雙清平化方對代謝綜合征大鼠骨骼肌自噬通路蛋白表達(dá)的影響

付文浩，田春雨，喇孝瑾，張國偉，張 敏，王瑤瑤，陳瑞軍，王秀萍，李繼安*

雙清平化方對代謝綜合征大鼠骨骼肌自噬通路蛋白表達(dá)的影響

付文浩1, 2，田春雨1，喇孝瑾1，張國偉1，張 敏1，王瑤瑤1，陳瑞軍1，王秀萍3，李繼安1*

1. 華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 河北省中西醫(yī)結(jié)合防治糖尿病及其并發(fā)癥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063210 2. 涉縣中醫(yī)院，河北 邯鄲 056400 3. 河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所，河北 唐山 063210

觀察雙清平化方對代謝綜合征大鼠Lee’s指數(shù)、血糖、血脂及骨骼肌哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、自噬效應(yīng)蛋白1（Beclin1）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3）蛋白表達(dá)的影響，探討其改善糖脂代謝的作用機(jī)制。大鼠給予高脂飼料加10%果糖水溶液喂養(yǎng)，并聯(lián)合應(yīng)用-硝基--精氨酸甲酯（-nitro--arginine methyl ester，-NAME）及鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)代謝綜合征模型。代謝綜合征大鼠給予雙清平化方或二甲雙胍干預(yù)8周，實(shí)驗(yàn)前后定期測量大鼠體質(zhì)量、體長、腹圍、血壓、糖耐量、糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin，GHb）、胰島素（insulin，INS）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C），計(jì)算葡萄糖曲線下面積（OGTT-AUC）和胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察骨骼肌組織病理形態(tài)學(xué)變化；采用Masson染色觀察骨骼肌纖維形態(tài)變化；采用免疫組化法檢測骨骼肌組織中LC3蛋白表達(dá)；采用Western blotting檢測骨骼肌組織中mTOR、Beclin1和LC3蛋白表達(dá)。與對照組比較，模型組大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、餐后2 h血糖（2 h postprandial glucose，PG2h）、OGTT-AUC、HOMA-IR、INS、GHb、TC、TG及LDL-C水平均顯著升高（＜0.01），HDL-C水平顯著降低（＜0.01）；骨骼肌組織中mTOR蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（＜0.01），Beclin1、LC3蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（＜0.01）。與模型組比較，雙清平化方組FBG、PG2h、OGTT-AUC、HOMA-IR、INS、GHb、TC、TG及LDL-C水平均顯著降低（＜0.05、0.01），HDL-C水平顯著升高（＜0.01）；骨骼肌組織中mTOR蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（＜0.01），Beclin1和LC3蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（＜0.01）。雙清平化方可以改善代謝綜合征大鼠胰島素抵抗，改善糖脂代謝水平，抑制骨骼肌病理變化，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)骨骼肌自噬，激活骨骼肌組織自噬通路中mTOR、Beclin1、LC3蛋白表達(dá)有關(guān)。

雙清平化方；代謝綜合征；骨骼??；自噬；胰島素抵抗

代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）是肥胖并伴有高血壓及糖、脂代謝異常癥候群，是心腦血管病的主要危險(xiǎn)因素[1-3]。目前，我國老年人群中MS患病率已達(dá)25.5%，預(yù)計(jì)到2035年成人MS患病率可達(dá)35%～50%[4-5]。因此，預(yù)防和治療MS已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。胰島素抵抗是MS發(fā)病的重要病理基礎(chǔ)，而骨骼肌是胰島素抵抗的重要靶組織。研究顯示自噬與胰島素抵抗密切相關(guān)，并參與了胰島素抵抗的發(fā)生與進(jìn)展。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的治療方案尚停留在對癥治療以及延緩疾病進(jìn)展的階段，糾正代謝紊亂是治療MS的研究方向。根據(jù)臨床MS病證分析，肝胃火旺、痰濁不化為其常見病證，本課題組依據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)和藥理實(shí)驗(yàn)總結(jié)出防治該證的雙清平化方[6]。推測是否通過調(diào)節(jié)骨骼肌自噬，進(jìn)而改善骨骼肌能量的穩(wěn)態(tài)及胰島素抵抗。為此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建MS大鼠模型，以不同劑量雙清平化方進(jìn)行干預(yù)，觀察其對模型大鼠Lee’s指數(shù)、血壓、血糖、血脂、糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin，GHb）、胰島素（insulin，INS）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）的影響及骨骼肌組織病理形態(tài)學(xué)、骨骼肌組織中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、自噬效應(yīng)蛋白1（Beclin1）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3）蛋白表達(dá)的變化，探討雙清平化方改善MS大鼠糖脂代謝的作用機(jī)制，為其治療MS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

1.2 藥材

雙清平化方組成為桑葉、蒲公英、生山楂、決明子、萊菔子、夏枯草、葛根、海藻粉、炒蕎麥粉、珍珠粉。蒲公英購自河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所，其余藥材均購自于唐山市北京同仁堂藥店，經(jīng)華北理工大學(xué)田春雨教授鑒定桑葉為?？浦参锷.的干燥葉，蒲公英為菊科植物堿地蒲公英Kitam.的干燥全草，生山楂為薔薇科植物山楂Bge.的干燥成熟果實(shí)，決明子為豆科植物決明L.的干燥成熟種子，萊菔子為十字花科植物蘿卜L.的干燥成熟種子，夏枯草為唇形科植物夏枯草L.的干燥果穗，葛根為豆科植物野葛(Wild.) Ohwi的干燥根，海藻為馬尾藻科植物海蒿子(Tum.) C. Ag.的干燥藻體，炒蕎麥為蓼科植物蕎麥Moench.的干燥成熟種子，珍珠粉為珍珠貝科動物馬氏珍珠貝(Dunker)受刺激形成的珍珠粉末。

