PLL-USPION-PMSCs分子探針靶向探測結直腸癌的MRI在體示蹤研究

何花，王芳，王一帆，郭玉林*

1.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院放射科，寧夏 銀川 750004；2.中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，四川 成都 610000； *通信作者 郭玉林 guoyulin66@163.com

結直腸癌是全球最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，早期有效的診斷和及時的根治性治療是延長患者生存期的唯一方法。目前對于結直腸癌的發(fā)病機制已深入至分子水平。間充質干細胞是具有多向分化潛能的成體干細胞，可以靶向遷移到受損組織、炎癥區(qū)域及腫瘤部位[1-2]，目前在骨關節(jié)炎、股骨頭壞死、燒傷組織的修復、腫瘤血管生成等方面的研究均取得了突破性的進展[3-6]，但在大多數(shù)研究中，間充質干細胞來源于骨髓。本研究采用人胎盤間充質干細胞（placental mesenchymal stem cells，PMSCs）對結直腸癌的作用進行研究，胎盤組織作為胎兒附屬物，來源豐富，無倫理限制，可以在臨床研究中得到廣泛應用。MRI組織分辨率高，在進行多參數(shù)、多序列成像的同時可獲得清晰的解剖結構及生理動態(tài)變化信息，是臨床診斷結直腸癌的重要途徑[7-9]。本研究利用多聚賴氨酸-超微、超順磁氧化納米鐵顆粒蛋白復合物-人胎盤間充質干細胞（polylysine-ultramicro and superparamagnetic oxide nano-iron particle protein complexes and human PMSCs，PLL-USPION-PMSCs）分子探針靶向結直腸癌小鼠模型，活體動態(tài)觀察其行分子成像的可行性，通過監(jiān)測移植瘤內信號和成像參數(shù)的變化，以病理及免疫組化結果為標準，進行PMSCs與結直腸癌的相關研究。

1 材料與方法

1.1 PLL-USPION-PMSCs分子探針的構建 培養(yǎng)第3代人PMSCs（寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院干細胞研究所贈予），調整細胞濃度為3×106個/ml，PBS中檢測細胞表面標志物的陽性表達率。將USPION與PLL按1∶0.03的體積形成PLL-USPION復合物后對PMSCs進行磁化標記，檢測標記后的細胞生物學特性：標記率測定（鐵標記率=藍染細胞數(shù)/鏡下細胞總數(shù)×100%）、以臺盼藍拒染率計算細胞活力、CCK-8試劑盒判斷細胞增殖能力、采用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測細胞凋亡率。

1.2 BALB/c裸鼠移植瘤模型建立及分組 選取20只4～6周齡健康雌性BALB/c裸鼠[購于北京維通利華公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006]，飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學動物中心SPF級實驗室，體重18～22 g。PBS重懸HT-29細胞（人結直腸癌細胞，購于上海漢恒生物，細胞濃度約1×107個/ml），以100 μl/只接種于裸鼠右側腹股溝皮下，約14 d后待腫瘤直徑約5 mm時開始實驗。將小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組10只，將重懸磁化標記后的PMSCs（細胞濃度5×106個/ml），以200 μl/只注入實驗組荷瘤小鼠瘤內，以同樣方法在對照組荷瘤小鼠瘤內注入200 μl不含細胞的PBS，觀察兩組裸鼠精神狀態(tài)與移植瘤生長狀況。本研究經過寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批準號：2015-015）。

1.3 移植瘤模型活體MR分子成像及圖像分析 小鼠麻醉后按標準姿勢置于動物線圈，使裸鼠移植瘤中心、線圈中心及磁場中心保持一致，掃描前通過VIP3000麻醉機以6.0 ml/h異氟烷對小鼠進行誘導麻醉，進入深度麻醉狀態(tài)時以2.25 ml/h進行持續(xù)麻醉，采用Philips公司3.0T MR儀、小動物線圈進行掃描。掃描序列：T2WI、T2mapping、T2*mapping，軸位掃描，層厚2 mm，層間距0.2 mm。T2WI：TR 2 000 ms，TE 140 ms，回波鏈長15，翻轉角150°，視野 35 mm×35 mm，采集矩陣176×176；T2 mapping：TR 2 000ms，TE n*13 ms，分別為13、26、39、52、65、78 ms 6個回波，翻轉角90°，視野50 mm×50 mm，采集矩陣124×124；T2*mapping：TR 28 ms，TE n*3 ms，分別為3、8、12、16、20、24 ms 6個回波，翻轉角20°，視野30 mm×30 mm，矩陣100×96。分別于注射PMSCs前、注射PMSCs后1、3、7、10、14 d進行3.0T MRI，觀察移植瘤內PMSCs的信號分布、變化特征，測量實驗組與對照組腫瘤的大?。洪L徑（a）、短徑（b），計算腫瘤體積：V=1/2ab2，繪制生長曲線。

