高強(qiáng)度聚焦超聲消融不同范圍兔VX2乳腺癌的效應(yīng)及轉(zhuǎn)歸實(shí)驗(yàn)研究

馮瀟鈴，王琦，楊敏，廖洪建，張志飛，杜永洪

超聲醫(yī)學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，重慶市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；*通信作者 杜永洪 duyonghong@cqmu.edu.cn

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高，死亡率增長快，目前居全球癌癥第1位[1]。常規(guī)乳房切除術(shù)創(chuàng)面較大，乳房外形受損嚴(yán)重，極大地降低了患者的生活質(zhì)量[2]。高強(qiáng)度聚焦超聲（high intensity focused ultrasound，HIFU）是一種無創(chuàng)治療腫瘤的綜合治療方式[3-4]，其治療實(shí)體性腫瘤按照外科原則從體外全覆蓋、超范圍切除體內(nèi)腫瘤病灶，對于部分因腫瘤體積大、侵犯重要血管或器官而失去外科手術(shù)機(jī)會的患者，能從體外原位殺滅體內(nèi)腫瘤細(xì)胞、減輕晚期腫瘤疼痛。HIFU技術(shù)通過結(jié)合藥物化療等綜合治療方式能有效延長患者的生存時間、提高其生活質(zhì)量[5-6]。

由于乳腺位置表淺，體積較大的乳腺腫瘤進(jìn)行HIFU完全消融時需要較大的超聲能量，長時間輻照易導(dǎo)致患者不耐受或皮膚燒傷、水腫等[7]。此外，因高齡、晚期乳腺癌患者耐受性差及治療部位的特殊性，HIFU治療存在不完全消融腫瘤的可能性或臨床需求。本研究在超聲監(jiān)控下，通過HIFU消融不同范圍兔VX2乳腺癌模型，開展生物學(xué)效應(yīng)及轉(zhuǎn)歸等基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，比較機(jī)體免疫轉(zhuǎn)歸效應(yīng)，探索HIFU不完全消融可能引發(fā)的凋亡或免疫機(jī)制，有望為臨床上耐受性差或治療部位特殊的晚期乳腺癌患者提供HIFU不全消融基礎(chǔ)理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器 健康雌性新西蘭兔（4～6周，2.0～2.5 kg）購自重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，VX2種兔由超聲醫(yī)學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，TUNEL試劑盒（碧云天C1086），增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）鼠抗兔多克隆抗體（博士德生物科技股份有限公司），小鼠Ig-G二步法免疫組化試劑盒（四正柏科技股份公司），ELISA試劑盒（博士德生物科技股份有限公司），聚焦超聲腫瘤治療系統(tǒng)（JC200型，重慶海扶醫(yī)療科技股份有限公司，HIFU治療頭頻率1.03 MHz，直徑158 mm），超聲診斷系統(tǒng)（MyLab Class C Advanced），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 兔VX2乳腺癌模型建立 采用包埋法建立兔VX2乳腺癌模型，于無菌條件下采用外科手術(shù)方式從VX2種兔保種處取長勢良好、無壞死的魚肉樣腫瘤組織，切成1 mm3大小的腫瘤塊，將其植入兔左側(cè)第二對乳腺內(nèi)，待腫瘤直徑長至1.5 cm左右，通過超聲以及病理學(xué)HE染色觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)以驗(yàn)證是否成功建立兔VX2乳腺癌模型[8]。

1.2.2 HIFU輻照 將35只成功建立的VX2乳腺荷瘤兔隨機(jī)分為對照組（5只）和3個不同范圍HIFU消融組（50%、80%及100%組，每組10只）。實(shí)驗(yàn)兔術(shù)前禁食、禁水并腹部脫毛，術(shù)前5 min經(jīng)耳緣靜脈麻醉后將其固定于治療臺上，使腫瘤部位完全浸入脫氣水，使用機(jī)載超聲對兔VX2乳腺腫瘤進(jìn)行定位，并根據(jù)不同的消融范圍制訂相應(yīng)治療計(jì)劃（50%、80%及100%），勾畫出預(yù)消融范圍。JC200型聚焦超聲腫瘤治療系統(tǒng)以“點(diǎn)-線-面-體”的輻照方式對腫瘤進(jìn)行消融，超聲治療頭從腫瘤中心逐漸往邊緣移動輻照，直至覆蓋設(shè)定范圍內(nèi)的腫瘤。各組HIFU輻照參數(shù)一致，每只荷瘤兔每cm3的輻照劑量相同，僅消融范圍不同。

