豬瘟脾淋苗免疫仔豬9 d外周血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜分析

包松英 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

豬瘟（Classical swine fever，CSF），原名豬霍亂，是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）感染引起的嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的動(dòng)物疫病[1]。我國(guó)通過(guò)十年的豬瘟疫苗強(qiáng)制免疫與重點(diǎn)監(jiān)測(cè)，已在很大程度上控制了CSF的流行[2]。豬瘟脾淋苗具有免疫原性好、免疫效果確切的優(yōu)點(diǎn)，是養(yǎng)殖戶預(yù)防控制豬瘟的首選產(chǎn)品之一，其制作工藝為豬瘟兔化弱毒株接種健康家兔，產(chǎn)生定型熱后收獲病毒含量高的脾臟和淋巴結(jié)，研磨制備而成[3]。脾淋苗中脾淋組織液具有免疫增強(qiáng)作用，可以提高疫苗的免疫效果[4-5]。劉新平等[6]在PRRSV與CSFV共感染的豬場(chǎng)免疫豬瘟脾淋苗，發(fā)現(xiàn)其阻斷帶毒母豬將CSFV垂直傳播給仔豬的效果十分顯著。

RNA-seq技術(shù)隨著生物信息學(xué)工具以及新一代測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步而不斷發(fā)展，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究，其主要測(cè)序?qū)ο鬄榉蔷幋a小RNA、信使RNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA等。RNA-Seq可以檢測(cè)生物樣本幾乎所有轉(zhuǎn)錄本的序列與表達(dá)信息，研究生命體某個(gè)過(guò)程的作用機(jī)理，重要基因的表達(dá)模式與調(diào)控機(jī)制，揭示信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的改變，并可能識(shí)別新的重要基因[2,7]。目前，研究人員已采用RNA-seq技術(shù)針對(duì)CSFV感染豬或兔體后的作用機(jī)制開(kāi)展了相關(guān)研究[8-9]。

筆者及合作團(tuán)隊(duì)于2020年開(kāi)展了豬瘟脾淋苗、脾淋組織免疫小豬3 d的外周血轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是含毒的脾淋苗還是不含毒的脾淋組織，均可對(duì)小豬免疫功能起到調(diào)節(jié)作用。為了獲得脾淋苗免疫后不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄譜[10-11]，本文進(jìn)一步開(kāi)展9 d的外周血轉(zhuǎn)錄譜分析，旨在為豬瘟脾淋苗免疫機(jī)理研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與分組30～32日齡健康小豬10頭，購(gòu)自福州市永泰縣某豬場(chǎng)，經(jīng)篩查試驗(yàn)豬滿足未免疫豬瘟疫苗且特定病原陰性以及豬瘟抗體陰性的要求。特定病原指：非洲豬瘟病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬圓環(huán)病毒2型。

隨機(jī)將10頭小豬分為A、B兩組，每組5頭，其中A組免疫豬瘟脾淋苗1頭份/頭，B組免疫等量不含豬瘟病毒的大兔脾淋組織。豬瘟脾淋苗、不含豬瘟病毒的大兔脾淋組織由兆豐華生物科技（福州）有限公司制備。

1.2 試劑 總RNA提取試劑盒與實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自蘭博利德試劑有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自廈門泰京生物技術(shù)有限公司。

1.3 樣品采集 采集免疫后9 d的豬前腔靜脈血抗凝樣本，送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析 提取全血樣品的總RNA，檢測(cè)完整性和總量后，構(gòu)建合格文庫(kù)，以Illumina HiSeqTM2500測(cè)序。原始測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)過(guò)濾、錯(cuò)誤率與GC含量檢查后，獲得clean data。使用HISAT2 v2.0.5將數(shù)據(jù)與豬參考基因組進(jìn)行比對(duì)，采用featureCounts進(jìn)行基因表達(dá)水平定量，使用DESeq2軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析，其中P值＜0.05、|log2Fold-Change|≥0的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因。以clusterProfiler軟件實(shí)現(xiàn)差異表達(dá)基因的GO富集分析與KEGG通路中差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)富集，使用GSEA分析工具對(duì)樣品功能注釋與富集分析。

