫瘤和正常組織的差異，設(shè)計制備ROS響應(yīng)性的納米藥物可行性較高。