1.2.3 腫瘤消融體積測量 采集各組輻照前腫瘤區(qū)、輻照后損傷靶區(qū)的超聲圖像，使用軟件Microsea HIFU Measurement Software 1.0測量各組輻照前的腫瘤區(qū)近似體積及輻照后的強(qiáng)回聲靶區(qū)近似體積，計(jì)算腫瘤消融率；然后通過腫瘤解剖學(xué)觀察并測量實(shí)際消融體積，于術(shù)后即刻各組隨機(jī)處死3只瘤兔解剖取材，將腫瘤沿聲束軸方向最大剖面切開后，使用軟件測量出各組HIFU消融前腫瘤體積與消融后靶區(qū)的凝固性壞死體積，計(jì)算各組腫瘤消融率。從兩方面共同佐證HIFU不完全消融模型是否成功建立。

1.2.4 HE及免疫組化染色 HIFU消融14 d后各組隨機(jī)處死3只瘤兔，取完整腫瘤組織，沿超聲束入射方向從腫瘤中央切開腫瘤，每個腫瘤組織均選擇最大徑面（此處切片面積最大，體積具有代表性）制作組織切片。組織于多聚甲醛固定、石蠟包埋后制成石蠟切片，切片一部分行HE染色，觀察消融后腫瘤組織的結(jié)構(gòu)損傷及存活區(qū)域組織的病理學(xué)改變；另一部分行免疫組化PCNA及TUNEL染色，觀察各組腫瘤細(xì)胞凋亡及增殖情況，以視野出現(xiàn)棕黃色或棕褐色細(xì)胞核顆粒為陽性標(biāo)志。

1.2.5 腫瘤抑制情況觀察 HIFU消融后觀察各組荷瘤兔的自然生存時間，于術(shù)后14 d測量各組腫瘤長徑、短徑，計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積=（長徑×短徑2）/2。

1.2.6 ELISA檢測血漿中免疫抑制因子表達(dá) 各組于HIFU術(shù)前、術(shù)后3、7、14 d采集兔耳緣靜脈血，3 000 r/min離心5 min后收集上清備用。將稀釋處理好的樣本加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，按照ELISA操作法進(jìn)行孵育顯色，最后使用酶標(biāo)儀檢測其OD值以檢測血漿中IL-2R及TGF-β1的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素或雙因素（組別×?xí)r間）方差分析，采用Turkey或Sidak進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔VX2乳腺癌模型建立 建模后第14天即可于兔左側(cè)第二對乳頭處捫及一形狀規(guī)則、大小均勻的球形腫塊，經(jīng)游標(biāo)卡尺測得腫瘤平均大小為（1.63±0.46）cm3（圖1A）。超聲聲像圖見一均質(zhì)的低回聲球形團(tuán)塊，邊界清晰，可見明顯血流信號（圖1B）。HE染色顯示腫瘤細(xì)胞形態(tài)、大小各異，核仁肥大且數(shù)量較多，染色濃淡不均，間質(zhì)內(nèi)可見淋巴細(xì)胞浸潤，具有腫瘤細(xì)胞的異型性表現(xiàn)（圖1C）。

圖1 兔VX2乳腺癌模型驗(yàn)證。A.建模第14天腫瘤組織外觀；B.超聲聲像圖見腫瘤內(nèi)部有明顯血流信號；C.HE染色（×200）見大小各異、排列緊密的腫瘤細(xì)胞

2.2 HIFU消融不同范圍兔VX2乳腺癌前后超聲表現(xiàn)HIFU消融后腫瘤靶區(qū)可見明顯超聲回聲增強(qiáng)（圖2），3個消融組腫瘤區(qū)和消融靶區(qū)的超聲聲像圖和解剖腫瘤測量體積比較見表1。各組由超聲聲像圖測得的體積比與通過解剖腫瘤體積和凝固性壞死區(qū)測量的結(jié)果一致，兩種方式測得的腫瘤消融率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（50%、80%、100%組對應(yīng)的F值分別為2.46、1.00、1.28，均P＞0.05）。