1.5 RT-qPCR驗(yàn)證 選擇3個(gè)基因，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄體系為：25 mM MgCl22 μL，GoScriptTMReverse Transcriptase 1 μL，GoScriptTM5×Reaction Buffer 4 μL，Recombinant RNasin○RRibonuclease Inhibitor 0.5 μL，Oligo(dT)15 Primer 1 μL，Random Primers 1 μL，PCR Nucleotide Mix 10 mM 1 μL，Nuclease-Free Water補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為：42℃反應(yīng)15 min，72℃反應(yīng)15 min獲得cDNA，進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，引物見(jiàn)表1。

表1 引物序列

RT-qPCR反應(yīng)體系為：模板1.0 μL，正向引物、反向引物各0.4 μL，QPCR Mix 10 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。循環(huán)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共45個(gè)循環(huán)。以2^ΔΔCT法計(jì)算差異表達(dá)水平，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估 通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得豬瘟脾淋苗組（A組）與脾淋組織對(duì)照組（B組）的原始數(shù)據(jù)，從表2可知，各樣本凈堿基數(shù)均超過(guò)6 GB，凈讀數(shù)的Q20百分比＞98%、Q30百分比＞95%，GC比例＞50%。將處理的數(shù)據(jù)比對(duì)至豬類參考基因組，總比對(duì)率＞96%，測(cè)序質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)分析。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量指標(biāo)評(píng)估結(jié)果

2.2 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果 免疫后9 d，豬瘟脾淋苗組（A組）與脾淋組織對(duì)照組（B組）相比，DEGs有17 382個(gè)，其中差異顯著的DEGs有605個(gè)，分別是294個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，311個(gè)下調(diào)表達(dá)基因（P＜0.05）。前15個(gè)上調(diào)基因和下調(diào)基因柱狀圖見(jiàn)圖1。

圖1 免疫后9 d DEGs柱狀圖

2.3 GO功能富集分析 將DEGs進(jìn)行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)（見(jiàn)圖2）：免疫后9 d，豬瘟脾淋苗組（A組）與脾淋組織對(duì)照組（B組）相比，富集的條目有1 044個(gè)，其中與生物過(guò)程（Biological process，BP）相關(guān)的有749個(gè)，酰胺生物合成過(guò)程（Amide biosynthetic process）、細(xì)胞酰胺代謝過(guò)程（Cellular amide metabolic process）、翻譯（Translation）等23個(gè)過(guò)程顯著富集（Q＜0.05）。與細(xì)胞組分（Cellular component，CC）相關(guān)的有145個(gè)，胞質(zhì)核糖體（Cytosolic ribosome）、核糖體亞基（Ribosomal subunit）、核糖體（Ribosome）等15個(gè)組分顯著富集（Q＜0.05）。與分子功能（Molecular function，MF）相關(guān)的有150個(gè)，核糖體結(jié)構(gòu)成分（Structural constituent of ribosome）、結(jié)構(gòu)分子 活 性 （Structural molecule activity）、RNA結(jié) 合（RNA binding）3個(gè)功能顯著富集（Q＜0.05）。

圖2 免疫后9 d GO富集結(jié)果

2.4 KEGG通路分析 分析DEGs在KEGG通路中的富集結(jié)果可知（見(jiàn)表3），免疫后9 d，富集的信號(hào)通路數(shù)量有263個(gè)，差異顯著的通路有10個(gè)（P＜0.05），包含核糖體（Ribosome）、生熱作用（Thermogenesis）、一磷酸腺苷活化蛋白激酶信號(hào)通路（AMPK signaling pathway）等。

