光譜CT量化的細胞外容積評估結(jié)直腸癌神經(jīng)、血管及淋巴管浸潤

鄭文霞，王莉莉，陳杏彪，鄭小霞，崔雅瓊，馬穎，魏照坤，梁小芹，黃剛*

1.甘肅中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院放射科，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省人民醫(yī)院病理科，甘肅 蘭州 730000；4.飛利浦醫(yī)療臨床科研部，上海 200070；*通信作者 黃剛 keen0999@163.com

近年來，隨著生活習慣及飲食結(jié)構的變化，結(jié)直腸癌的發(fā)病率居高不下，且發(fā)病年齡逐漸年輕化[1]。結(jié)直腸癌的早期精準診斷有助于使患者得到早期臨床干預，能夠最大程度地降低疾病帶來的生理損傷。雙層探測器光譜CT是新型的基于探測器的能譜CT，一次掃描即可獲得高低能量數(shù)據(jù)，能夠比常規(guī)CT提供更多的參數(shù)和圖像信息[2]，同時還可以發(fā)現(xiàn)和診斷腫瘤早期隱匿病灶[3]，為結(jié)直腸癌的影像診斷提供了新的思路和方法。相關研究表明基于光譜CT 40 keV的單能級圖像可以提高直腸癌術前T分期的準確度[4]，有利于個體化治療的決策評估。

細胞外基質(zhì)是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分[5]，細胞外容積（extracellular volume，ECV）是細胞外基質(zhì)的量化因子。目前ECV的臨床應用多集中于心臟方面，如評估心肌纖維化[6]、預測心肌梗死[7]、心肌淀粉樣變的診斷及預后[8]等，也可用于評估肝纖維化分級[9]。隨著研究者對腫瘤微環(huán)境關注度上升，ECV在腫瘤中的應用也在逐漸增加。Song等[10]在III期結(jié)直腸癌患者預后的研究中，發(fā)現(xiàn)血管、淋巴管內(nèi)癌栓的形成與免疫異質(zhì)性腫瘤微環(huán)境密切相關。而目前臨床上通常需要通過病理組織活檢獲取神經(jīng)、血管、淋巴管浸潤狀態(tài)。本研究通過使用基于雙層探測器光譜CT增強掃描測定的ECV值評估結(jié)直腸癌組織是否存在神經(jīng)、血管及淋巴管浸潤帶來的腫瘤細胞微環(huán)境改變，以期獲得一種術前評估的方法。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2020年7月—2021年2月在甘肅省人民醫(yī)院就診的95例結(jié)直腸癌患者，年齡32～84歲，平均（60.5±10.7）歲；結(jié)腸癌22例，直腸癌73例。納入標準：①首次診斷結(jié)直腸癌，無化療及手術病史；②術前行光譜CT檢查，術后病理診斷為結(jié)直腸癌。排除標準：①病理資料不全，或為腺瘤及其他良性腫瘤；②圖像有偽影不滿足測量要求。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準（2021-196），所有患者檢查前均簽署知情同意書?；颊咭话阗Y料見表1。

表1 95例結(jié)直腸癌患者一般資料

1.2 CT檢查方法 所有患者用光譜CT進行增強掃描，采用雙筒高壓注射器，從肘正中靜脈注入1.5 ml/kg碘克沙醇（320 mgI/ml），速度3.5 ml/s，隨后以相同速度注入50 ml生理鹽水。采集25 s動脈期、60～70 s靜脈期及2 min延遲期圖像。主要參數(shù)：層厚5 mm，管電壓120 kV，自動毫安秒，螺距0.953，轉(zhuǎn)速0.5 s/轉(zhuǎn)。采集后圖像利用IntelliSpace Portal 10.1后處理工作站進行數(shù)據(jù)測量。

1.3 圖像分析及數(shù)據(jù)測量 患者行光譜CT增強后選擇靜脈期及延遲期圖像，重建后的光譜基數(shù)據(jù)導入后處理工作站，測量結(jié)直腸腫瘤病變兩期的碘密度（iodine density，ID）：感興趣區(qū)選擇在腫瘤實質(zhì)區(qū)域，范圍35～55 mm2，避開非腫瘤部位、水腫區(qū)及血管偽影，測量3個不同層面感興趣區(qū)ID的平均值，并同時測量腫瘤同層面腹主動脈或髂外動脈ID的平均值。用同一方法對納入患者選擇其病變上或下5個層面的正常腸壁及血管，測量兩期的ID。計算ECV，ECV（%）=（1-紅細胞壓積）×（IDROI/IDblood）×100，其中紅細胞壓積于檢查前3 d內(nèi)采集，IDROI為腫瘤及正常腸壁的ID，IDblood為腫瘤同層面腹主動脈或髂外動脈的ID。為保證結(jié)果的可重復性，3個月后重新測量一次數(shù)據(jù)。