1.4 病理組織標本獲取及免疫組化染色 注射PMSCs后2 d隨機處死實驗組和對照組小鼠各2只用于普魯士藍染色，其余小鼠均在注射后14 d行MR掃描后斷頸處死，完整切除小鼠結直腸癌瘤體后稱重，計算抑制率，抑制率=（A-B）/A×100%（A為對照組平均瘤重，B為實驗組平均瘤重），抑制率為正值表示抑制腫瘤生長，負值表示促進腫瘤生長。免疫組化染色按說明書進行操作。CD31工作液濃度為1∶100，CD34為即用型抗體，分別計數(shù)血管內皮（CD31、CD34）標記指數(shù)，參照Weidner校正方法計算微血管密度。

1.5 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 23.0軟件，符合正態(tài)分布的計量資料采用±s表示，兩組間不同時間點移植瘤體積比較采用重復測量的方差分析；同一時間點兩組間移植瘤MRI定量參數(shù)、兩組血管數(shù)量比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 注射PMSCs后移植瘤MRI信號變化 移植瘤在實驗組和對照組T2WI、T2mapping、T2*mapping序列均呈高信號。實驗組：注射PMSCs后1 d T2WI、T2 mapping、T2*mapping序列移植瘤邊緣均可見條形低信號區(qū)；3 d腫瘤區(qū)低信號較1 d逐漸增多，并有向病灶中心趨化的現(xiàn)象，腫瘤組織信號減低，T2值、T2*值較1 d減低；7 d腫瘤區(qū)低信號較3 d繼續(xù)增多，并有向病灶中心趨化的現(xiàn)象（圖1A～C），腫瘤組織信號變化不明顯，T2、T2*值最低；10 d部分小鼠腫瘤內低信號區(qū)已顯示不清，腫瘤信號變化不明顯，T2、T2*值升高；14 d所有小鼠腫瘤內低信號區(qū)基本消失，并出現(xiàn)液化、壞死區(qū)，T2、T2*值變化不明顯。對照組：1～10 d腫瘤組織內T2、T2*值逐漸升高，3 d腫瘤組織T2、T2*值的變化率最明顯，7～10 d變化率減低，14 d腫瘤組織T2、T2*值減低，對照組1～10 d腫瘤呈高信號，T2、T2*值逐漸升高，14 d腫瘤中心出現(xiàn)液化、壞死區(qū)，T2、T2*值略減低，兩組T2、T2*值差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1。

圖1 結直腸癌移植瘤裸鼠模型不同序列、不同時間點的MRI圖像。由上往下分別為T2WI、T2 mapping和T2*mapping序列，A～C分別為實驗組注射PMSCs后第1、7、14 d掃描圖像，D～F為對照組第1、7、14 d掃描圖像；箭示移植瘤內磁化標記的PMSCs信號

表1 注射PMSCs后兩組不同序列不同時間點MRI定量參數(shù)比較（±s）

表1 注射PMSCs后兩組不同序列不同時間點MRI定量參數(shù)比較（±s）

分組序列1 d 3 d 7 d 10 d 14 d F值P值實驗組（n=10） T2 62.085±2.007 54.785±1.529 72.785±1.529 82.785±1.529 76.785±1.529 24.472 0.000對照組（n=10） 60.085±2.813 72.239±1.259 85.907±4.764 89.910±1.042 90.573±3.999實驗組（n=10）80.578±6.347 72.797±3.021 88.797±5.021 94.533±4.021 84.797±2.021對照組（n=10）T2*84.352±3.162 92.441±2.196 106.547±3.203 110.329±1.103 111.711±4.445 8.963 0.010

