環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)技術(shù)在果樹病毒病檢測中的應(yīng)用

羅麗婷，蔣君梅，李向陽，謝 鑫*

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)微生物特色重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

果樹是指能提供可供食用的果實、種子的多年生植物及其砧木的總稱。其果實不僅含有豐富的維生素營養(yǎng)，而且能夠促進消化，因而深受人們的喜愛。自改革開放以來，我國果樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，現(xiàn)已成為世界果樹產(chǎn)業(yè)第一大國，種植面積和產(chǎn)量都居世界首位。果樹病害頻發(fā)是目前制約果樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要原因，病毒是其最常見的致病因子，據(jù)報道，目前已發(fā)現(xiàn)900多種病毒可引起植物病害，造成的經(jīng)濟損失可高達600億美元。早期診斷是減少病害損失，阻止病害進一步傳播的有效方法。但由于病毒個體微小，結(jié)構(gòu)簡單，只含有一種核酸(DNA或RNA)，無法用光學(xué)顯微鏡觀察，使得病毒診斷存在較大的局限性。隨著時間的推移與研究的不斷深入，病害診斷領(lǐng)域發(fā)生了巨大的變革。從標(biāo)本中分離和鑒定病原，到血清學(xué)鑒定的出現(xiàn)，再到酶聯(lián)免疫吸附劑測定方法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)等檢測方法的出現(xiàn)。檢測效率和靈敏度雖都有不同程度的提高，但昂貴的儀器和繁瑣的擴增后處理過程使其應(yīng)用受到一定程度的影響。直至2003年環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)被用于植物病毒病的檢測，才有效地解決了上述問題，該方法不僅操作簡單，而且其靈敏度及效率也高于傳統(tǒng)的ELISA及RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)檢測技術(shù)。從2003年至今，LAMP技術(shù)已被用于檢測47個屬的100多種病毒。此外，逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification,RT-LAMP)也已在2個科8個病毒屬中進行檢測。本文將從LAMP技術(shù)的原理出發(fā)，重點梳理LAMP技術(shù)在果樹病毒病檢測中的應(yīng)用，討論其優(yōu)缺點，并對LAMP技術(shù)在植物病害防治中的應(yīng)用進行了展望。

1 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)

LAMP是由Notomi和同事設(shè)計和開發(fā)的一種用于基因診斷和恒溫核酸擴增的方法，最初用于檢測乙型肝炎病毒的DNA。該方法所涉及的嗜熱脂肪芽孢桿菌(，Bst)DNA聚合酶在60～65 ℃的等溫條件下約有60 min的自動循環(huán)可置換DNA合成，因此需要由一組專門設(shè)計的特異性目標(biāo)引物啟動，用于識別目標(biāo)DNA上的特定區(qū)域。LAMP檢測引物至少包括正向及反向外引物(F3和B3，僅在非循環(huán)步驟中具有鏈位移活性)、正向及反向內(nèi)引物FIP和BIP，有助于環(huán)的形成，其中FIP由F1c和F2兩部分組成；BIP由B1c和B2兩部分組成；F1c和F2c與目標(biāo)序列中的F1和B1區(qū)域互補；有時還包括兩種環(huán)引物(LF和LB)以加快LAMP反應(yīng)效率。LAMP引物是針對每個病原體的目標(biāo)核酸序列(DNA或RNA)而設(shè)計的，通常使用Primer Explore(https://primerexplorer.jp/e/)在線網(wǎng)站設(shè)計。

LAMP反應(yīng)過程(圖1)包括三個步驟:(1)初始步驟：FIP針對特定的互補序列，開始DNA合成。在目標(biāo)序列的另一端，BIP的DNA擴增也以同樣的方式進行(圖1-a，1-2)；(2)環(huán)結(jié)構(gòu)生成：F3進入目標(biāo)區(qū)域，在Bst酶的置換作用下，F(xiàn)IP鏈被取代，形成一個擴增循環(huán)的模板。通過兩個連續(xù)的擴增周期，即可合成含有目標(biāo)序列的DNA片段，其末端為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，用于循環(huán)擴增步驟的模板(圖1-a，3-5)；(3)循環(huán)放大：類似于初始和環(huán)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生步驟，但環(huán)結(jié)構(gòu)作為單鏈模板。在每個循環(huán)中，對于每個單鏈DNA模板，都會有兩個擴增產(chǎn)物，其中一個與模板相同，另一個是模板長度的兩倍。最終得到花椰菜狀混合產(chǎn)物，可通過多種方法檢測，如：雙鏈DNA(dsDNA)結(jié)合染料、濁度測量、紫外光照射、實時熒光、凝膠電泳等方法檢測(圖1-b，6-11)。

