基于NF-κB 通路探討TNF-α 對椎間盤退變小鼠模型髓核間充質(zhì)干細胞衰老的影響

伍耀宏，陳榮春

（江西省贛州市人民醫(yī)院，贛州 341000）

椎間盤退變是引起腰腿痛的主要原因，可引起椎間盤細胞數(shù)量減少和功能異常[1]。表現(xiàn)為細胞凋亡、細胞外基質(zhì)成分（蛋白聚糖（Aggrecan,Agg）、Ⅱ型膠原蛋白（Collagen Ⅱ,Col Ⅱ））合成與降解失衡,進而導致髓核水分丟失，椎間盤高度下降、椎間盤應力重新分布[2-3]。最終引起纖維環(huán)的破裂，退變髓核因壓力沿纖維環(huán)破口疝出壓迫神經(jīng)并引發(fā)相應神經(jīng)癥狀[4-5]。此前對于椎間盤突出引起的腰腿痛治療方法主要包括保守治療和手術(shù)治療，但會伴隨相鄰椎間盤退變等并發(fā)癥，目前尚無十分理想的治療方法。故實驗對椎間盤退變及其加重機制進行研究，有望提高椎間盤退突出的手術(shù)療效。

1 研究對象及方法

1.1 主要試劑和儀器 TNF-α 干細胞誘導培養(yǎng)液、LG-DMEM 培養(yǎng)基（Solarbio,美國）；胎牛血清（FBS）、I 型膠原酶、胰蛋白酶（Biosharp,美國）；細胞增殖試劑盒，NF-κB、Agg、Col II、Sox-9 抗體（ebioscience，美國）；FC500 流式細胞儀、倒置相差顯微鏡、EXL-800 酶標儀、細胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國）。

1.2 實驗動物 30 只BALB/c 小鼠，4～6 周齡，18～20 g，購自菲諾克生物科技（上海）有限公司，許可證號：SCXK（滬）2018-0005。

1.3 實驗方法

1.3.1 椎間盤退變造模及NPSCs 分離培養(yǎng) 采用X 線片定位尾椎椎間隙并標記。小鼠稱重，腹腔注射麻醉（1%戊巴比妥鈉，35 mg/kg）。麻醉成功后固定小鼠呈俯臥位，碘伏消毒鼠尾，使用21G 定制造模穿刺器械對小鼠尾椎Co6/7、Co8/9 的椎間盤行橫貫和半橫貫穿刺，穿刺針平行于椎體垂直皮膚進針，從皮膚開始向椎間盤方向半橫貫穿刺深度為5 mm，橫貫穿刺為10 mm 剛好穿透對側(cè)皮膚，停留30 s 后拔出。在術(shù)后4 周腹腔注射戊巴比妥鈉處死小鼠，分離鼠尾髓核組織剪碎至六孔板內(nèi)，0.2%二型膠原酶消化、離心漂洗，以10% FBS 重懸混勻并接種于培養(yǎng)瓶，分別加入100 μL 不同濃度TNF-α（0,0.1、1、5、10 ng/mL）培養(yǎng)液，培養(yǎng)7 h，3 d換液1 次。光鏡觀察細胞，待細胞生長至80%時進行傳代，每2 d 更換一次培養(yǎng)液，傳代后取P3 代細胞進行實驗。用含不同濃度梯度TNF-α（0、0.1、1、5、10 ng/mL）的培養(yǎng)液培養(yǎng)NPSCs，分別列為0 ng/mL TNF-α 組、0.1 ng/mL TNF-α 組、1 ng/mL TNFα 組、5 ng/mL TNF-α 組、10ng/mL TNF-α 組。對NPSCs 三系誘導分化,成脂分化：細胞接種于六孔板內(nèi)（2×104），待融合至100%進行成脂誘導，3 d 換液1 次，21 d 后油紅O 染色觀察誘導情況。成骨分化：細胞接種于六孔板內(nèi)（2×104），待融合80%左右進行成骨誘導，3 d 換液1 次，21 d 后茜素紅染色觀察誘導情況。成軟骨誘導分化：細胞接種于六孔板內(nèi)（6×105），3 d 換液1 次，21 d 后甲苯胺藍染色觀察誘導情況。

1.3.2 MTT 檢測NPSCs 增殖情況 調(diào)整細胞懸液濃度，各組每孔加MTT 溶液20 μL，培養(yǎng)4 h 吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO 孵育10～20 min，于0、3、5 d 檢測各孔吸光值，繪制曲線。

1.3.3 Western-blot 檢測NF-κB 蛋白 提取總蛋白，測定濃度，電泳、轉(zhuǎn)模、封閉1 h，加入（1∶1000）一抗（NF-κB，GAPDH），孵育12 h，加入HRP 標記（1∶5000）二抗，孵育2 h，顯影，檢測NF-κB 蛋白表達水平。

1.3.4 β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老 棄孔板中培養(yǎng)液，PBS 沖洗，加入β-半乳糖苷酶染色固定液，固定0.5 h。棄固定液，PBS 洗滌3 次加染色液。孵育12 h。去工作液，封片保存。光鏡觀察衰老細胞數(shù)目。

1.3.5 成軟骨分化能力檢測 利用0，1，10 ng/mL濃度的TNF-α 干預NPSCs，檢測相關(guān)蛋白表達水平。提取總蛋白測定濃度，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉1 h，加入（1:1000）一抗（Agg、Col II、Sox -9、GAPDH），孵育12 h。加入HRP 標記（1∶5000）二抗，孵育2 h，顯影。檢測Agg、Col II、Sox-9 蛋白表達水平。