2.2 腫瘤體積及重量比較 實驗組小鼠注射PMSCs前到注射PMSCs后第14 d生長趨勢與對照組相似，1～7 d實驗組平均體積大于對照組（表2），3～7 d實驗組與對照組體積差距減小，生長速度減慢，1～14 d實驗組腫瘤體積小于對照組（表3），兩組體積差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），抑瘤率為10.2%。

表2 注射PMSCs后第1～7 d同一時間點兩組腫瘤體積變化比較（mm3，±s）

表2 注射PMSCs后第1～7 d同一時間點兩組腫瘤體積變化比較（mm3，±s）

掃描時間實驗組（n=10）對照組（n=10）t值P值1 d 5.58±1.08 5.24±1.12 3.287 0.004 0.000 7 d 6.77±1.04 6.70±1.03 0.695 0.506 3 d 6.34±1.04 5.61±1.03 7.513

表3 注射PMSCs后不同時間點兩組腫瘤體積變化比較（mm3，±s）

表3 注射PMSCs后不同時間點兩組腫瘤體積變化比較（mm3，±s）

分組1 d 3 d 7 d 10 d 14 d F值P值實驗組（n=10） 5.58±1.08 6.34±1.04 6.77±1.04 6.93±1.06 7.98±1.05 4.320 0.030對照組（n=10）5.24±1.12 5.61±1.03 6.70±1.03 7.85±1.04 9.15±1.05

2.3 相關病理指標結果 注射PMSCs次日取材行普魯士藍染色，實驗組紅色腫瘤組織邊緣區(qū)域可見藍染顆粒；HE染色后均發(fā)現(xiàn)移植瘤新生血管豐富，呈棕褐色條索狀，且微血管密度分布不均勻，腫瘤間質內微血管密度的形態(tài)及大小差異較大，血管間可見灶性壞死、凋亡，凋亡區(qū)部分血管輪廓破壞。免疫組化顯示兩組移植瘤內均見大量CD31、CD34陽性細胞分布（圖2），按照Weidner的判斷標準計數(shù)，實驗組CD31、CD34分別為35.0±5.7、38.0±4.5，對照組分別為32.0±4.3、

圖2 對照組與實驗組普魯士藍（A、E，×200）、HE（B、F，×40）、CD31（C、G，×40）、CD34（D、H，×40）染色結果。A～D為實驗組；E～H為對照組

35.0±2.6，兩組血管數(shù)量差異均無統(tǒng)計學意義（t=0.245、0.270，P＞0.05）。

3 討論

3.1 PLL-USPION-PMSCs分子探針在結直腸癌移植瘤中的MRI分析 MRI具有組織分辨率高、可以多參數(shù)、多序列成像的優(yōu)點，同時可以獲得清晰的解剖結構及生理動態(tài)變化信息，作為研究組織生化狀態(tài)的一項新技術，可為活體狀態(tài)下研究疾病分子機制提供有力支持[10-11]。由于USPION標記細胞后對T1弛豫影響較小，因此在目前以氧化鐵為基礎的分子探針MRI中，國內外學者普遍選擇T2WI、T2 mapping、T2*mapping序列，并且T2*值可以更加敏感地反映組織內磁敏感性的改變。T2 mapping與T2*mapping技術通過回波-信號曲線擬合形成偽彩圖實現(xiàn)組織中鐵顆粒的量化，可以間接反映組織內含鐵濃度[12-13]。同時，本課題組前期研究[14]顯示，在MRI對USPION磁化標記PMSCs的示蹤中，T2*mapping序列總體圖像質量較高，且圖像的信噪比、標記細胞與腫瘤的組織對比度、圖像對比度最高，在鐵標記細胞的示蹤研究中比T2WI、T2mapping序列更優(yōu)越。

本研究顯示實驗組1 d T2WI、T2mapping、T2*mapping序列移植瘤邊緣均可見條形低信號區(qū)，即為磁化標記的PMSCs；注射3 d腫瘤區(qū)低信號較1 d逐漸增多，并有向病灶中心趨化的現(xiàn)象。大量研究證實MRI圖像中局部降低的信號區(qū)95%以上來自標記細胞[15]，當標記細胞被巨噬細胞吞噬后，其內的鐵顆粒會迅速代謝，不會影響標記細胞呈低信號的特異性顯示。因此本研究中實驗組MRI圖像移植瘤內低信號區(qū)即為USPION標記后的PMSCs。目前部分研究[2,16]顯示間充質干細胞特異性地歸巢至組織損傷部位的

