宏基因組二代測(cè)序在中性粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱的腫瘤患者中的臨床應(yīng)用與價(jià)值

?，摤?，朱斌

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥劑科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

中性粒細(xì)胞缺乏（粒缺）伴發(fā)熱患者是一個(gè)特殊的疾病人群。由于患者免疫功能低下、炎癥相關(guān)臨床癥狀和體征常不明顯，病原菌及感染灶也不明確，如未及時(shí)給予恰當(dāng)?shù)目咕幬镏委煟蓪?dǎo)致相關(guān)感染的死亡率較高［1］。而早期精準(zhǔn)的抗病原學(xué)治療，可以幫助醫(yī)生和臨床藥師及時(shí)優(yōu)化抗菌藥物和抗病毒藥物的使用，提高藥物的有效性，改善患者的預(yù)后。傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)受多種因素影響，具有陽(yáng)性率低、耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)檢測(cè)人員水平要求高等問題，進(jìn)而可導(dǎo)致診斷延遲或疏漏等問題［2］。宏基因組二代測(cè)序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）能直接檢測(cè)標(biāo)本中的全核酸片段，經(jīng)生物信息學(xué)分析，可鑒定標(biāo)本中的核酸的種類，并可獲得病原體的序列數(shù)、覆蓋度等定量分析數(shù)據(jù)［3］。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，mNGS具有病原覆蓋度廣、靈敏度高、無需培養(yǎng)、利于發(fā)現(xiàn)新的病原體等優(yōu)勢(shì)［4-5］。目前，mNGS用于重癥感染患者較多，但針對(duì)腫瘤患者出現(xiàn)粒缺伴發(fā)熱的臨床應(yīng)用相對(duì)較少。因此，本研究通過分析1例腫瘤患者放化療后粒缺伴發(fā)熱的治療過程，探討mNGS在有粒缺伴發(fā)熱癥狀的腫瘤患者中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 病例資料

患者1例，男性，58歲，在無明顯誘因下，于2020年1月出現(xiàn)咳嗽咳痰癥狀并逐漸加重，經(jīng)確診為右肺非小細(xì)胞肺癌后，在本院行依托泊苷注射液聯(lián)合順鉑同步化療，2個(gè)療程后患者因出現(xiàn)嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)拒絕繼續(xù)化療，此后定期進(jìn)行復(fù)查隨訪。患者于2021年4月復(fù)查發(fā)現(xiàn)雙肺多發(fā)轉(zhuǎn)移，腰椎、骶骨轉(zhuǎn)移及腦轉(zhuǎn)移，患者于5月17～20日行腦轉(zhuǎn)移灶放療（病史中并未詳細(xì)記載患者放療的劑量）；5月17～28日行骨轉(zhuǎn)移灶放療，并于5月21日排除化療禁忌后給予注射用奧沙利鉑聯(lián)合依托泊苷注射液化療。6月1日血常規(guī)結(jié)果顯示：白細(xì)胞（white blood cell，WBC）0.08×109/L，紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）2.20×1012/L，血紅蛋白（hemoglobin，HGB）69g/L，血小板（platelet，PLT）50×109/L。因患者出現(xiàn)Ⅳ度粒缺伴發(fā)熱，Ⅱ度血小板減少，于2021年6月1日轉(zhuǎn)入重癥監(jiān)護(hù)室（intensive care unit，ICU）進(jìn)一步治療。

患者轉(zhuǎn)入ICU后，精神萎靡，體溫37.7℃，血常規(guī)顯示W(wǎng)BC＜0.4×109/L，中性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)（absolute neutrophil count， ANC）未測(cè)出，HGB 60g/L，PLT 37×109/L；血液標(biāo)本生化結(jié)果顯示C反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）280mg/L，降鈣素原（procalcitonin，PCT）11ng/ml。同時(shí)，患者大便次數(shù)增多（10次/天），主要為黃色稀水樣便。血液標(biāo)本生化結(jié)果顯示患者存在低鉀血癥和低鈉血癥。

