circATRNL1靶向miR-181a-5p對高糖誘導腎小管上皮細胞損傷的影響

盧迪 黎瑤 梅希 邱平

糖尿病(DM)是一種常見的代謝性疾病，常伴有慢性腎臟損害、視網(wǎng)膜病變等并發(fā)癥。據(jù)報道，超過1/3的DM患者將發(fā)展為糖尿病腎病(DN)，已成為終末期腎病的主要病因[1]。腎小管損傷是DN的重要特征，研究顯示高血糖刺激可誘導活性氧過量產(chǎn)生，導致腎小管上皮細胞凋亡增多；腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性因子可直接破壞腎結構，加劇腎小管損傷[2]。因此，抑制腎小管上皮細胞損傷可能是阻斷DN進展的有效策略。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類具有閉環(huán)結構的非編碼RNA(circRNA)，其通過吸附特定微小RNA(miRNA)發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA作用廣泛參與細胞過程。許多研究報道circRNA靶向miRNA參與包括DN等DM并發(fā)癥的進展[3,4]。研究發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p在膿毒癥、骨關節(jié)炎等炎癥相關疾病中顯著升高，抑制其表達對脂多糖誘導的腎小管上皮細胞損傷、白介素(IL)-1β誘導的軟骨細胞損傷具有保護作用[5,6]。靶基因預測到circATRNL1與miR-181a-5p存在結合位點。已有研究指出circATRNL1能夠抑制IL-1β誘導的軟骨細胞炎性反應、細胞凋亡、細胞外基質(zhì)降解[7]。因此，本研究探討circATRNL1靶向miR-181a-5p對高糖誘導的腎小管上皮細胞(HK-2)凋亡和炎性反應的影響，為阻斷DN進展提供潛在有效靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 HK-2細胞(美國ATCC)；DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；青鏈霉素雙抗、胎牛血清(武漢普諾賽生物公司)；pcDNA、pcDNA-circATRNL1、anti-miR-NC、anti-miR-181a-5p、si-circATRNL1、si-NC、miR-NC、miR-181a-5p mimics(上海吉瑪制藥公司)；miRNA逆轉錄試劑盒(美國ABI公司)；PrimeScript逆轉錄試劑試劑盒(大連Takara生物技術公司)；SYBR Green PCR試劑盒(日本Toyobo公司)；TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、RIPA裂解緩沖液、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(上海碧云天生物公司)；膜聯(lián)蛋白V(annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)(南京凱基生物科技公司)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)兔多克隆抗體(A01021)、剪切型半胱氨酸蛋白酶9(Cleaved-caspase 9)兔多克隆抗體(ABP50009)、Cleaved-caspase3(IMG-5700)兔多克隆抗體、羊抗兔IgG二抗(A21020)(武漢艾美捷科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組：HK-2細胞接種含10%胎牛血清+1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當細胞90%融合時1∶3傳代。將對數(shù)期HK-2細胞以5×105個/孔接種于6孔板過夜，然后用Lipofectamine 2000將pcDNA(2 μg)、pcDNA-circATRNL1(2 μg)、anti-miR-NC(20 nmol/L)、anti-miR-181a-5p(20 nmol/L)、si-NC(20 nmol/L)、si-circATRNL1(20 nmol/L)、pcDNA-circATRNL1(2 μg)與miR-181a-5p mimics(20 nmol/L)、pcDNA-circATRNL1(2 μg)與miR-NC(20 nmol/L)分別轉染HK-2細胞，收集轉染48 h測定轉染效果后進行后續(xù)實驗。分別用含5.5 mmol/L、25 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液孵育未轉染HK-2細胞24 h[8]，分別記為對照(Con)組、高糖(HG)組；用含25 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液孵育轉染pcDNA、pcDNA-circATRNL1、anti-miR-NC、anti-miR-181a-5p、pcDNA-circATRNL1+ miR-181a-5p mimics、pcDNA-circATRNL1+ miR-NC的HK-2細胞24 h，分別記為HG+ pcDNA組、HG+ pcDNA-circATRNL1組、HG+ anti-miR-NC組、HG+anti-miR-181a-5p組、HG+ pcDNA-circATRNL1+miR-181a-5p組、HG+ pcDNA-circATRNL1+miR-NC組。轉染pcDNA、pcDNA-circATRNL1、si-NC、si-circATRNL1的HK-2細胞分別記為pcDNA組、pcDNA-circATRNL1組、si-NC組、si-circATRNL1組。

