紅螯光殼螯蝦（Cherax quadricarinatus）血細胞生成的初步研究

劉 芳，蘇 慧，尹文娟，王麗燕，孫金生

（1.天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

甲殼動物像其他無脊椎動物一樣缺乏獲得性免疫（acquired or adaptive immunity）系統(tǒng)，僅擁有天然免疫（innate immunity）系統(tǒng).各種血細胞通過吞噬、包囊、結(jié)節(jié)、黑化以及分泌免疫活性分子等反應(yīng)在整個免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1].甲殼動物的血細胞通?？煞譃轭w粒細胞（granular cells，GC）、半顆粒細胞（semigranular cells，SGC）和透明細胞（hyaline cells，HC）[2].根據(jù)胞質(zhì)顆粒的大小、數(shù)量、遮光性和特定的核質(zhì)比等特征，一些甲殼動物如格魯西東歐螯蝦、鋸緣青蟹和中華絨螯蟹等的血細胞又進一步分為透明細胞、小顆粒細胞、中顆粒細胞和大顆粒細胞[3-4]，它們都在機體固定或破壞外來微生物過程中起著關(guān)鍵作用[1].甲殼動物生存環(huán)境復(fù)雜，經(jīng)常面對外界環(huán)境壓力、病原感染、爭斗以及蛻皮等生理過程，其血細胞數(shù)量和組成常會發(fā)生急劇變化，機體需不斷造血以更新和補充損耗的血細胞，因此，活躍的造血機能對甲殼動物來說尤為重要[5].由造血干細胞產(chǎn)生成熟血細胞并釋放到循環(huán)系統(tǒng)中的過程就是造血過程，造血過程生成形態(tài)各異的血細胞，構(gòu)成了甲殼動物免疫的核心和基礎(chǔ).了解造血過程中血細胞的產(chǎn)生、分化和免疫功能是探究甲殼動物免疫防御機制的前提和關(guān)鍵.甲殼動物血細胞主要是由造血組織（hemopoietic tissue，HPT）分化產(chǎn)生[6]，研究者根據(jù)造血組織中細胞的形態(tài)學特征如細胞大小、胞質(zhì)顆粒以及細胞器發(fā)育情況等，對其進行了初步分類，主要包括4～5種不同的細胞類型[2，7].Van de Braak等[2]發(fā)現(xiàn)對蝦的造血組織中有4種主要的細胞類型：1型細胞為前體細胞，可進一步分化為2型（未成熟SGC）和3型（未成熟GC）細胞，4型細胞為間質(zhì)細胞，1～3型細胞均可分裂.為更清楚地了解血細胞在造血組織中是如何分化產(chǎn)生的，研究人員嘗試尋找不同發(fā)育階段血細胞的特異標志物來鑒定甲殼動物的造血組織和血細胞譜系.近年來有研究者依據(jù)血細胞的形態(tài)學分類，從mRNA和蛋白水平對相應(yīng)的分子標記進行篩選，獲得了一些在不同血細胞中特異性表達的標記分子，為研究甲殼動物血細胞的功能分型奠定了基礎(chǔ)[8]，但這些標記分子與血細胞分化過程中造血組織細胞的對應(yīng)關(guān)系以及在不同甲殼動物中的適用性還有待進一步研究.因此，同果蠅和其他模式動物相比，甲殼類動物的研究由于缺乏明確的遺傳和分子標記而受到阻礙.

紅螯光殼螯蝦（Cherax quadricarinatus）隸屬甲殼動物亞門（Crustacea）軟甲綱（Malacostraca）十足目（Decapoda）擬螯蝦科（Parastacidae）滑螯蝦屬（Cherax），原產(chǎn)于澳大利亞北部，又名澳洲淡水龍蝦，是一種適應(yīng)性極強的淡水蝦種[9]，其造血組織位于胃背側(cè)，呈半透明薄膜狀，整體由許多卵形小葉構(gòu)成，每個卵形小葉均由結(jié)締組織環(huán)繞構(gòu)成[10].本研究對失血刺激后紅螯光殼螯蝦造血組織細胞的增殖變化進行觀察，利用流式細胞技術(shù)對失血和脂多糖（LPS）刺激后的螯蝦血細胞組成變化進行研究，分析了紅螯光殼螯蝦血細胞的可能生成過程，研究結(jié)果為進一步揭示甲殼動物的造血作用提供實驗依據(jù)，也為無脊椎動物免疫系統(tǒng)的研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

紅螯光殼螯蝦購自蘇州傲龍生態(tài)水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，體質(zhì)量為（73.4±10.2）g，體長為（10.0±2.3）cm.實驗前將螯蝦置于深缸內(nèi)暫養(yǎng)7 d，養(yǎng)殖溫度為25℃，24 h連續(xù)充氣，每天喂食1次，使其適應(yīng)新環(huán)境.