表3 9 d KEGG通路分析結(jié)果

從圖3可見(jiàn)，核糖體信號(hào)通路極顯著富集，該通路涉及的31個(gè)DEGs均為上調(diào)表達(dá)，其中組成大亞基的20個(gè)核糖體蛋白L基因 （ribosomal protein l genes，rpl）上調(diào)表達(dá)，分別是：rpl12、rpl38、rpl19、r pl35、rpl32、rpl10a、rpl31、rpl30、rpl14、rpl6、rpl11、rpl34、rpl35a、rpl24、rpl23a、rpl21、uba52、mrpl34、rpl3、rpl36a；組成小亞基的11個(gè)核糖體蛋白基因（ribosomal proteins genes，rps）上調(diào)表達(dá)，分別是：r ps17、rps18、rps8、rps7、rps13、rps19、rps4x、rps15a、rpsa、rps12、rps6。

圖3 免疫后9d核糖體信號(hào)通路DEGs富集結(jié)果

2.5 RT-qPCR驗(yàn)證 本文隨機(jī)選擇STAT1、RNF125、MAP3K7 3個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖4。RT-qPCR與RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)一致，本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)可靠。

圖4 3個(gè)基因RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果

3 討 論

傳統(tǒng)的豬瘟脾淋苗安全、免疫效果好，具有刺激豬體產(chǎn)生非特異性免疫增強(qiáng)的作用，是被廣大養(yǎng)殖戶認(rèn)可的優(yōu)質(zhì)疫苗。為了完善豬瘟脾淋苗免疫機(jī)制研究，筆者于2020年開(kāi)展了豬瘟脾淋苗免疫小豬3 d的外周血轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)脾淋苗免疫組相 對(duì) 于 脾 淋 組 織 對(duì) 照 組，CXCL10、RSAD2、OAS1、OAS2、MX1、ISG15等基因顯著上調(diào)表達(dá)，提示脾淋苗可能在免疫早期刺激宿主先天性免疫反應(yīng)[10]。本研究進(jìn)一步開(kāi)展豬瘟脾淋苗免疫小豬9 d的外周血轉(zhuǎn)錄組分析，與免疫后3 d相比，脾淋苗相對(duì)于脾淋組織，免疫后9 d的DEGs明顯增多，由3 d的317個(gè)上升到605個(gè)；免疫后9 d富集的GO功能也大幅度增加，由3 d的668個(gè)上升到1 044個(gè)，3 d的GO功能條目主要集中在與細(xì)胞對(duì)病毒的防御等互作方面，而9 d富集的GO條目主要是酰胺代謝、翻譯、核糖體等；免疫后9 d，富集的KEGG信號(hào)通路數(shù)量有263個(gè)，相較于3 d的215個(gè)，也有所提升，3 d的DEGs富集的信號(hào)通路主要與免疫和抗炎相關(guān)，9 d的則主要富集在核糖體信號(hào)通路等。

核糖體由蛋白質(zhì)和RNA構(gòu)成，是機(jī)體蛋白質(zhì)生物合成的主要場(chǎng)所。核糖體蛋白（Ribosomal proteins）是核糖體的主要成分，在核糖體組裝和蛋白質(zhì)翻譯中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，研究人員還發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白在腫瘤發(fā)生、免疫信號(hào)傳導(dǎo)和發(fā)育等方面的功能[12]，如Provost等[13-14]證實(shí)rpl3、rpl6、rpl23a三種核糖體蛋白影響斑馬魚(yú)胰腺發(fā)育。本研究表明，免疫后9 d，豬瘟脾淋苗組（A組）與脾淋組織對(duì)照組（B組）相比，DEGs主要為rpl基因和rps基因，在GO功能中極顯著富集于翻譯過(guò)程，核糖體、核糖體亞基組分，在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)富集于核糖體信號(hào)通路，預(yù)示著在免疫后9 d，脾淋苗可激活外周血細(xì)胞核糖體等信號(hào)通路，促進(jìn)蛋白質(zhì)生物合成。