圖2 HIFU消融不同范圍兔VX2乳腺腫瘤前后各組超聲聲像圖。A、B：50%消融組，C、D：80%消融組；E、F：100%消融組，其中A、C、E為HIFU輻照前，腫瘤邊界清晰，表現(xiàn)為低回聲，紅色圓圈示腫瘤區(qū)；B、D、F為HIFU輻照后，消融靶區(qū)出現(xiàn)明顯灰度增強(qiáng)，表現(xiàn)為強(qiáng)回聲，紅色圓圈示消融靶區(qū)

表1 HIFU消融不同范圍兔VX2腫瘤組織后超聲及解剖學(xué)測量腫瘤消融率比較（±s）

表1 HIFU消融不同范圍兔VX2腫瘤組織后超聲及解剖學(xué)測量腫瘤消融率比較（±s）

組別例數(shù)超聲聲像圖觀察腫瘤組織解剖學(xué)觀察輻照前靶區(qū)體積（cm3）輻照后強(qiáng)回聲區(qū)體積（cm3）消融率（%）輻照前腫瘤體積（cm3）輻照后損傷體積（cm3）消融率（%）50%消融組 10 1.58±0.15 0.83±0.04 52.67±0.15 1.77±0.13 0.94±0.13 53.24±0.07 80.43±0.13 100%消融組 10 1.64±0.17 1.66±0.08 100.32±0.15 1.83±0.37 1.84±0.49 100.38±0.17 80%消融組10 1.63±0.19 1.31±0.14 80.32±0.12 1.76±0.15 1.42±0.53

2.3 HIFU消融不同范圍兔VX2乳腺癌后HE染色表現(xiàn)光鏡下顯示對照組腫瘤細(xì)胞排列緊密，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，染色均勻；各消融組腫瘤區(qū)均見不同范圍的凝固性壞死表現(xiàn)，靶區(qū)與周圍區(qū)見明顯交界。50%消融組中央靶區(qū)表現(xiàn)為大片凝固性壞死，周圍仍有大面積活性腫瘤細(xì)胞存在；80%消融組除中心靶區(qū)的凝固性壞死外，其交界區(qū)細(xì)胞質(zhì)均質(zhì)紅染，部分呈空泡樣變性，且出現(xiàn)大量的細(xì)胞核固縮裂解、核溶解以及大片的紅染無結(jié)構(gòu)區(qū)域；100%消融組腫瘤區(qū)全部呈凝固性壞死表現(xiàn)，周圍無殘瘤組織存在（圖3）。

圖3 HIFU消融不同范圍兔VX2乳腺腫瘤后14 d各組腫瘤組織HE染色（×200）。A：對照組；B：50%消融組；C：80%消融組；D：100%消融組；各消融組靶區(qū)可見不同程度的細(xì)胞損傷，細(xì)胞核固縮、彌散、細(xì)胞間隙擴(kuò)大，細(xì)胞結(jié)構(gòu)喪失等，對照組可見細(xì)胞排列緊密、結(jié)構(gòu)正常；箭示HIFU消融靶區(qū)

2.4 HIFU消融不同范圍兔VX2乳腺癌后免疫組化染色表現(xiàn) 光鏡下可見各消融組均出現(xiàn)陽性染色的凋亡及增殖細(xì)胞（圖4）。其中80%消融組PCNA陽性最少，TUNEL陽性細(xì)胞最明顯，PCNA及TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢均具有一致性。

圖4 HIFU消融不同范圍兔VX2乳腺腫瘤后14 d各組腫瘤組織PCNA、TUNEL染色（×200）。A～D：PCNA染色，棕黃染色為陽性表達(dá)，棕黃色越多表明細(xì)胞增殖越強(qiáng)；E～H：TUNEL染色，棕黃色越多表明細(xì)胞凋亡越明顯；從左到右依次為對照組、50%消融組、80%消融組及100%消融組