從各項(xiàng)檢查指標(biāo)及臨床表現(xiàn)提示患者為Ⅳ度粒缺伴發(fā)熱、腹瀉等感染癥狀，同時(shí)合并貧血及PLT減少，故給予重組人粒細(xì)胞刺激因子注射液300μg，qd，升白治療；重組人血小板生成素注射液15 000U，qd，升血小板治療；蒙脫石散3g，tid，止瀉治療。醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)性使用注射用亞胺培南西司他丁鈉1g，q8h+注射用醋酸卡泊芬凈50mg，qd+注射用替加環(huán)素100mg，q12h聯(lián)合抗感染治療；同時(shí)完善血培養(yǎng)、大便、尿液培養(yǎng)、血液mNGS測(cè)序，明確病原菌?；颊呷胱CU后抗感染治療見表1。

表1 患者入住ICU后抗感染治療情況

2 結(jié)果

2.1 患者血液mNGS檢測(cè)結(jié)果

2021年6月3日患者血液mNGS檢測(cè)結(jié)果顯示革蘭陰性菌感染，菌株為解肝素?cái)M桿菌，相對(duì)豐度為28.5%；同時(shí)存在病毒感染，主要是人巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）感染，相對(duì)豐度為47.5%（見表2）。根據(jù)mNGS檢測(cè)結(jié)果，臨床藥師建議患者加用抗病毒藥物更昔洛韋。

表2 血液mNGS檢驗(yàn)結(jié)果

2021年6月8日患者經(jīng)重組人粒細(xì)胞刺激因子注射液300μg，qd治療后，WBC和ANC均較之前升高，而血小板計(jì)數(shù)持續(xù)降低（8×109/L）。因此，醫(yī)生在重組人血小板生成素注射液15 000U，qd的基礎(chǔ)上加用馬來酸阿伐曲泊帕片60mg，qd，升血小板治療。為了避免患者出現(xiàn)出血等癥狀，同時(shí)輸注血小板?；颊咴诩佑名}酸洛哌丁胺膠囊4mg后大便減少，且無腹瀉癥狀?；颊呓?jīng)繼續(xù)抗感染和抗病毒治療后，其感染指標(biāo)CRP和PCT水平均較之前明顯下降。

2021年6月10日實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌培養(yǎng)為嗜麥芽窄單胞菌和陰溝腸桿菌陰溝亞種。2021年6月11日患者經(jīng)升白、升血小板藥物治療后好轉(zhuǎn)，腹瀉和感染等癥狀得到較好的控制，各項(xiàng)體征趨于平穩(wěn)。轉(zhuǎn)入普通病房后，根據(jù)6月10日的藥敏結(jié)果調(diào)整抗感染藥物（鹽酸左氧氟沙星注射液50mg，qd+注射用哌拉西林鈉他唑巴坦鈉4.5g，q8h），繼續(xù)治療5天后出院。

2.2 患者血象檢查結(jié)果

患者轉(zhuǎn)入ICU后（6月1～11日）血象檢查結(jié)果見圖1。由圖1A可見，6月1日患者因粒缺伴發(fā)熱轉(zhuǎn)入ICU后經(jīng)重組人粒細(xì)胞刺激因子積極升白治療后，WBC和ANC均逐漸升高達(dá)到正常。由圖1B可見， 6月1日患者PLT下降至37×109/L，使用重組人血小板生成素4天后降至8×109/L，加用馬來酸阿伐曲泊帕片和輸注血小板治療后PLT逐漸升高。

圖1 治療過程中患者外周血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)（6月1～11日）

2.3 患者感染指標(biāo)結(jié)果

患者轉(zhuǎn)入ICU后感染指標(biāo)變化見圖2。由圖2A可見，6月1日患者出現(xiàn)粒缺伴發(fā)熱，醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)性使用注射用亞胺培南西司他丁鈉+注射用醋酸卡泊芬凈+注射用替加環(huán)素聯(lián)合抗感染治療后CRP逐漸下降。由圖2A可見，PCT由6月1日的0.212ng/ml迅速上升到11ng/ml，根據(jù)血液mNGS結(jié)果于6月3日加用抗病毒藥物更昔洛韋后，PCT逐漸下降至正常。

