NAFLD 合并II 型糖尿病患者腸道菌群分析研究

田楠楠

（河南省焦作衛(wèi)生醫(yī)藥學(xué)校附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，焦作 450001）

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是一種發(fā)病率最高的慢性肝病之一，指除了酒精和其他確切致肝損傷因素外，以肝細(xì)胞脂肪過(guò)度沉積為主要表現(xiàn)的全身代謝綜合征[1]。糖尿病由一系列危險(xiǎn)因素（如遺傳、超重、年齡及不良生活習(xí)慣等）引起的疾病，其中85%～95%為II 型糖尿?。═2DM）[2]。NAFLD 與T2DM 關(guān)系密切，常伴隨脂代謝紊亂和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病，T2DM 患者中NAFLD 的患病率為50%～80%，而NAFLD 患者中糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高2～5 倍，NAFLD 合并T2DM 者的嚴(yán)重肝病事件發(fā)生率會(huì)明顯上升[3-4]。腸道菌群種類可達(dá)1000 多種，細(xì)菌總數(shù)有100 萬(wàn)億，腸道微生態(tài)系統(tǒng)是人體最大最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)有重要作用。腸道與肝臟來(lái)源于同一胚層，二者在結(jié)構(gòu)和功能上有關(guān)系密切，因此腸道微生態(tài)的失衡與NAFLD 也有密切關(guān)系。腸道菌群紊亂會(huì)打破宿主能量吸收和儲(chǔ)存的平衡，能量吸收速率增強(qiáng)，常伴隨體重的顯著增加，進(jìn)一步加重代謝紊亂程度，同時(shí)能加重胰島素抵抗和肝臟內(nèi)的炎癥反應(yīng)，使肝臟毒素的產(chǎn)生增多，最終導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化甚至發(fā)生肝癌[5]。本研究通過(guò)研究NAFLD 合并T2DM 患者和健康人群的腸道菌群情況，以期為該病的治療提供一定的思路，具體如下。

1 研究對(duì)象

1.1 基本信息 以2017 年1 月至2019 年12 月就診于我院的NAFLD 合并T2DM 患者為研究組，共86 例，其中男性50 例，女性36 例，平均年齡（41.6±15.3）歲；另以80 例健康人群為對(duì)照組，男性50例，女性36 例，平均年齡（42.7±14.8）歲。兩組基本信息如性別構(gòu)成比、年齡等經(jīng)分析無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性?；颊呒凹覍倬浞至私庋芯?jī)?nèi)容并簽署知情同意書，本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的準(zhǔn)許。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合NAFLD和II 型糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6-7]；（2）年齡18～75 歲者；（3）BMI≥18.5；（4）無(wú)其它系統(tǒng)重大疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并酒精性肝病、慢性乙肝、慢性丙肝等肝病者；（2）近期服用過(guò)抗生素、微生態(tài)制劑以及胃腸動(dòng)力藥者；（3）有炎癥性腸病、庫(kù)欣綜合征、甲狀腺功能減退癥等患者；（4）已進(jìn)展至肝硬化階段者。

2 研究方法

2.1 標(biāo)本采集 所有研究對(duì)象于入院24 h 內(nèi)，采集糞便樣品，使用糞便采集管收集3～5 g 標(biāo)本，存于-80 ℃冰箱。

2.2 檢測(cè)方法 采用QIAamp ?DNA Stool Mini 試劑盒進(jìn)行腸道菌群的監(jiān)測(cè)，嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行操作。將樣本與ASL 液混合均勻，進(jìn)行細(xì)菌裂解、孵育離心后清除糞便抑制劑，以醇沉法提取DNA 以去除多糖、蛋白質(zhì)。以緩沖液溶解后過(guò)柱子進(jìn)行極性洗脫，回收洗脫液得糞便細(xì)菌總DNA，以illumina hiseq 平臺(tái)檢測(cè)腸道菌群情況，對(duì)樣本基因片段進(jìn)行測(cè)序，讀取核苷酸種類，通過(guò)每輪所收集的熒光信號(hào)獲得模板DNA 片段的序列。

2.3 觀察指標(biāo) 采用Usearch 10.0 在97%相似度下進(jìn)行聚類獲得操作分類單元（Operationa l taxonomic units，OTU），根據(jù)Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU 進(jìn)行分類學(xué)注釋，采用Qiime 1.9.0 進(jìn)行alpha 多樣性分析，以了解樣本微生物多樣性程度，利用Kruskal?Wallis 計(jì)算豐度差異情況等。

2.4 數(shù)據(jù)處理 以SPSS 19.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以()表示，使用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果分析

3.1 兩組OTU 分布比較 在97%相似度的水平下，本研究對(duì)研究組和對(duì)照組的樣本測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行OTU 聚類，比較兩組中共有和獨(dú)有的OTU 數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1 所示。兩組共得到OTU 數(shù)為713 個(gè)，其中有480 個(gè)為研究組和對(duì)照組所共有的，研究組獨(dú)有OTU 數(shù)為81 個(gè)，對(duì)照組獨(dú)有OTU 數(shù)為152個(gè)，對(duì)照組OTU 多于研究組。

3.2 樣品Alpha 多樣性 研究組Shannon、Simpsin、ACE、Chaol 指數(shù)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05），Observe 指數(shù)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。表明研究組腸道菌群豐富度低于對(duì)照組。