2.5 HIFU消融不同范圍兔VX2乳腺癌后抑瘤能力評價HIFU消融兔VX2乳腺癌后14 d，100%消融組腫瘤組織全部發(fā)生凝固性壞死，壞死區(qū)腫瘤至28～35 d全部吸收；80%消融組的殘瘤病灶在HIFU消融后引發(fā)細(xì)胞凋亡，在消融后14 d可見80%及100%消融組腫瘤體積減小，均明顯小于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001）。50%消融組殘瘤面積較大，在消融后其腫瘤體積隨時間呈增大趨勢，至消融后14 d逐漸接近對照組，且與80%、100%消融組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001）。各消融組同對照組相比生存期明顯延長，其中100%及80%消融組的生存期遠(yuǎn)長于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），50%消融組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.2957），見表2。

表2 HIFU消融不同范圍兔VX2乳腺腫瘤后14 d各組抑瘤效果評價及生存時間比較（±s）

表2 HIFU消融不同范圍兔VX2乳腺腫瘤后14 d各組抑瘤效果評價及生存時間比較（±s）

注：80%、100%消融組與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故僅比較其與50%組的差異；a與50%消融組相比，P＜0.0001；b與50%消融組相比，P＜0.05

組別例數(shù)腫瘤體積（cm3）生存時間（d）對照組 5 4.69±0.33 38.33±4.04 50%消融組47.67±5.03 80%消融組 10 0.88±0.09a 79.40±10.50b 10 3.53±0.29 100%消融組10 0.49±0.10a 90.67±4.16b F值 233.2 44.22 P值＜0.0001＜0.0001

2.6 HIFU消融不同范圍兔VX2乳腺癌后ELISA染色結(jié)果 HIFU消融兔VX2乳腺腫瘤后，80%及100%消融組的IL-2R及TGF-β1表達(dá)持續(xù)降低。對于IL-2R可觀察到組別×?xí)r間交互作用顯著（F=35.31，P＜0.001），見圖5A，在HIFU消融后第14天，80%與100%消融組的IL-2R水平較對照組及50%消融組明顯降低。對于TGF-β1也可觀察到顯著的組別×?xí)r間交互作用（F=79.82，P＜0.001），其在80%及100%消融組表達(dá)水平的下降趨勢同IL-2R變化一致（圖5B），而80%及100%消融組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖5 HIFU消融不同范圍兔VX2乳腺癌模型后14 d各組血漿腫瘤抑制因子ELISA結(jié)果。A：IL-2R表達(dá)水平；B：TGF-β1表達(dá)水平；* P＜0.05，** P＜0.001

3 討論

3.1 HIFU技術(shù) HIFU技術(shù)利用超聲波的方向性、組織穿透性及可聚焦性，從體外精準(zhǔn)、高效地消融體內(nèi)實(shí)體腫瘤，目前已有大量研究證實(shí)其應(yīng)用于骨腫瘤、乳腺癌等臨床治療療效顯著[9-11]。牛陵川等[12]通過基礎(chǔ)研究證實(shí)HIFU輻照兔VX2乳腺癌腫瘤后，能有效抑制殘留兔VX2乳腺癌腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，延長荷瘤兔的生存時間，且有研究報(bào)道[13]當(dāng)免疫佐劑聯(lián)合HIFU局部消融時可刺激機(jī)體免疫效應(yīng)，明顯降低腫瘤轉(zhuǎn)移率。

對臨床上因腫瘤較大無法一次性完成消融或因皮膚破潰而不具備HIFU全消融條件的乳腺癌患者，采用HIFU不完全消融結(jié)合藥物化療等治療方式，有望為其提供無手術(shù)創(chuàng)傷、低劑量化療副作用小的綜合治療方案[14]。本文旨在為HIFU不完全消融技術(shù)的臨床應(yīng)用提供不同范圍消融腫瘤后機(jī)體的免疫轉(zhuǎn)歸效應(yīng)等實(shí)驗(yàn)研究理論基礎(chǔ)。