固定液（4%多聚甲醛）、甘氨酸，生工生物工程（上海）股份有限公司；LPS，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；Cell-Light EdU Apollo488 In Vitro Kit、EdU檢測試劑盒，廣州銳博生物技術(shù)有限公司.磷酸緩沖液（CPBS）[11]：10 mmol/L Na2HPO4、10 mmol/L KH2PO4、150 mmol/L NaCl、10 mmol/L CaCl2、10 mmol/L MnCl2、2.7 mmol/L KCl，pH值為6.8.抗凝劑：29.6 mmol/L檸檬酸鈉、167.7 mmol/L NaCl、100 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L檸檬酸、10 mmol/L EDTA（Na2），pH值為7.2.所有試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 實驗方法

1.2.1 失血刺激下紅螯光殼螯蝦造血組織的細胞增殖

隨機選取健康且活力較好的紅螯光殼螯蝦18只，9只為對照組，9只為實驗組.向?qū)φ战M螯蝦的腹節(jié)注射150 μL 0.3 mg/mL的EdU（參考Cell-Light EdU Apollo488 In Vitro Kit使用說明）.實驗組中，先用含2 mL預(yù)冷抗凝劑的注射器從每只螯蝦第2腹節(jié)的腹側(cè)血腔中抽血2 mL，之后注射EdU.在處理后的6、12、24 h，分別從對照組和實驗組取3只螯蝦獲取其造血組織，參照文獻[5]中的方法分離螯蝦造血組織細胞，將細胞按照1×106個/孔的密度平鋪于24孔細胞培養(yǎng)板中，用Cell-Light EdU Apollo488 In Vitro Kit試劑盒進行染色，置于熒光顯微鏡下觀察.

1.2.2 紅螯光殼螯蝦的血細胞再生標記

取3只健康、活力較好的紅螯光殼螯蝦，注射150μL 0.3 mg/mL的EdU于腹節(jié)，每隔3 d補充注射EdU.分別在注射后2、4、6、8 d時抽血1.5 mL，置于等量的4%多聚甲醛中固定30 min，在4℃、3 000 r/min條件下離心5min，收集血淋巴細胞，利用Cell-LightEdUApollo488 In Vitro Kit試劑盒對其進行染色，并在顯微鏡下觀察.

1.2.3 失血刺激下紅螯光殼螯蝦血淋巴細胞的變化

取12只健康的紅螯光殼螯蝦，分別抽血1 mL.在抽血0、12、24、36 h后分別取3只螯蝦，各抽取血淋巴2 mL，于4%多聚甲醛中固定10 min，后懸于CPBS中，利用流式細胞儀（FlowSight多維全景分析儀，美國Merck Millipore公司）檢測各時間點各類型血細胞的變化情況.

1.2.4 LPS刺激下紅螯光殼螯蝦血淋巴細胞的變化

取18只健康的紅螯光殼螯蝦，9只為對照組，9只為實驗組.對照組中每只螯蝦分別注射100μLCPBS，實驗組中每只螯蝦分別注射100 μL 1 mg/mL的LPS.在對照組和實驗組螯蝦注射12、24、36 h后，分別各取3只螯蝦，每只螯蝦抽取血淋巴2 mL，在4%多聚甲醛中固定10 min，后懸于CPBS中，利用流式細胞儀檢測各時間點各類型血細胞的變化情況.

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

利用IDEAS Application軟件處理和分析各類型血細胞的變化情況，利用SPSS軟件對差異進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 失血刺激對造血組織細胞增殖的影響

利用EdU對紅螯光殼螯蝦造血組織細胞的增殖進行檢測，結(jié)果如圖1和表1所示.