1.2.2 RT-qPCR檢測circATRNL1和miR-181a-5p表達：用TRIzol試劑從各組HK-2細胞提取總RNA、miRNA和circRNA分別用miRNA逆轉錄試劑盒、PrimeScript逆轉錄試劑試劑盒進行逆轉錄，采用SYBR Green PCR試劑盒對miRNA和mRNA進行RT-qPCR。根據(jù)2-ΔΔCt法計算circATRNL1(內(nèi)參為GAPDH)和miR-181a-5p(內(nèi)參為U6)相對表達量。circATRNL1上游引物5’-ACTGGTTTCAACATTT TCTATTCAA-3’；circATRNL1下游引物5’-GCTTCACCCTTCCAGTATTT-3’；GAPDH上游引物5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGTT-3’；GAPDH下游引物5’-TTGATTTTGGAGGGATCT CG-3’；miR-181a-5p上游引物5’-ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACGCTGTCGG-3’；miR-181a-5p下游引物5’-TGGTGTCGTGGAGTCGA-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTGGGCAGCACA-3’；U6下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.3 ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α和IL-6水平：細胞處理完畢后，收集上清液，2 000 r/min離心20 min。參照ELISA試劑盒說明書操作。

1.2.4 流式細胞術檢測凋亡率：用胰蛋白酶消化HK-2細胞，預冷PBS洗滌后，用500 μl的1×結合緩沖液(含5 μl的annexin V-FITC和5 μl的碘化丙啶)重懸1×105個細胞，室溫避光孵育20 min。流式細胞儀和FlowJo 8.7.1軟件分析各組細胞凋亡情況。

1.2.5 Western blot檢測Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達：用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，定量后，取適量蛋白樣品在SDS/PAGE凝膠上分離并電轉移到PVDF膜，然后在室溫下將膜置于5%脫脂牛奶溶液中封閉1 h。隨后將膜置于一抗溶液中4℃孵育過夜。次日，將膜與酶標二抗在室溫下孵育1 h。滴加ECL試劑進行顯色反應。Quantity One 3.0軟件測定蛋白條帶的相對灰度值，GAPDH為內(nèi)參。

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗：將含有miR-181a-5p結合位點對的circATRNL1野生型(WT)或突變型(MUT)序列分別克隆到pGL3載體，分別構建重組載體WT-circATRNL1、MUT-circATRNL1。用Lipo 2000將miR-181a-5p mimics或miR-NC分別與WT-circATRNL1或MUT-circATRNL1共轉染HK-2細胞。48 h后，用雙熒光素酶報告試劑盒評估熒光素酶活性，將螢火蟲熒光素酶活性歸一化為海腎熒光素酶活性表示相對熒光素酶活性。

2 結果

2.1 circATRNL1和miR-181a-5p在高糖誘導的HK-2細胞損傷中的表達 與Con組比較，HG組HK-2細胞中circATRNL1相對水平顯著降低(P<0.05)，miR-181a-5p相對水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 circATRNL1和miR-181a-5p在高糖誘導的HK-2細胞損傷中的表達

2.2 circATRNL1過表達對高糖誘導HK-2細胞損傷的影響 HG組HK-2細胞中circATRNL1相對水平較Con組顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達顯著升高(P<0.05)，細胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6顯著升高(P<0.05)。與HG+pcDNA組比較，HG+pcDNA-circATRNL1組HK-2細胞中circATRNL1相對水平顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達顯著降低(P<0.05)，細胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6水平顯著降低(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 circATRNL1過表達對高糖誘導的HK-2細胞凋亡的影響;A 凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表2 circATRNL1過表達對高糖誘導HK-2細胞損傷的影響

2.3 circATRNL1靶向調(diào)控miR-181a-5p的表達 StarBase預測到circATRNL1與miR-181a-5p存在互補核苷酸序列。與miR-NC+WT-circATRNL1組比較，miR-181a-5p+WT-circATRNL1組HK-2細胞的相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與miR-NC+MUT-circATRNL1組比較，miR-181a-5p+ MUT-circATRNL1組HK-2細胞的相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。pcDNA-circATRNL1組HK-2細胞中miR-181a-5p表達水平顯著低于pcDNA組(P<0.05)；si-circATRNL1組HK-2細胞中miR-181a-5p表達水平顯著高于si-NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3、4，圖2。

表3 雙熒光素酶報告實驗

表4 circATRNL1調(diào)控miR-181a-5p表達

圖2 circATRNL1的序列中含有與miR-181a-5p互補的核苷酸序列

2.4 干擾miR-181a-5p表達對高糖誘導的HK-2細胞損傷的影響 與HG+anti-miR-NC組比較，HG+anti-miR-181a-5p組HK-2細胞中miR-181a-5p表達水平、凋亡率、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達顯著降低(P<0.05)，細胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6水平顯著降低(P<0.05)。見表5，圖3。