機制與白細胞向炎性組織歸巢的過程類似，即腫瘤在

生長過程中會分泌趨化因子、黏附分子、生長因子和

酶等物質，這些物質作為配體與間充質干細胞上的相應受體特異性結合后具有驅動間充質干細胞歸巢的作用。本研究中實驗組注射PMSCs后1～3 d腫瘤組織信號減低，且T2、T2*值減低，表明在結直腸癌移植瘤中PMSCs有向腫瘤組織歸巢的趨勢，因此腫瘤組織信號會隨時間增加逐漸降低。注射7 d腫瘤組織信號變化不明顯，T2、T2*值最低；注射10 d部分小鼠腫瘤內低信號區(qū)已顯示不清，腫瘤信號變化不明顯，T2、T2*值升高；注射14 d所有小鼠腫瘤內低信號區(qū)基本消失，并出現(xiàn)液化、壞死區(qū)，腫瘤組織內T2、T2*值變化不明顯表明PMSCs在7 d開始逐漸代謝，14 d基本代謝完全。

3.2 腫瘤體積及重量分析 實驗組小鼠MRI動態(tài)觀察期間移植瘤生長趨勢與對照組相似，觀察前期實驗組平均體積大于對照組，之后兩組移植瘤體積差距減小，生長速度減慢，最終實驗組腫瘤體積小于對照組，兩組體積有顯著差異，抑瘤率為正值，表明PMSCs在注入結直腸癌移植瘤前期起到了促進作用，隨著時間的推移其對腫瘤的抑制作用逐漸展現(xiàn)。抑瘤率為正值提示PMSCs對結直腸癌移植瘤最終作用為抑制。這也表明PMSCs對結直腸癌的促進或抑制作用是動態(tài)變化的。

3.3 相關病理指標分析 近年來，相關研究表明腫瘤生長必需營養(yǎng)物質的供給依賴于腫瘤血管生成，微血管密度可作為判定腫瘤預后的一項獨立指標，已在乳腺癌、大腸癌、胃癌等惡性腫瘤中得到證實[17-19]。CD31為血小板-內皮細胞黏附分子，位于血管內皮細胞、巨噬細胞、血小板等表面，促使腫瘤細胞對內皮細胞的黏附，它通常表達在幼稚血管，在細胞質或細胞膜表達陽性，隨著腫瘤內新生毛細血管的增加，CD31表達增高。CD34為高度糖基化的跨膜糖蛋白，作為創(chuàng)傷愈合、免疫應答、炎癥反應及腫瘤轉移等一系列病理生理過程的分子基礎，是重復性好、穩(wěn)定性高、較成熟的血管內皮標志物，作為常規(guī)指標應用于多種惡性腫瘤的免疫組化檢測，因此本實驗選取CD31、CD34標記結直腸癌組織。本實驗按照Weidner的判斷標準計數(shù)兩組移植瘤微血管密度，血管數(shù)量未見明顯差異，無法明確體現(xiàn)PMSCs對結直腸移植瘤血管生成的作用。分析其原因可能為：HT-29惡性程度較高，增殖能力較強，代謝較快，可能在PMSCs發(fā)揮

有效作用前，腫瘤即已廣泛侵襲、壞死；或是PMSCs

在較短時間內已經被腫瘤代謝并排出體外。部分研究

顯示腫瘤的高度血管化發(fā)生于早期，進而達到高峰，然后維持新的血管形成，說明腫瘤血管生成與腫瘤分級及臨床分期密切相關，本實驗中未進行明確的分級及分期也可能是造成陰性結果的一種因素。

總之，3.0T MRI可安全、有效地實現(xiàn)PLL-USPIONPMSCs對結直腸癌移植瘤的分子靶向成像，PMSCs對結直腸癌有定向趨化作用，可以聚集至腫瘤內，MRI中T2mapping和T2*mapping序列可以較好地觀察、分析磁性標記后的PMSCs的遷徙、轉歸以及對移植瘤的影響，結合腫瘤組織病理切片及免疫組化結果初步得出PMSCs對結直腸癌的作用是動態(tài)變化的，不同時期促進和抑制腫瘤生長相互交叉作用，最終抑制腫瘤生長。