圖2 治療過程中患者CRP和PCT變化趨勢(shì)（6月1～11日）

2.4 患者入院后的主要藥物治療

患者入院后，給予其抗感染治療，同時(shí)根據(jù)其臨床癥狀進(jìn)行對(duì)癥治療，抗感染治療藥物見表1。6月1日經(jīng)驗(yàn)性治療使用注射用亞胺培南西司他丁鈉+注射用醋酸卡泊芬凈+注射用替加環(huán)素覆蓋陰性菌、陽(yáng)性菌和真菌；6月2日患者PCT從0.212ng/ml上升到11ng/ml，提示其感染加重；6月3日mNGS結(jié)果顯示患者存在CMV感染，故調(diào)整治療方案，加用抗病毒藥物更昔洛韋；6月3日至轉(zhuǎn)出ICU期間，患者的感染指標(biāo)水平持續(xù)下降，提示加用更昔洛韋抗病毒治療對(duì)患者的感染起到了一定的控制作用。

3 討論

3.1 粒缺伴發(fā)熱癥狀的經(jīng)驗(yàn)性治療

《中國(guó)中性粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱患者抗菌藥物臨床應(yīng)用指南》［1］（2020年版，以下簡(jiǎn)稱“指南”） 指出，超過80%的血液腫瘤患者和10%～50%的實(shí)體腫瘤患者經(jīng)化療（≥1個(gè)療程）后會(huì)出現(xiàn)與粒缺有關(guān)的發(fā)熱。粒缺伴發(fā)熱患者的臨床表現(xiàn)常不典型，感染部位不明顯或難以發(fā)現(xiàn)，病原菌培養(yǎng)陽(yáng)性率低。50%感染部位明確的患者中，最常見的感染部位是肺，其后依次為上呼吸道、肛周和血液等［6-8］。

我國(guó)粒缺伴發(fā)熱患者的流行病學(xué)資料大多來源于血流感染數(shù)據(jù)，病原菌主要以革蘭陰性桿菌為主，占50%以上［1］。革蘭陰性桿菌感染的主要病原菌為大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌，革蘭陽(yáng)性球菌感染的最常見病原菌為葡萄球菌［9-11］。治療開始前進(jìn)行危險(xiǎn)分層并確定患者的感染部位，后續(xù)經(jīng)驗(yàn)性選擇治療粒缺伴發(fā)熱患者的抗菌藥物至關(guān)重要。抗菌藥物的經(jīng)驗(yàn)選擇原則是覆蓋可迅速引起嚴(yán)重并發(fā)癥或威脅生命的最常見和毒力較強(qiáng)的病原菌，同時(shí)結(jié)合醫(yī)院及科室感染的流行病學(xué)覆蓋耐藥菌，直至獲得準(zhǔn)確的病原學(xué)結(jié)果。

3.1.1 粒缺伴發(fā)熱合并革蘭陽(yáng)性菌感染

參考指南［1］，在以下幾種情況下初始經(jīng)驗(yàn)治療需要考慮覆蓋革蘭陽(yáng)性菌：① 在最終鑒定結(jié)果及藥敏試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告前，血培養(yǎng)結(jié)果顯示革蘭陽(yáng)性球菌感染。② 臨床疑有嚴(yán)重的相關(guān)導(dǎo)管感染。③任意部位的皮膚或軟組織感染。④耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐萬古霉素腸球菌或耐青霉素肺炎鏈球菌定植。⑤嚴(yán)重黏膜炎且已接受氟喹諾酮類藥物預(yù)防和頭孢他啶經(jīng)驗(yàn)性治療。若該患者不存在以上任何一種情況，同時(shí)其mNGS未測(cè)得革蘭陽(yáng)性菌，不予考慮使用萬古霉素覆蓋革蘭陽(yáng)性菌。