2 LAMP技術(shù)在果樹病毒病檢測中的應(yīng)用

2.1 蘋果病毒病

蘋果(Mill.)是全球最重要的果樹作物之一，為落葉喬木。蘋果病毒病是制約蘋果可持續(xù)生產(chǎn)的一大威脅，如蘋果褪綠葉斑病毒(，ACLSV)和蘋果莖溝病毒(,ASGV)是使蘋果產(chǎn)業(yè)嚴(yán)重受損的主要病毒。ACLSV和ASGV在感病果樹體內(nèi)濃度很低，且一般不產(chǎn)生明顯癥狀，因而防治較為困難。目前主要通過使用高靈敏的檢測方法對苗木進行病毒檢測，從而及時對病害進行防治。傳統(tǒng)的ELISA和 RT-PCR技術(shù)都可快速識別和區(qū)分致病因子，防止病害進一步傳播。然而，在某些情況下，ACLSV和ASGV在感病苗木中含量甚至?xí)陀贓LISA和RT-PCR的最低檢測限度，使得蘋果褪綠葉斑病和蘋果莖溝病一直未得到有效的防治。

注：(1)靶標(biāo)DNA從FIP開始合成到其特定的互補序列B3c為止；(2)F3引物進入B3c序列并開始延伸；(3)在Bst酶作用下，從FIP開始合成的鏈被替換并成為下一個擴增周期的合成模板；(4)從BIP合成DNA；(5)包含目標(biāo)序列的DNA片段擴增完成；(6)-(7)FIP引物在F2c位點與模板配對，擴增至與模板鏈相同長度；(8)模板鏈在B1c位點處合成至達到原來長度的兩倍；(6)-(11)同上述步驟，在Bst酶的作用下每條模板鏈合成兩條以上新DNA鏈。其中一條與模板長度相同，另一條長度為模板鏈的兩倍。圖1 LAMP反應(yīng)原理及流程Fig.1 LAMP reaction principle and amplification process

為有效解決上述問題，Zhao等、Kim等于2014年建立了一種簡單、靈敏的RT-LAMP檢測方法，利用設(shè)計的外殼蛋白基因引物(表1)，快速檢測ASGV。結(jié)果顯示，RT-LAMP檢測出53個被侵染的蘋果葉片樣品，而RT-PCR檢測出49個被侵染的葉片樣品。并通過與ACLSV和蘋果莖痘病毒(,ASPV)的交叉反應(yīng)，確定了RT-LAMP引物具有特異性。2017年，Peng等首次建立ACLSV的RT-LAMP體系。在多次試驗后確定其最佳反應(yīng)溫度為64 ℃，最佳反應(yīng)時間為75 min(表1)，并在現(xiàn)場采集的蘋果樣品上成功檢測出病毒。不同于傳統(tǒng)的檢測技術(shù)，RT-LAMP靈敏度高，簡單易行，成本低廉，可在簡單的現(xiàn)場條件下輕松進行，適用于野外條件下及在許多發(fā)展中國家進行感染樣品的快速檢測，目前已得到越來越廣泛的應(yīng)用。

2.2 番木瓜病毒病

番木瓜(Linn.)又名木瓜,是最具經(jīng)濟價值的番木瓜科水果，營養(yǎng)價值與藥用價值都極為豐富，廣受人們的喜愛，在我國南方多地均有種植。但近年來，番木瓜病毒病頻繁發(fā)生，嚴(yán)重阻礙了番木瓜的高產(chǎn)與優(yōu)產(chǎn)。番木瓜環(huán)斑病毒(,PRSV)，于1949年在美國被首次報道，屬于馬鈴薯Y病毒屬()，有PRSV-P和PRSV-W兩種類型。該病毒在自然界中極易傳播，已成為全球性的制約番木瓜生產(chǎn)的重大病害，曾在中國華南地區(qū)大規(guī)模流行，一度被認為是危害中國木瓜生產(chǎn)最廣泛和最具破壞性的病害。此外，與PRVS同屬的番木瓜變形花葉病毒(-,PLDMV)因引起的病害癥狀與PRVS相似，最初被認為是PRSV。病毒基因通過同源性依賴的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing,PTGS)獲得的轉(zhuǎn)基因抗性是迄今為止保護植物免受包括PRSV在內(nèi)的病毒感染的最有效途徑。而PLDMV卻可侵染中國臺灣和海南島的抗PRSV轉(zhuǎn)基因番木瓜，對中國番木瓜商業(yè)化生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。在經(jīng)過病毒的血清學(xué)診斷和全基因組測序后發(fā)現(xiàn)，PLDMV為一個獨立的種。為了區(qū)分PLDMV和PRSV，已建立ELISA、Western blotting和基于PLDMV基因的RT-PCR等鑒別方式，但效果均不太理想。因此，有必要開發(fā)一種快速、靈敏、經(jīng)濟的檢測PLDMV的方法。2013年Shen等基于PLDMV的保守序列設(shè)計了4條RT-LAMP引物(表1)，建立PLDMV的RT-LAMP檢測方法，通過RT-LAMP檢測試驗，僅在PLDMV感染樣本的RNA提取物中獲得陽性結(jié)果，因此較好地區(qū)分了這兩種病毒。