1.4 病理及免疫組化檢查 所有送檢組織送病理切片，病理陽性標準嚴格按照試劑說明書進行。疑有血管、淋巴管內(nèi)癌栓及神經(jīng)侵犯者行免疫組化染色，血管、淋巴管及神經(jīng)侵犯分別用CD31、D2-40、S100表示，染色后棕黃色為（+），見圖1。

圖1 血管、淋巴管內(nèi)癌栓及神經(jīng)侵犯病理免疫組化染色（20×10）。A.血管內(nèi)癌栓（箭）；B.淋巴管內(nèi)癌栓（箭）；C.神經(jīng)侵犯（+，箭）

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0軟件，符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，前后2次測量結(jié)果用組內(nèi)相關系數(shù)（ICC）檢驗。以術后病理結(jié)果為“金標準”，應用受試者工作特征曲線下面積（AUC）分析ECV的診斷效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血管、淋巴管、神經(jīng)侵犯陽性及陰性組間ECV比較 3項免疫組化陽性與陰性組的ECV在延遲期差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001），在靜脈期差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2、圖2～3。

圖2 男，50歲，直腸下段中分化腺癌，無血管、淋巴管及神經(jīng)侵犯，紅細胞壓積0.533。A.靜脈期病變常規(guī)CT圖；B.延遲期病變常規(guī)CT圖；C.靜脈期病變碘密度圖，ECV=0.23；D.延遲期病變碘密度圖，ECV=0.26

表2 靜脈期及延遲期血管、淋巴管、神經(jīng)侵犯陽性、陰性組的ECV比較

2.2 ECV對血管、淋巴管、神經(jīng)浸潤的診斷效能靜脈期、延遲期ECV對于免疫組化的AUC分別為：血管侵犯0.576、0.798，淋巴管侵犯0.575、0.838；神經(jīng)侵犯0.584、0.759，見表3、圖4A～C。

表3 ECV對血管、淋巴管、神經(jīng)侵犯的診斷效能

2.3 結(jié)直腸癌與同期正常腸壁的ECV比較 靜脈期、延遲期ECV對于結(jié)直腸癌的AUC分別為0.962、0.975，兩期結(jié)直腸癌與同期正常腸壁的ECV相比差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.001），見表4、圖3 E、F、圖4D。

圖4 ECV對結(jié)直腸癌神經(jīng)、血管、淋巴管浸潤及結(jié)直腸癌的受試者工作特征曲線。ECV-D為延遲期；ECV-V為靜脈期；A.血管侵犯；B.淋巴管侵犯；C.神經(jīng)侵犯；D.結(jié)直腸癌

表4 靜脈期、延遲期結(jié)直腸癌與同期正常腸壁ECV比較

圖3 男，60歲，直腸下段中分化腺癌，有血管、淋巴管及神經(jīng)侵犯，紅細胞壓積0.421。A.靜脈期病變常規(guī)CT圖；B.延遲期病變常規(guī)CT圖；C.靜脈期病變碘密度圖，ECV=0.23；D.延遲期病變碘密度圖，ECV=0.40；E.靜脈期正常腸壁碘密度圖，ECV=0.09；F.延遲期正常腸壁碘密度圖，ECV=0.15