表5 干擾miR-181a-5p表達對高糖誘導的HK-2細胞損傷的影響

2.5 上調(diào)miR-181a-5p表達逆轉了circATRNL1過表達對高糖誘導HK-2細胞損傷的作用 與HG+pcDNA

-circATRNL1+miR-NC組比較，HG+pcDNA-circATRNL1+miR-181a-5p組HK-2細胞中miR-181a-5p表達、凋亡率、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達顯著升高(P<0.05)，細胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6水平顯著升高(P<0.05)。見圖4，表6。

表6 上調(diào)miR-181a-5p表達逆轉了circATRNL1過表達對高糖誘導的HK-2細胞損傷的作用

3 討論

越來越多的研究表明circRNA在DN的發(fā)病機制中起著關鍵作用。Wang等[9]報道circ_0037128在DN模型和高糖處理的系膜細胞中表達明顯增加，且敲減circ_0037128可抑制系膜細胞增殖和纖維化。Yao等[10]觀察到circ_0000285通過靶向miR-654-3p激活絲裂原活化蛋白激酶6可促進高糖誘導的足細胞炎性反應。An等[11]發(fā)現(xiàn)干擾circ_0003928表達通過上調(diào)miR-151-3p抑制高糖誘導的HK-2細胞氧化應激和炎性反應，本研究結果顯示高糖誘導后HK-2細胞circATRNL1表達顯著下調(diào)，提示circATRNL1可能在DN的發(fā)病機制中起重要作用。功能分析顯示，過表達circATRNL1可抑制高糖誘導的HK-2細胞凋亡以及炎性因子TNF-α、IL-6的釋放。caspase9和caspase3分別是細胞凋亡的啟動因子和效應因子，研究報道高糖刺激可激活caspase級聯(lián)反應，誘導caspase9和caspase3活化，促進HK-2細胞凋亡[12,13]。本研究中過表達circATRNL1顯著抑制高糖誘導的Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達上調(diào)，表明circATRNL1通過抑制caspase依賴凋亡途徑抑制高糖誘導的HK-2細胞凋亡。因此，circATRNL1對高糖誘導的HK-2細胞損傷具有保護作用，這與circATRNL1在骨關節(jié)炎中的抗炎、抗凋亡作用[7]一致。

miR-199a-3p在各種疾病中調(diào)控細胞凋亡和炎性反應。研究顯示鏈脲霉素誘導大鼠胰島素瘤細胞中miR-199a-3p表達下調(diào)，過表達miR-199a-3p可抑制鏈脲霉素誘導的氧化應激和細胞凋亡[14]。miR-199a-3p還作為長鏈非編碼RNA小核RNA宿主基因1(SNHG1)的下游靶點介導敲低SNHG1對帕金森病模型細胞損傷的保護作用[15]。然而，miR-199a-3p在急性腦缺血患者、大腦中動脈閉塞(MCAO)模型小鼠、糖氧剝奪復氧誘導的神經(jīng)細胞中高表達，抑制其表達可減少MCAO小鼠腦梗死面積、損傷神經(jīng)元數(shù)量，并減少糖氧剝奪復氧誘導的神經(jīng)細胞凋亡[16]，還可改善高糖誘導的心肌細胞氧化應激和炎性反應[17]，這可能與miR-199a-3p在不同細胞中通過不同機制調(diào)控凋亡和炎性反應有關。本研究發(fā)現(xiàn)高糖誘導后HK-2細胞miR-199a-3p表達顯著上調(diào)，抑制其表達可抑制caspase9和caspase-3激活，抑制高糖誘導的HK-2細胞凋亡和炎性因子釋放，由于雙熒光素酶報告實驗證實miR-199a-3p是circATRNL1的直接靶點，RT-qPCR檢測證實circATRNL1對miR-199a-3p具有靶向負性調(diào)控作用，且過表達circATRNL1和抑制miR-199a-3p表達對高糖誘導HK-2損傷的保護作用類似，提示可能存在circATRNL1/miR-199a-3p途徑。深入研究顯示，過表達miR-199a-3p可減弱過表達circATRNL1對高糖誘導HK-2損傷的保護作用，這進一步證實circATRNL1至少通過靶向miR-199a-3p調(diào)控DN進展。

綜上所述，circATRNL1通過抑制細胞凋亡和炎性反應可減輕高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷，其機制與靶向下調(diào)miR-199a-3p表達有關，circATRNL1和miR-199a-3p是DN的潛在有效治療靶點。