對于PRSV基因，過去常用RT-PCR進行檢測，但近年來由于PRSV轉(zhuǎn)基因抗病品種培育的增多，以往的檢測方法已難以完全區(qū)分各轉(zhuǎn)基因品種與感PRSV的番木瓜。研究人員在之前的研究的基礎(chǔ)上，對GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中保存的22個PRSV-P和PRSV-W菌株的基因組序列進行序列比對，發(fā)現(xiàn)3基因包含一個高度保守的區(qū)域(3552-3736 bp)，還尚未用于轉(zhuǎn)基因番木瓜抗PRSV基因的開發(fā)。以此區(qū)域設(shè)計LAMP引物靶點，成功設(shè)計出了對感PRSV植株病毒RNA有特異性和敏感性的引物(表1)，且對PLDMV的檢測不具有特異性和敏感性。通過檢測PRSV即可區(qū)分轉(zhuǎn)基因番木瓜、感PRSV番木瓜和感PLDMV番木瓜。該方法結(jié)合早期開發(fā)的PLDMV RT-LAMP檢測方法，為區(qū)分木瓜病毒感染提供一個快速、可靠、敏感和經(jīng)濟的診斷工具。

2.3 櫻桃病毒病

櫻桃(spp.)為薔薇科、櫻屬植物的統(tǒng)稱，營養(yǎng)豐富，含豐富的蛋白質(zhì)、糖類、維生素及鈣、鐵等多種元素，享有“早春第一果”的美譽。世界上作為栽培的櫻桃僅有櫻桃((Lindl.) G.Don)、歐洲甜櫻桃((L.) Moench.)、歐洲酸櫻桃(Mill.)和毛櫻桃((Thunb.) Wall.)4個種類。甜櫻桃是近幾年來在我國發(fā)展較快的果樹之一，其種植面積逐年擴大，但由于栽培過程中的操作不當(dāng)，尤其對病毒病的重視及預(yù)防力度不夠，嚴(yán)重影響了櫻桃果品的產(chǎn)量與品質(zhì)。

目前，國內(nèi)報道的甜櫻桃病毒病已有14種，主要為櫻桃小果病毒1(,LChV-1)、櫻桃小果病毒2(,LChV-2)和ACLSV等。LChV-1與LChV-2致病力極強，在大多數(shù)櫻桃種植區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，被認為是造成櫻桃經(jīng)濟損失的主要原因，目前尚未找到較好的防治方法，只有通過清除感病的苗木才能控制，需要高效、靈敏、準(zhǔn)確的檢測方法為其提供保障。傳統(tǒng)的檢測技術(shù)，如：RT-PCR、ELISA等大都存在靈敏度低，操作復(fù)雜的問題。因而，研究人員選擇建立LChV-1與LChV-2的RT-LAMP體系。研究發(fā)現(xiàn)，RT-LAMP技術(shù)在10 min內(nèi)就能檢測出LChV-1，在67 ℃下進行時效果最佳(表1)。現(xiàn)場檢測病葉結(jié)果顯示RT-LAMP檢測速度較RT-PCR顯著提高，靈敏度至少提高了100倍。在對從甜櫻桃中分離出的LChV-2進行廣譜檢測，還發(fā)現(xiàn)了其潛在的昆蟲媒介。該研究成果為LChV-1與LChV-2在現(xiàn)場快速診斷應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，為櫻桃的商業(yè)化發(fā)展提供了技術(shù)支持。