圖1 失血刺激后紅螯光殼螯蝦造血組織細胞的EdU標記情況Fig.1 EdU labeling of hemopoietic tissue cells of C.quadricarinatus after exsanguination stimulation

由圖1和表1可以看出，在失血處理后的6、12和24 h，無論失血與否，紅螯光殼螯蝦造血組織細胞都處于活躍的增殖狀態(tài)，無明顯增殖差異，說明正常情況下造血組織始終處于活躍的分裂狀態(tài).

表1 失血刺激后紅螯光殼螯蝦造血組織細胞增殖的比例Tab.1 Proliferation proportion of hemopoietic tissue cells of C.quadricarinatusafterexsanguination stimulation %

2.2 失血刺激對血淋巴細胞的影響

2.2.1 紅螯光殼螯蝦血細胞的再生

用EdU標記紅螯光殼螯蝦后，每隔2 d抽血1.5 mL，在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖2所示.從圖2可以看出，在第6天時，血細胞中出現(xiàn)被EdU標記的新生血細胞；第8天時被標記的血細胞數(shù)目增多，且被標記的新生血細胞較其他血細胞體積小，核質(zhì)比高，大多呈圓形.

圖2 失血刺激后紅螯光殼螯蝦血細胞的EdU標記情況Fig.2 EdU labeling of hemocytes regeneration of C.quadricarinatus after exsanguination stimulation

2.2.2 失血刺激對血淋巴細胞比例的影響

利用流式細胞儀對紅螯光殼螯蝦血淋巴細胞進行檢測分析，根據(jù)側(cè)向散射值可將血細胞分為4類：透明細胞（R4）、小顆粒細胞（R5）、中顆粒細胞（R6）以及大顆粒細胞（R7），如圖3所示.失血刺激后各類血細胞比例如表2所示.由表2可知，失血刺激12 h后，透明細胞和小顆粒細胞的比例明顯升高，而中顆粒和大顆粒細胞的比例明顯降低；至24 h時，各類血細胞的比例基本恢復(fù)至正常水平.

表2 失血刺激后各類血細胞的比例Tab.2 Proportion of four types of hemocytes after exsanguination stimulation %

圖3 紅螯光殼螯蝦各類血細胞圖像流式分類分析Fig.3 Classification of all kinds of hemocytes in C.quadricarinatus by imaging flow cytometry

運用流式細胞儀所得數(shù)據(jù)對紅螯光殼螯蝦的各類型血淋巴細胞大小進行分析，結(jié)果如圖4所示.由圖4可以看出，透明細胞和小顆粒細胞主要分布在300～400 μm2之間，中顆粒細胞和大顆粒細胞主要分布在400～500 μm2之間.將各類細胞按200～300、300～400、400～500和500～600 μm2分為Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類和Ⅳ類，失血刺激后各類細胞所占比例的變化如表3所示.

表3 失血刺激后各類型血細胞中不同大小細胞的比例Tab.3 Proportion of hemocytes with different size in four types of hemocytes after exsanguination simulation %

由表3可知，失血12 h時，透明細胞和小顆粒細胞中Ⅰ類細胞的比例顯著增加，透明細胞中Ⅲ類和Ⅳ類細胞、小顆粒細胞中Ⅲ類細胞的比例顯著下降，中顆粒細胞中Ⅲ類細胞的比例在失血12和36 h時顯著下降.

2.3 LPS刺激對血淋巴細胞比例的影響

模擬病原刺激對紅螯光殼螯蝦進行LPS刺激后，利用流式細胞儀對血淋巴細胞的比例進行檢測分析，結(jié)果如表4所示.

表4 LPS刺激后各類型血細胞的比例Tab.4 Proportion of hemocytes in four types of hemocytes after LPS stimulation %

由表4可知，LPS刺激36 h時，小顆粒細胞的比例顯著升高；大顆粒細胞的比例在LPS刺激24和36 h時顯著降低.進一步對各類型細胞中不同大小細胞的比例進行分析，結(jié)果如表5所示.