3.1.2 粒缺伴發(fā)熱合并革蘭陰性菌感染

指南［1］中，針對(duì)革蘭陰性菌、粒缺伴發(fā)熱患者升階梯策略的經(jīng)驗(yàn)性抗菌藥物常選擇頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦或頭孢哌酮舒巴坦，降階梯策略的經(jīng)驗(yàn)性抗菌藥物則以碳青霉烯類抗菌藥物為主［1］。

本病例于肺癌放化療后出現(xiàn)粒缺伴發(fā)熱、嚴(yán)重腹瀉等癥狀。入院前后白蛋白水平一直較低（23～48mg/L），且CRP和PCT水平均較高，提示患者長(zhǎng)期處于營(yíng)養(yǎng)不良狀態(tài)，并存在嚴(yán)重感染。因患者無明確的感染部位，且無病原菌診斷結(jié)果。參考指南［1］，考慮患者具有復(fù)雜的臨床表現(xiàn)，應(yīng)經(jīng)驗(yàn)性使用碳青霉烯類抗菌藥物覆蓋革蘭陰性菌?；颊邽榉伟┩砥冢霈F(xiàn)粒缺伴發(fā)熱后轉(zhuǎn)入ICU，并存在耐藥菌感染的危險(xiǎn)因素。本院ICU常見的耐藥菌為多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌，故經(jīng)驗(yàn)性治療考慮碳青霉烯類藥物聯(lián)合注射用替加環(huán)素覆蓋耐藥菌株。本病例于6月1日轉(zhuǎn)入ICU后進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和血液mNGS測(cè)序，結(jié)果提示患者存在革蘭陰性菌（解肝素?cái)M桿菌）感染。因此，選擇注射用亞胺培南西司他丁鈉聯(lián)合注射用替加環(huán)素治療該患者符合指南中經(jīng)驗(yàn)性選擇抗菌藥物的治療原則。對(duì)于一般患者，抗菌藥物治療無效時(shí)，可以考慮抗真菌藥物治療。但對(duì)于ICU的患者，把握好治療時(shí)機(jī)至關(guān)重要，同時(shí)應(yīng)聯(lián)合抗真菌藥物注射用醋酸卡泊芬凈治療。

3.1.3 粒缺伴發(fā)熱合并CMV感染

mNGS檢測(cè)結(jié)果顯示，患者同時(shí)合并CMV感染。CMV屬于皰疹科病毒，在普通人群中感染率較高，大多數(shù)呈臨床不顯性感染或潛伏感染，對(duì)于免疫力低下者易致嚴(yán)重病癥甚至致死性疾?。?2］。因惡性腫瘤患者的自身免疫功能低于正常人，經(jīng)放化療后其免疫力低下，體內(nèi)潛伏的CMV可能被激活進(jìn)而引起嚴(yán)重的感染，導(dǎo)致病情加重，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［13］。本病例處于肺癌晚期，使用注射用奧沙利鉑+依托泊苷注射液聯(lián)合化療后出現(xiàn)粒缺伴發(fā)熱癥狀，免疫力低下，易使CMV激活從而誘發(fā)感染。同時(shí)，mNGS檢測(cè)結(jié)果顯示患者存在CMV感染，故加用更昔洛韋抗病毒治療。經(jīng)治療后患者的感染指標(biāo)水平明顯下降。