2 結(jié)果

2.1 NPSCs 三系分化鑒定 成脂誘導：油紅O 染色見細胞內(nèi)形成脂滴團，有鮮紅色脂滴泡；成骨誘導：茜素紅染色顯示細胞內(nèi)紅染礦化鈣鹽結(jié)節(jié)沉積；成軟骨誘導：甲苯胺藍染色觀察提示細胞形態(tài)不規(guī)則，呈現(xiàn)多角形軟骨細胞，陰性對照：未見陽性結(jié)果，見圖1。

2.2 NPSCs 增殖情況 隨TNF-α 濃度升高，NPSCs的增殖能力逐漸減弱，與0 ng/mL TNF-α 組比較，其他濃度TNF-α 培養(yǎng)下NPSCs 增殖能力均下降（P＜0.05）。見圖2。

2.3 NF-κB 蛋白表達水平 隨TNF-α 濃度升高，NF-κB 蛋白表達水平逐漸增高，與0 ng/mL TNFα 組比較，其他濃度TNF-α 培養(yǎng)下NF-κB 蛋白表達水平上調(diào)（P＜0.05）。見圖3。

2.4 NPSCs 衰老染色情況 隨TNF-α 濃度升高，衰老染色陽性細胞數(shù)量逐漸增多，與0 ng/mL TNF-α組比較，其他濃度TNF-α 培養(yǎng)下衰老染色陽性細胞數(shù)增多（P＜0.05）。見圖4。

2.5 成軟骨分化能力 三種不同濃度TNF-α 濃度下成軟骨分化后Agg、Col II、Sox-9 蛋白表達水平比較無差異（P＞0.05），見圖5。

3 討論

本實驗結(jié)果表明，隨TNF-α 濃度升高，NPSCs的增殖能力降低，NF-κB 蛋白表達水平增高，細胞衰老程度增高。在進行NPSCs 誘導分化后，成脂分化后細胞內(nèi)形成脂滴團及鮮紅色脂滴泡，成骨分化出現(xiàn)大量礦化鈣鹽結(jié)節(jié)沉積，成軟骨分化細胞呈不規(guī)則多角形軟骨細胞樣，不同濃度TNF-α 成軟骨分化后Agg、Col II、Sox-9 水平無差異。

椎間盤退變首先發(fā)生于髓核組織，表現(xiàn)為髓核組織脫水，蛋白多糖及ColII 含量減少[6-7]。這一過程伴隨炎癥反應，TNF-α 在炎癥反應中快速合成分泌，調(diào)節(jié)細胞因子水平[8]。NF-κB 作為TNF-α的下游信號通路，它能夠調(diào)控DNA 轉(zhuǎn)錄過程，參與應激反應[9]。韓亞新[10]研究指出，TNF-α 參與椎間盤退變的發(fā)生心及良過程，但與椎間盤退變程度并無聯(lián)系。而在韓建軍[11]的近一步研究中明確了椎間盤退變程度與TNF-α 水平存在相關(guān)性，TNFα 越高，椎間盤退變程度越嚴重。桂輝瓊[12]則是通過TNF-α 抑制劑進行研究，發(fā)現(xiàn)抑制TNF-α 可有效延緩椎間盤退變，TNF-α 抑制藥劑有望成為延緩椎間盤退變的治療方法，應用前景廣闊。而椎間盤退變與NPSCs 密切相關(guān)，NPSCs 增殖及分化能力降低，使髓核細胞數(shù)量減少，蛋白多糖及Col II分泌減少，導致椎間盤脫水，高度降低，最終引起椎間盤退變。此次實驗證實TNF-α 對NPSCs 增殖、分化及衰老均存在影響，從細胞水平說明TNF-α 與椎間盤退變的聯(lián)系，并通過NF-κB 通路發(fā)現(xiàn)TNF-α 引起NPSCs 增殖及分化受阻可能是下調(diào)NF-κB 表達有關(guān)。Liu[13]及Zhu[14]的研究表明，下調(diào)NF-κB 可改善椎間盤退變程度，降低疼痛感，靶向NF-κB 治療將可作為潛在方法用于椎間盤退變的生物治療。Agg、Col II、Sox-9 在NPSCs 成軟骨分化中逐漸合成，能夠作為標志物檢測。Agg 是一種復合糖，是結(jié)締組織的纖維成分，可以起到潤滑關(guān)節(jié)的作用[15]。Col II 是由軟骨細胞分泌的一種膠原蛋白，保護并聯(lián)結(jié)各組織[16]。Sox-9 是在軟骨細胞分化過程中Sox-9 通過翻譯后修飾，調(diào)節(jié)其他細胞因子水平，影響軟骨形成[17]。在此次研究中，通過誘導成軟骨分化，在檢測Agg、Col II、Sox-9 水平后，發(fā)現(xiàn)三種不同濃度TNF-α 培養(yǎng)下NPSCs 的Agg、Col II、Sox-9 蛋白表達水平無差別，說明Agg、Col II、Sox-9 可作為NPSCs 分化的檢測標志物。陳臻浩[18]在研究中指出，SOX-9 調(diào)節(jié)組蛋白修飾微小RNA 調(diào)控軟骨細胞分化，是軟骨細胞分化機制之一。結(jié)合此次研究，不同濃度TNF-a 作用下NPSCs 成軟骨分化后均能夠檢測出Agg、Col II、Sox-9 且水平無異，可同時作為NPSCs 城軟骨分化鑒定的檢測標志物。

綜上，TNF-α 可進一步降低退變椎間盤來源小鼠NPSCs 的增殖，加快NPSCs 衰老，進一步加速椎間盤的退變進程。NF-κB 通路抑制藥劑延緩髓核干細胞衰老有望為椎間盤退變生物 治療提供新的治療方法及希望，具有較大的社會和經(jīng)濟效益。