2.4 葡萄病毒病

葡萄(L.)是世界上產(chǎn)量第二大的水果，是世界最古老的果樹樹種之一。近年來，葡萄栽種面積的持續(xù)擴大的同時，也造成了葡萄病毒病的快速傳播。到目前為止，已有超過60種病毒在葡萄中發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重制約了葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。據(jù)血清學(xué)調(diào)查顯示，多種葡萄病毒病都是由一種單一病毒所引起——葡萄扇葉病毒(，GFLV)。GFLV是已知最早的葡萄病毒，葡萄受侵染后其葉片會退化，導(dǎo)致高達80%的產(chǎn)量損失。預(yù)防一直以來都是控制病毒病最重要的方法，但因GFLV在世界范圍內(nèi)的廣泛分布，導(dǎo)致預(yù)防效果一直欠佳，這對病毒檢測技術(shù)提出了更高的要求。研究人員通過對雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(DAS-ELISA)、RT-PCR、免疫捕捉反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(IC- RT-PCR)、RT-LAMP、免疫捕捉反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法(IC-RT-LAMP)等幾種檢測方法的評估發(fā)現(xiàn)，IC-RT-LAMP為目前檢測GFLV基因的最佳方法(表1)。該檢測方法所需時間最短，且操作簡便,避免了毒性染色材料的使用,可直接用肉眼進行視覺檢測，提高了安全性的同時也降低了成本。

長期以來，盡管人們已對葡萄的主要病毒病有了一定了解，如由GFLV引起的病害，但影響葡萄健康和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新病毒仍在不斷出現(xiàn)。包括葡萄紅斑點病毒(，GRBV)，于2008年首次在美國加州出現(xiàn)，2012年首次從患病葡萄中提取出該病毒。由其引起的葡萄紅斑病，廣泛分布于北美葡萄種植區(qū)，可導(dǎo)致葡萄產(chǎn)量嚴(yán)重降低、成熟期大幅縮短。此前，果農(nóng)一直都通過定期檢測和清除病株的方式來管理葡萄園，往往不能及時發(fā)現(xiàn)病害，而導(dǎo)致?lián)p失嚴(yán)重。直到2019年研究人員建立了一種不需要提取核酸，使用無菌移液管尖端穿刺植物體，即可在無菌蒸餾水中孵育LAMP反應(yīng)所需模板的技術(shù)。試驗結(jié)果顯示，“針刺”LAMP檢測方法具有100%的敏感性和96.3%的特異性，進一步使用葡萄紅斑伴隨病毒等溫擴增檢測試紙條(AmplifyRPAcceler8for GRBaV Rapid DNA Test)對GRBaV進行檢測。結(jié)果與“針刺”LAMP檢測一致，表明“針刺”LAMP檢測法具有實用性與廣譜性。

2.5 西番蓮病毒病

西番蓮(L)別名百香果，因其香氣濃郁，營養(yǎng)、藥用價值高，而深受消費者的喜愛，有“果汁之王”的美譽。又因其適應(yīng)性強，種植還具有“短、平、快”的特點，近年來全國種植面積持續(xù)增加。目前，西番蓮多為引種栽培，在栽培生產(chǎn)過程中，常常會受到病蟲害的威脅。其中，病毒病對西番蓮產(chǎn)業(yè)的發(fā)展危害最大，據(jù)報道，現(xiàn)已有超過25種病毒可侵染西番蓮。夜來香花葉病毒(,TeMV)為病毒，該病毒首先在越南發(fā)現(xiàn)可侵染夜來香屬植物(Cov.)，2014年通過檢測在西番蓮中發(fā)現(xiàn)了該病毒。西番蓮受TeMV侵染后，其果實和葉片會出現(xiàn)變形及皺縮等癥狀，使其產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響。現(xiàn)在，大都選擇通過篩選無毒果苗來防治病毒危害，但由于早期植株受病毒侵染后不表現(xiàn)出明顯的癥狀，從而采用ELISA、PCR及LAMP等方法來檢測植物病原物。

不同于傳統(tǒng)的檢測方法，如ELISA、PCR等，LAMP因其具有檢測速度快、靈敏度高和無需專業(yè)儀器等優(yōu)點，而被廣泛用于各種病原體的檢測。為了減少西番蓮產(chǎn)業(yè)的損失，加快無毒苗的篩選，F(xiàn)u等于2021年首次將LAMP技術(shù)應(yīng)用于西番蓮TeMV的檢測，并成功建立西番蓮LAMP快速檢測體系(表1)。研究發(fā)現(xiàn)RT-LAMP檢測技術(shù)與RT-PCR相比具有顯著優(yōu)勢，其靈敏度與效率高，特異性強，此外還可直接在田間使用。為西番蓮的有效防治提供了極其有力的保障。