2.4 一致性檢驗 結(jié)直腸癌與正常腸壁靜脈期、延遲期測量結(jié)果的一致性良好（ICC均＞0.75）。

3 討論

細胞外基質(zhì)是位于機體細胞外的生物大分子，包括膠原蛋白、蛋白多糖以及各種代謝相關的酶和細胞因子等。細胞外基質(zhì)在正常情況下抑制腫瘤生長，但在惡性腫瘤中發(fā)生變化，引起腫瘤微環(huán)境改變，在一定程度上可以反映腫瘤的演變情況[11]。腫瘤微環(huán)境是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中由細胞外基質(zhì)和基質(zhì)細胞組成的復雜系統(tǒng)，基質(zhì)細胞主要包括成纖維細胞、炎癥免疫細胞、脂肪細胞和血管內(nèi)皮細胞等，其中癌相關成纖維細胞在腫瘤生長、進展和轉(zhuǎn)移過程中起到關鍵作用。Kalluri[12]提出細胞外基質(zhì)重塑性癌相關成纖維細胞（F4型），具有重塑細胞外基質(zhì)的功能，增強了腫瘤的增殖和侵襲性。

ECV是細胞微環(huán)境中細胞外基質(zhì)占據(jù)的空間，代表細胞外基質(zhì)的體積分數(shù)，影像學檢查測得的ECV值與組織活檢測得的細胞外間質(zhì)量具有一致性[13-15]，因此可以用ECV值定量表示病變的細胞外間質(zhì)[16]。相關研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌、胸腺瘤組織的ECV與腫瘤的治療及預后相關[17-18]，本研究探討通過ECV評估結(jié)直腸癌神經(jīng)、血管及淋巴管浸潤的可行性及診斷效能。

3.1 ECV評估結(jié)直腸癌神經(jīng)、血管、淋巴管侵犯的價值神經(jīng)侵犯是指結(jié)直腸癌的癌細胞侵犯神經(jīng)鞘，誘發(fā)神經(jīng)重塑和神經(jīng)環(huán)境的改變，從而影響腫瘤的微環(huán)境，預示病變侵襲性強，容易引起擴散及轉(zhuǎn)移[19]。血管、淋巴管癌栓的形成在臨床上認為是腫瘤預后的重要危險因素。相關研究表明在子宮內(nèi)膜癌、胃癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中，脈管癌栓形成是預后的獨立危險因素[20-22]。

本研究利用增強后造影劑在組織細胞的分布，基于ID測量結(jié)直腸癌的ECV[23-24]，發(fā)現(xiàn)免疫組化表達陽性組的ECV升高明顯，提示腫瘤破壞血管、淋巴管、侵犯神經(jīng)等，可引起細胞微環(huán)境變化。血管、淋巴管、神經(jīng)侵犯是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的關鍵因素，邵瑞麗[25]發(fā)現(xiàn)ECV可以預測結(jié)腸癌的肝轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但其未納入對血管、淋巴管、神經(jīng)侵犯的研究。本研究發(fā)現(xiàn)靜脈期所測ECV與免疫組化是否陽性之間差異無統(tǒng)計學意義，而延遲掃描的ECV值升高，且與免疫組化是否陽性差異有統(tǒng)計學意義，表明對比劑在細胞外間質(zhì)中平衡分布可能需要較長的時間，在靜脈期腫瘤組織內(nèi)的對比劑還未達到細胞外間質(zhì)的平衡狀態(tài)[26]，此期ECV不能評估對腫瘤的神經(jīng)、血管及淋巴管浸潤，而延遲期可評估其狀態(tài)[27]。本研究對比延遲期與靜脈期的ECV，發(fā)現(xiàn)延遲期均高于靜脈期，且對神經(jīng)、血管和淋巴管是否浸潤有明顯差異，表明延遲期造影劑在織細胞間隙中的分布更接近平衡狀態(tài)，更能反映腫瘤細胞外間質(zhì)的變化。本研究同時測量正常腸壁的ECV作為對照，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的ECV高于正常腸壁，進一步表明ECV能夠反映腫瘤的細胞外間質(zhì)變化。

本研究中免疫組化表達陽性的ECV升高，與既往在結(jié)腸癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移ECV值更高[25]的研究結(jié)果一致，即ECV升高是不良預后指標；而另一項研究發(fā)現(xiàn)在IV期胰腺癌中，腫瘤ECV分數(shù)較高的患者預后更好[18]，其原因可能是：雖然胰腺癌和結(jié)直腸癌均為消化道腫瘤，生物學特性卻存在差異，胰腺癌為乏血供腫瘤，而結(jié)直腸癌血供較豐富，容易產(chǎn)生大量的腫瘤新生血管，對比劑進入細胞外間隙相對增多；同時胰腺癌更易發(fā)生壞死，也會影響ECV的結(jié)果，具體還需在今后的研究中進行大樣本量及多中心驗證。