3.2 超聲聲像圖監(jiān)控實(shí)現(xiàn)HIFU消融不同范圍兔VX2乳腺腫瘤 影像學(xué)監(jiān)控是HIFU消融治療中非常重要的環(huán)節(jié)之一，HIFU主要通過影像學(xué)監(jiān)控手段實(shí)現(xiàn)對腫瘤不同范圍的消融，超聲圖像的灰度變化可以很好地反映出腫瘤消融范圍及腫瘤損傷情況，腫瘤診斷及治療實(shí)施均通過超聲監(jiān)控實(shí)現(xiàn)[15]。本研究在超聲聲像圖引導(dǎo)下對兔VX2乳腺腫瘤實(shí)施不同范圍的HIFU消融，且發(fā)現(xiàn)通過超聲聲像圖測得的腫瘤消融率與腫瘤解剖學(xué)測量的結(jié)果一致，為在超聲聲像圖監(jiān)控下行HIFU消融不同范圍兔VX2乳腺腫瘤的可行性提供了數(shù)據(jù)支持。

3.3 HIFU不完全消融可改善預(yù)后并激活機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答 HIFU局部消融腫瘤會出現(xiàn)不同的轉(zhuǎn)歸[16]，PCNA僅在增殖細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，是評價細(xì)胞增殖狀態(tài)、判斷腫瘤惡性潛能的一個重要指標(biāo)，其聯(lián)合TUNEL凋亡檢測用于HIFU消融腫瘤后的轉(zhuǎn)歸評價。本研究HE染色及免疫組化結(jié)果顯示，各HIFU消融組在消融后對腫瘤組織的損傷僅表現(xiàn)為腫瘤損傷范圍不同，而消融后殘瘤腫瘤組織的轉(zhuǎn)歸才是導(dǎo)致HIFU不同范圍消融腫瘤發(fā)生不同預(yù)后的原因：100%消融組腫瘤全部凝固性壞死，隨時間進(jìn)展腫瘤逐漸全部吸收；80%消融組雖仍有部分殘瘤腫瘤存在，但其周圍存活病灶會在HIFU消融后引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖從而起到抑制腫瘤生長的目的；50%消融組由于殘瘤面積較大、細(xì)胞凋亡作用不明顯，腫瘤細(xì)胞仍持續(xù)性增殖導(dǎo)致腫瘤繼續(xù)生長，可能與HIFU不完全消融可能激活的機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答相關(guān)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證HIFU不同范圍消融對機(jī)體免疫功能的影響，本研究通過ELISA檢測各組腫瘤免疫抑制因子IL-2R及TGF-β1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示80%及100%消融組的IL-2R及TGF-β1水平明顯下調(diào)，證實(shí)了HIFU消融范圍達(dá)80%時可有效增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫，抑制腫瘤生長，其機(jī)制可能為：①HIFU主要依靠熱效應(yīng)損傷腫瘤組織，80%消融組在長時間的HIFU輻照下增加了能量沉積，能量除作用于靶區(qū)外，也因熱傳遞對周圍腫瘤產(chǎn)生損傷并誘發(fā)周圍殘瘤細(xì)胞凋亡[17-18]。②HIFU消融后靶區(qū)腫瘤細(xì)胞被破壞釋放出大量蛋白碎片及抗原，引起多種細(xì)胞因子釋放、腫瘤抑制因子減少，從而誘導(dǎo)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移[19-20]。而50%消融不能有效抑制腫瘤生長，反而出現(xiàn)促進(jìn)腫瘤發(fā)展的趨勢，可能是由于損傷組織較小，未有足夠免疫原性物質(zhì)產(chǎn)生；或是因?yàn)閴乃澜M織位于病變中心，產(chǎn)生的免疫原性物質(zhì)無法入血刺激機(jī)體免疫所致。

3.4 不足與展望 本文通過研究HIFU消融不同范圍兔VX2乳腺癌模型后的生物學(xué)效應(yīng)及機(jī)體免疫改變等，有望為耐受性差或治療部位特殊的晚期乳腺癌患者提供HIFU不全消融基礎(chǔ)理論參考。但本實(shí)驗(yàn)僅驗(yàn)證了HIFU不完全消融兔VX2乳腺癌的短期治療效果，其對兔VX2乳腺癌腫瘤的長期抑制作用及抗腫瘤免疫應(yīng)答等機(jī)制研究尚需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探索。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突