表1 LAMP在果樹病毒檢測中的應(yīng)用Tab.1 Application of LAMP in fruit tree virus detection

續(xù)表1

3 總結(jié)與展望

自2000年LAMP技術(shù)被首次報道以來，已被廣泛應(yīng)用于動物、植物和人類樣本的病原體檢測的多個方面。與其他技術(shù)相比，LAMP具有一些顯著的優(yōu)勢，使其在診斷方面具有競爭力。首先，LAMP檢測速度快、靈敏度高、特異性強。LAMP反應(yīng)在等溫條件下很容易進行，一般在45～60 min內(nèi)即可完成大量樣品的檢測，若增加一對環(huán)引物，檢測時間可縮短到30～60 min，其反應(yīng)靈敏度可達到PCR的10～100倍；其次，LAMP檢測方法操作簡單、無需昂貴的設(shè)備、可使用范圍廣。LAMP反應(yīng)不需要昂貴的儀器，只要簡單的水浴或加熱即可。結(jié)果不需要放大處理，根據(jù)反應(yīng)過程產(chǎn)生沉淀物的濁度，或利用鈣黃綠素(Calcein)、羥基萘酚藍(Hydroxy naphthol blue，HNB)、SYBR Green I等進行熒光檢測，即可肉眼對結(jié)果進行直接觀察。這使得LAMP檢測可在實驗室、室外現(xiàn)場檢測,甚至是世界上資源有限的地區(qū)都能使用。

LAMP檢測技術(shù)已成為目前病害診斷的主要方法之一，但在廣泛使用的同時也應(yīng)注意其不足：(1)LAMP檢測時每個標(biāo)靶都需要4～6個長度不等的引物，引物較多增加了正確設(shè)計難度的同時，使其相互之間作用的機會也更多，影響檢測的準(zhǔn)確性；(2)LAMP檢測方法特異性強，使其無法用于研究已知信息較少的新基因或結(jié)構(gòu)未知的目標(biāo)基因；(3)不能用于擴增大于30 bp的序列，目的基因片段通常較短，反應(yīng)產(chǎn)物是一系列大小不一的DNA片段，不能作為其他檢測的材料，如PCR；(4)LAMP檢測技術(shù)靈敏度高，樣品制備、擴增和擴增后處理(如需要)必須在單獨的空間進行，否則其極易被污染；(5)指示劑(鈣黃綠素、HNB等)或其他反應(yīng)組分(錳離子或反應(yīng)輔助因子)濃度過高可能會抑制聚合酶反應(yīng)，使產(chǎn)物分解或改變指示劑顏色，從而影響檢測結(jié)果。

雖然LAMP技術(shù)目前仍存在一些缺陷，但其已成為目前診斷病害的重要方法之一，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，同時LAMP技術(shù)也在不斷的完善。許多新試劑的開發(fā)，如：Bst 2.0和Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(New England Biolabs,Ipswich,MA)、GspSSD 和Tin DNA 聚合酶和等溫混合物(OptiGene Ltd,West Sussex,United Kingdom)等極大地提高了檢測的熱穩(wěn)定性和擴增效率；LAMP-LFD(LAMP與橫向流動試紙條(lateral flow dipstick,LFD) 結(jié)合，使結(jié)果可用肉眼直接觀察)、IC-LAMP(免疫捕獲與LAMP結(jié)合，省去了制備病原體DNA或RNA的步驟)等技術(shù)的開發(fā)，即保持了檢測的有效性、靈敏度和特異性，同時減少了反應(yīng)所需時間、更好的避免污染、對操作人員也更加安全；LAMP技術(shù)與帶有特定光學(xué)標(biāo)記特征的條形碼結(jié)合，并對用于條碼掃描的光學(xué)傳感器進行計算機集成，或使用在與目標(biāo)序列結(jié)合后可改變電或磁特性的納米材料，實現(xiàn)了快速讀取檢測結(jié)果及檢測結(jié)果的數(shù)字化管理。此外，為了使該技術(shù)可以應(yīng)對大規(guī)模的篩查和對抗病毒病的大流行。研究人員提出了一種基于新型冠狀病毒肺炎診斷的LAMP試紙條化檢測方法，可供任何居家隔離或就診困難的人群使用。再結(jié)合“improva”系統(tǒng)——集成了控制整個系統(tǒng)的中央單元、分離和純化樣品核酸的預(yù)處理單元、核酸序列檢測和擴增的LAMP組件為一體，即可連接智能手機等電子設(shè)備，實現(xiàn)對檢測結(jié)果和疾病發(fā)展情況的實時了解。雖然目前想要實現(xiàn)在日常生活的環(huán)境中進行恒溫檢測還較為困難,但隨著越來越多的研究人員和實驗室的加入，LAMP技術(shù)的完善性將不斷提高，在未來得到更廣泛的應(yīng)用。