3.2 ECV反映腫瘤細胞外間質(zhì)改變可能的機制 腫瘤細胞的發(fā)生伴隨著細胞外微環(huán)境的變化，在轉(zhuǎn)化細胞與微環(huán)境中基質(zhì)和免疫細胞的相互作用演化過程中，出現(xiàn)細胞外基質(zhì)沉積、成纖維細胞激活、不斷聚集，以及一些炎癥細胞浸潤，使得腫瘤細胞微環(huán)境的可視化量化因子ECV發(fā)生變化[28]。本研究結(jié)果顯示腫瘤組織的ECV升高，進一步反映出結(jié)直腸癌微環(huán)境變化的病理改變，可能的機制為：一方面，腫瘤細胞數(shù)量越多，密度越大，合成的大分子蛋白增多，影響細胞整體運動，使造影劑擴散受限，在細胞外間隙滯留時間長[29]。另一方面，腫瘤相關的基質(zhì)細胞通過刺激腫瘤血管生成、重塑細胞外基質(zhì)，癌細胞與腫瘤微環(huán)境之間復雜的相互作用引起ECV的變化[30]。此外，惡性腫瘤新生血管網(wǎng)豐富、但欠成熟，血管脆性大，因此血流量、血容量、血管通透性明顯增加，導致造影劑進入組織間隙增多引起ECV變化[31]。

3.3 本研究的創(chuàng)新點 ①結(jié)直腸癌的神經(jīng)、血管、淋巴管浸潤診斷依賴于有創(chuàng)的病理組織活檢，本研究與既往研究相比，應用雙層探測器光譜CT參數(shù)ID計算ECV，無創(chuàng)評估結(jié)直腸癌導致的腫瘤組織細胞外微環(huán)境改變，僅需采集一次紅細胞壓積及CT檢查，避免了有創(chuàng)檢查。②ECV在組織纖維化和淀粉樣變研究較多，對腫瘤微環(huán)境改變的研究尚少，本研究為臨床術前無創(chuàng)評估結(jié)直腸癌神經(jīng)、血管及淋巴管浸潤提供新的思路和方法，也為雙層探測器光譜CT參數(shù)更好地應用于腫瘤研究提供了思路和參考。③目前關于ECV的研究多集中于普通CT，需要平掃和增強兩項檢查，本研究采用光譜CT碘密度參數(shù)，避免了二次掃描，且經(jīng)增強圖像測得的ECV易整合至常規(guī)檢查中，于臨床更為方便可行。

3.4 本研究的局限性 ①本研究樣本量較小，僅納入結(jié)直腸癌患者，腺瘤等良性腫瘤未納入本研究，使結(jié)果有一定局限性。②結(jié)直腸屬空腔器官，不同于實質(zhì)器官，測量數(shù)據(jù)過程中雖盡量將感興趣區(qū)放置在腫瘤實性部分提高準確度，但難以避免部分腫瘤組織壞死及水腫的影響，部分測量結(jié)果可能存在偏差。③關于延遲時間的確定，目前未見統(tǒng)一報道。本研究用2 min延遲掃描，用靜脈期作為對照，結(jié)果顯示兩期ECV均可反映細胞微環(huán)境變化，但延遲期ECV值升高明顯，能夠反映腫瘤組織的神經(jīng)、血管、淋巴管浸潤情況，具體延遲時間更長是否更有意義有待進一步探索。④本研究納入對象的紅細胞壓積均在檢查前3 d內(nèi)采集，不同時間窗可能影響結(jié)果的準確度，需在此后的研究中證實。⑤本研究探討了ECV對結(jié)直腸癌發(fā)生神經(jīng)、血管及淋巴管浸潤的價值，但未進一步隨訪患者的生存期，今后將結(jié)合兩方面的研究，對結(jié)直腸癌患者的轉(zhuǎn)移因素及預后進行全面分析，得出更可靠的結(jié)果。

總之，經(jīng)初步研究發(fā)現(xiàn)，ECV可以反映結(jié)直腸癌神經(jīng)、血管、淋巴管浸潤情況，也可以區(qū)分癌組織與正常腸壁。希望隨著研究的不斷跟進，ECV在結(jié)直腸疾病的診斷、淋巴轉(zhuǎn)移及預后方面提供更多價值。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突