表1 兩組a 多樣性指數(shù)比較

3.3 兩組腸道菌群豐度差異 在門水平上，與對(duì)照組相比，研究組厚壁菌門、放線菌門和柔壁菌門豐度降低，抑桿菌門豐度顯著升高，差異有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在屬水平上，研究組Subdoligranulum、Enterobacter、Coprococcus、Klebsiella、Bifidobacterium、Lactobacillus 屬菌顯著減少，而B(niǎo)acteroides、Flavonifractor 菌屬顯著增加（P＜0.05）。

3.4 LEfSe 分析根據(jù) 根據(jù)微生物分類數(shù)據(jù)，進(jìn)行LEfSe 分析，顯示研究組中以擬桿菌、產(chǎn)堿菌、幽門螺桿菌等致病菌為優(yōu)勢(shì)菌；對(duì)照組中以厚壁菌門、雙歧桿菌以及乳酸桿菌等有益菌為優(yōu)勢(shì)菌。

4 討論與結(jié)論

NAFLD 是指沒(méi)有飲酒嗜好的人肝內(nèi)脂肪蓄積甚至發(fā)生脂肪變性和炎性改變，患病率呈逐年升高趨勢(shì)，其發(fā)病機(jī)制主要是由游離脂肪酸增多所導(dǎo)致的胰島素抵抗和氧化應(yīng)激，常合并糖尿病，肥胖、高血脂、高血壓等疾病，有研究表明：NAFLD 可能為一種胰島素抵抗在肝臟的表現(xiàn)[8-9]。T2DM 與NAFLD 緊密聯(lián)系，互相影響。腸道菌群的紊亂可能與NAFLD 的進(jìn)展有關(guān)。腸道菌群的改變能通過(guò)促進(jìn)胰島素抵抗、生成內(nèi)源性乙醇、產(chǎn)生內(nèi)毒素引起體內(nèi)的炎癥反應(yīng)等途徑，推動(dòng)NAFLD 及其代謝綜合征的進(jìn)展[10]。各種原因引起的腸道菌群的細(xì)菌移位，能產(chǎn)生LPS、肽聚糖等代謝產(chǎn)物，刺激炎癥因子的釋放，激活多種炎癥通路，進(jìn)而引起脂質(zhì)膽堿代謝、內(nèi)源性乙醇的生成等一系列病理變化，使IR和脂質(zhì)產(chǎn)生病理性累積，最終導(dǎo)致NAFLD 及T2DM 等代謝綜合癥[11]。

表2 兩組在門、屬水平上腸道菌群豐度差異比較

在97%相似度的水平下，本研究對(duì)研究組和對(duì)照組的樣本測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行OTU 聚類，結(jié)果顯示兩組共得到OTU 數(shù)為713 個(gè)，其中有480 個(gè)為研究組和對(duì)照組所共有的，研究組獨(dú)有OTU 數(shù)為81個(gè)，對(duì)照組獨(dú)有OTU 數(shù)為152 個(gè)，對(duì)照組OTU 多于研究組。表現(xiàn)為NAFLD 合并T2DM 患者的腸道菌群多樣性總體上較健康人群低。對(duì)三組α 多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，顯示Observe 指數(shù)顯著低于對(duì)照組，表明研究組腸道菌群豐富度低于對(duì)照組，而兩組間Shannon、Simpsin、ACE、Chaol 指數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？赡芘c研究中納入的樣本量較小有關(guān)。

腸道菌群與肝臟在功能上也有密切聯(lián)系，與機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)、代謝和免疫等均有緊密相關(guān)，其中厚壁菌門和擬桿菌門是主要的細(xì)菌，占總微生物群落的99%左右[12]。在門水平上，與對(duì)照組相比，研究組厚壁菌門、放線菌門和柔壁菌門豐度降低，抑桿菌門豐度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在屬水平上，研究組Subdoligranulum、Enterobacter、Coprococcus、Klebsiella、Bifidobacterium、Lactobacillus 屬菌顯著減少，而B(niǎo)acteroides、Flavonifractor 菌屬顯著增加（P＜0.05），顯示Bacteroides、Flavonifractor 菌屬可能為NAFLD 及T2DM 的危險(xiǎn)因素。根據(jù)LEfSe 分析結(jié)果顯示研究組中以擬桿菌、產(chǎn)堿菌、幽門螺桿菌等致病菌為優(yōu)勢(shì)菌；對(duì)照組中以厚壁菌門、雙歧桿菌以及乳酸桿菌等有益菌為優(yōu)勢(shì)菌。擬桿菌科中的多形擬桿菌能分裂糖苷鍵，可降解無(wú)法被人體吸收的植物多糖，增加腸道10%～15%的能量吸收，進(jìn)而增加宿主脂肪含量[13]。擬桿菌在死亡過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量脂多糖（LPS），LPS 局部蓄積于腸道引起炎癥，通過(guò)門靜脈進(jìn)入肝臟，被存在于肝巨噬細(xì)胞上Toll 樣受體4（TLR4）識(shí)別后，活化LPS/TLR4 信號(hào)通路引發(fā)肝臟炎癥和胰島素抵抗，參與NAFLD 發(fā)病[14]。腸道幽門螺桿菌能引起轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 的表達(dá)增加，并激活肝星狀細(xì)胞促炎信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的形成同時(shí)抑制其降解，進(jìn)而誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡等機(jī)制在肝炎進(jìn)展中起促進(jìn)作用[15]。

綜上所述，NAFLD 合并T2DM 患者腸道菌群豐富度下降，與健康者有較大差異。