表5 LPS刺激后各類型血細胞中不同大小細胞的比例Tab.5 Proportion of hemocytes with different size in four types of hemocytes after LPS stimulation%

由表5可知，在LPS刺激12 h時透明細胞和小顆粒細胞中Ⅱ類細胞的比例均顯著下降，而透明細胞中Ⅲ類細胞和小顆粒細胞中Ⅳ類細胞的比例顯著升高.至24 h時，透明細胞和小顆粒細胞中Ⅰ類和Ⅱ類細胞的比例都在LPS刺激后顯著升高，而透明細胞中Ⅲ類細胞和小顆粒細胞中Ⅲ類與Ⅳ類細胞的比例均顯著下降.中顆粒細胞中Ⅱ類細胞和大顆粒細胞中Ⅱ、Ⅲ類細胞的比例也在LPS刺激24 h時顯著上升，大顆粒細胞中Ⅳ類細胞的比例在LPS刺激24 h和36 h時顯著下降.

3 討論

血細胞是甲殼動物的主要免疫細胞，由造血組織產(chǎn)生.紅螯光殼螯蝦的造血組織由造血干細胞、原血細胞以及一些接近成熟的血細胞構(gòu)成[10，12].為了維持免疫系統(tǒng)功能，甲殼動物整個生命周期都需要連續(xù)且成比例地補充形成新的血細胞[13]，因此新生血細胞的產(chǎn)生、分化與釋放對于甲殼動物免疫防御具有重要意義.BrdU和EdU法常用于細胞增殖檢測，可測出S期細胞的比例[10]，而病原刺激易導(dǎo)致機體血細胞總數(shù)顯著降低[11，14]，并刺激造血組織細胞分裂以及釋放血細胞.為了探討紅螯光殼螯蝦造血組織在血細胞生成過程中的細胞增殖活性變化，本研究利用EdU法對失血刺激下紅螯光殼螯蝦造血組織細胞的增殖情況進行了檢測，發(fā)現(xiàn)在失血刺激6～24 h時，無論失血與否，螯蝦造血組織細胞都處于活躍的增殖狀態(tài)，無明顯增殖差異，說明正常情況下的紅螯光殼螯蝦造血組織始終處于活躍的分裂狀態(tài)，維持正常的造血功能.對失血的紅螯光殼螯蝦新生血細胞進行持續(xù)標記，在失血刺激6 d后發(fā)現(xiàn)，螯蝦血淋巴中出現(xiàn)的EdU標記的新生血細胞較其他成熟血細胞小且圓.這些較小的血細胞在其他十足類動物，如小龍蝦（Homarus americanus）和蜘蛛蟹（Hyas araneus）的循環(huán)血細胞中也有發(fā)現(xiàn)，它們具有體積較小、球形、高核質(zhì)比的特征[15-16].由于這些血細胞體積小且未明顯分化，具有未成熟細胞的典型形態(tài)特征，因此Van de Braak等[2]和Wu等[8]認為它們是前血細胞.

血細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)對所有生物的健康至關(guān)重要，當甲殼動物受到外傷或者外來微生物入侵時，血細胞會發(fā)揮免疫功能，導(dǎo)致循環(huán)血淋巴細胞數(shù)目下降，從而啟動造血過程.本研究模擬紅螯光殼螯蝦自然生存面臨的失血和感染危機，分別對其進行失血和LPS刺激，利用流式細胞儀對血細胞的類型及大小變化進行分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，失血刺激12 h時，透明細胞和小顆粒細胞增多，而中顆粒和大顆粒細胞減少.鑒于本研究利用EdU標記發(fā)現(xiàn)的新生血細胞形態(tài)較小，為深入分析各種血細胞的形成過程，進一步將各類型血細胞按大小分為Ⅰ類（200～300 μm2）、Ⅱ類（300～400 μm2）、Ⅲ類（400～500 μm2）和Ⅳ類（500～600 μm2），發(fā)現(xiàn)透明細胞和小顆粒細胞主要為Ⅱ類細胞，分布在300～400 μm2之間，中顆粒細胞和大顆粒細胞主要為Ⅲ類細胞，分布在400～500 μm2之間.隨著血細胞顆粒性的增加，細胞逐漸增大，同一類群不同細胞大小的差異暗示了血細胞在血淋巴中存在“成長”.失血刺激12 h時，發(fā)現(xiàn)透明細胞和小顆粒細胞的增加主要由各自的Ⅰ類細胞比例顯著增加造成，推測失血后螯蝦啟動造血過程可能最先產(chǎn)生釋放的為此類較小的前血細胞，在血淋巴循環(huán)系統(tǒng)中可進一步分化形成較大的成熟血細胞.這與Li等[17]報道的螯蝦成熟血細胞的形成模式比較類似，即由造血組織細胞產(chǎn)生的前血細胞在造血組織中分化產(chǎn)生，未成熟的血細胞從造血組織中釋放出來后，在循環(huán)系統(tǒng)中經(jīng)過1～3個月的時間分化成熟，循環(huán)血細胞中的半顆粒細胞和顆粒細胞可能代表血細胞的不同發(fā)育階段.另有一些原始甲殼類動物在血液循環(huán)中有血細胞分裂的現(xiàn)象，但這種現(xiàn)象在較高級的甲殼類動物中比較少見[18]，因此，循環(huán)系統(tǒng)中的S期血細胞反映了未成熟血細胞或原血細胞的過早釋放[16，19].蜘蛛蟹（Hyas araneus）的反復(fù)出血也會出現(xiàn)類似未成熟血細胞的產(chǎn)生，這些細胞被鑒定為原血細胞，在血淋巴丟失后被誘導(dǎo)釋放[16].Van de Braak等[2]認為對蝦造血組織中的2、3型細胞與傳統(tǒng)意義上循環(huán)血淋巴中的透明血細胞類似，推測2、3型細胞以透明細胞的形式釋放到循環(huán)血淋巴后，成熟為SGC和GC.