3.2 mNGS的臨床應(yīng)用價(jià)值

3.2.1 mNGS的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

mNGS作為一種獨(dú)立于微生物培養(yǎng)之外的新型檢測(cè)手段，以其高通量、耗時(shí)短、無偏倚的特點(diǎn)在臨床工作中已逐漸得到認(rèn)可，不僅可用于多種病原體的檢測(cè)，如細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等，也可用于多種標(biāo)本的檢測(cè)，如痰液、血液、腦脊液、肺泡灌洗液、組織等［14］，與傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比表現(xiàn)出了良好性能。從接收樣本到完成數(shù)據(jù)分析，mNGS的周轉(zhuǎn)時(shí)間為6h～7天，平均在48h左右［15-16］。與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)相比，mNGS大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，不僅為醫(yī)生使用抗菌藥物提供了用藥依據(jù)，而且能夠更好地把握用藥時(shí)機(jī)。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)［17］，mNGS有以下3個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)：①mNGS的敏感性高于傳統(tǒng)培養(yǎng)，在結(jié)核、真菌、病毒和厭氧菌診斷方面優(yōu)勢(shì)更明顯。②抗菌藥物使用對(duì)mNGS的影響小于傳統(tǒng)培養(yǎng)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果可以調(diào)整抗菌藥物的治療方案。③mNGS對(duì)免疫抑制宿主感染的病原體診斷具有重要的參考價(jià)值，在病毒和細(xì)菌診斷方面mNGS陽(yáng)性率是傳統(tǒng)方法的3倍以上，同時(shí)mNGS比傳統(tǒng)方法具有更高的陰性預(yù)測(cè)值［18］。

3.2.2 mNGS在重癥感染患者中的應(yīng)用

目前，mNGS已經(jīng)納入的病原體有8000余種，其中包括3000余種細(xì)菌、4000余種病毒、200余種真菌和140余種寄生蟲，為疑難危重癥及罕見病原微生物感染的診斷提供了有效的技術(shù)手段［19］。對(duì)于膿毒癥、免疫抑制宿主并發(fā)嚴(yán)重感染、重癥肺部感染等疾病二代測(cè)序具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，能夠快速、精準(zhǔn)地找到病原體；另外，對(duì)于抗菌藥物治療方案的制定和治療效果的評(píng)估具有一定的指導(dǎo)作用［20-21］。

3.2.3 mNGS在腫瘤患者粒缺伴發(fā)熱中的應(yīng)用

《宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)》［22］（2021年版）已建議將mNGS用于嚴(yán)重感染性疾病，尤其是免疫受損的患者。且Tang等［23］研究表明，mNGS在原發(fā)性免疫缺陷患者的病原診斷，尤其是條件致病菌和混合感染方面具有優(yōu)勢(shì)。粒缺伴發(fā)熱屬于血液系統(tǒng)疾病治療中的常見急重并發(fā)癥，早期有效的治療能縮短病程、降低病死率。康磊等［24］通過對(duì)56例粒缺伴發(fā)熱的白血病患者使用mNGS和傳統(tǒng)病原檢測(cè)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)mNGS對(duì)患者常見病原菌的陽(yáng)性檢出率高于傳統(tǒng)病原檢測(cè)（80.4% vs 58.9%），對(duì)真菌或細(xì)菌合并EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）和CMV在內(nèi)的混合感染的檢出率也遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)病原檢測(cè)，這與Fang等［25］的研究結(jié)果基本一致。朱珊等［26］對(duì)116例粒缺伴發(fā)熱患兒的病原體進(jìn)行mNGS檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率達(dá)67.2%，且檢測(cè)到的病原體種類多，具有高效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。提示mNGS可以作為傳統(tǒng)檢測(cè)手段的補(bǔ)充檢查，在粒缺伴發(fā)熱腫瘤患者的治療中具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，對(duì)于粒缺伴發(fā)熱的患者，盡快明確病原菌對(duì)抗菌藥物的選擇至關(guān)重要。對(duì)于傳統(tǒng)粒缺伴發(fā)熱患者的常見病原菌，醫(yī)生根據(jù)經(jīng)驗(yàn)往往僅會(huì)考慮細(xì)菌或真菌，而忽略病毒。對(duì)于惡性腫瘤患者而言，其自身免疫力均低于正常人，尤其是放化療后患者的免疫功能會(huì)變得更差，而此時(shí)人體內(nèi)潛伏的CMV會(huì)被激活且大量復(fù)制，可能會(huì)造成感染器官的損傷甚至危及生命，因此不能忽略病毒感染這一關(guān)鍵因素。mNGS可以對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒等多種病原體進(jìn)行檢測(cè)，且檢測(cè)周期較短，可以快速明確地診斷多種病原菌，為臨床用藥提供參考依據(jù)。