病原侵染引起的血細胞免疫反應(yīng)是造成甲殼動物大量血細胞損失的另一重要因素[20].中顆粒和大顆粒細胞在參與免疫過程中，通常會伴隨著脫顆粒破裂而釋放一些酶類，如酚氧化酶、酸性磷酸酶、溶菌酶等，可以直接殺滅外來病原菌[21]，這種細胞特性導(dǎo)致感染早期中顆粒和大顆粒細胞數(shù)量急劇減少.血細胞的恢復(fù)最終主要依賴于潛在造血組織不斷地產(chǎn)生血細胞，維持循環(huán)中的血細胞穩(wěn)態(tài)[22].本研究對紅螯光殼螯蝦進行LPS刺激以模擬病原刺激，發(fā)現(xiàn)LPS刺激36 h時，小顆粒細胞的比例顯著升高，大顆粒細胞的比例顯著下降.進一步分析發(fā)現(xiàn)，LPS刺激12 h時，透明細胞和小顆粒細胞中的Ⅱ類細胞比例明顯下降，至24 h時Ⅰ類和Ⅱ類細胞比例開始顯著升高.由此認為，LPS刺激與失血刺激對螯蝦血細胞類群產(chǎn)生的影響不同，可能通過不同方式作用于血細胞的生成以及成熟.Hammond等[23]對梭子蟹進行研究，發(fā)現(xiàn)LPS注射液可以誘導(dǎo)血細胞釋放進入S期循環(huán).Van de Braak等[2]發(fā)現(xiàn)LPS刺激和重復(fù)出血可促進對蝦血淋巴細胞的釋放.Zhou等[24]研究發(fā)現(xiàn)，擬穴青蟹在溶藻弧菌和Poly（I∶C）的刺激下，透明細胞的比例顯著升高，細菌攻毒組48 h和病毒攻毒組24 h、96 h時半顆粒細胞的比例顯著下降，推測不同病原刺激會引起不同血細胞類群的變化，可能跟各血細胞類群在防御不同病原體感染方面發(fā)揮著不同作用有關(guān).

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)紅螯光殼螯蝦造血組織細胞無論失血與否一直處于活躍的增殖狀態(tài)；中顆粒和大顆粒細胞的體積比透明細胞和小顆粒細胞的體積大，同種類型血細胞體積也存在差異，表明螯蝦血細胞在血淋巴中可能存在由小到大的“成長”.失血刺激12 h時發(fā)現(xiàn)有較小的新生血細胞釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，推測為前血細胞.LPS刺激12 h時發(fā)現(xiàn)，透明細胞和小顆粒細胞中Ⅱ類細胞的比例顯著下降；至24 h時，Ⅰ類和Ⅱ類細胞比例開始顯著增多.由此可知，失血刺激和LPS刺激對血細胞生成具有不同的促進作用，可能通過不同的作用方式調(diào)控造血.這些結(jié)果為甲殼動物血細胞生成及其他相關(guān)研究提供了一定的理論依據(jù).