1.3 藥品與試劑

普通飼料[豫飼證（2008）25540]購自北京環(huán)宇中科生物科技有限公司；高脂飼料（批號SN10141）購自賽諾生物科技有限公司；對照品綠原酸（批號110753-202018）、咖啡酸（批號110885-201703）、菊苣酸（批號111752-202104）、葛根素（批號110752-201816）均購自中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98%；鹽酸二甲雙胍片（批號190401）購自中美上海施貴寶制藥有限公司；組織固定液（批號MA0192）購自大連美侖生物科技有限公司；GHb試劑盒（批號20191008）、INS試劑盒（批號H203-1-2）、TC試劑盒（批號：20190930）、TG試劑盒（批號20190929）、LDL-C試劑盒（批號20190929）、HDL-C試劑盒（批號20190930）均購自南京建成生物工程研究所；-硝基--精氨酸甲酯（-nitro--arginine methyl ester，-NAME，批號A7088-25）購自APE BIO Technology LLC公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，批號BJBAG2001）購自北京博愛港生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號A91041）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；快速十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒（批號ZD304）購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；β-actin抗體（批號9100026001）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；mTOR抗體（批號20657-1-AP）、Beclin1抗體（批號11306-1-AP）、LC3抗體（批號14600-1-AP）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號10226187）購自美國Seracare公司。

1.4 儀器

1OH55IH1538型穩(wěn)益血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）；TP1020型組織脫水機(jī)、RM2245型組織切片機(jī)（德國Leica公司）；電泳儀、成像系統(tǒng)ChemiDocTM CXRS＋System（美國Bio-Rad公司）；M200PR0型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；正置顯微鏡（日本Olympus公司）；LC-20A型液相色譜儀（日本島津公司）。

2 方法

2.1 雙清平化方的制備

取桑葉10 g、蒲公英30 g、生山楂20 g、決明子10 g、萊菔子10 g、夏枯草20 g、葛根20 g、海藻粉3 g、炒蕎麥粉30 g、珍珠粉1 g，打成粗末，加6倍量的水浸泡1 h后，煎煮1.5 h，濾過，藥渣再加入4倍量的水煎煮1.5 h，濾過，混合2次水煎液，低溫高速離心2 h，取上清液，于100 ℃的水浴鍋中濃縮。經(jīng)高效液相色譜檢測，主要含葛根素0.30%、綠原酸0.034%、咖啡酸0.0096%和菊苣酸0.065%。

2.2 造模、分組及給藥

60只雄性SD大鼠給予普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對照組（10只）和造模組（50只），對照組給予普通飼料及純水，造模組給予高脂飼料及10%果糖水溶液喂養(yǎng)，飼養(yǎng)至第11周實(shí)驗(yàn)組大鼠ig-NAME（20 mg/kg）2周，并于第13周ip STZ（30 mg/kg），對照組ig等體積生理鹽水并ip枸櫞酸鈉緩沖液。實(shí)驗(yàn)第8、12、14周測量各組大鼠體長、體質(zhì)量、腹圍，并根據(jù)公式計(jì)算Lee’s指數(shù)[7]；實(shí)驗(yàn)第0、4、8、12、14周測量各組大鼠血壓。第14周評估成模情況[7-8]，評價(jià)指標(biāo)為①中心性肥胖：Lee’s指數(shù)或體質(zhì)量及腰圍顯著變化；②高血壓：收縮壓或舒張壓顯著變化；③高血糖：11.1 mmol/L＜空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）＜16.7 mmol/L或餐后2 h血糖（2 h postprandial glucose，PG2h）＞16.7 mmol/L。

將成模大鼠按血糖隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍（0.18 g/kg）組和雙清平化方低、中、高劑量（3.47、6.93、13.38 g/kg，分別相當(dāng)于臨床劑量的0.5、1、2倍）組，每組各10只[9]。各給藥組ig相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)8周。

2.3 血清學(xué)檢測

藥物干預(yù)前及干預(yù)第4、8周末尾靜脈采血，檢測大鼠FBG及PG2h；計(jì)算葡萄糖曲線下面積（OGTT-AUC）和胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。于藥物干預(yù)第8周末，ip 10%水合氯醛-氨基甲酸乙酯（1 mL/kg）[10]，腹主動脈采血，離心后取血清，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的檢測。

2.4 骨骼肌組織病理變化觀察

采血后立即取大鼠雙側(cè)后肢腓腸肌，于4%多聚甲醛中固定，固定完成后進(jìn)行脫水、包埋、切片以及脫蠟，按蘇木素-伊紅（HE）染液試劑盒說明書進(jìn)行HE常規(guī)染色，觀察骨骼肌組織形態(tài)學(xué)變化；按Masson染液試劑盒說明書進(jìn)行Masson染色，觀察骨骼肌組織纖維變化。

比較3個響應(yīng)電流可得,i1>i3>i2。根據(jù)表1,可知(Lc+Lb)>(La+Lc)>(Lb+La),此時轉(zhuǎn)子位于180°～240°電角度區(qū)間。再根據(jù)定位力矩與轉(zhuǎn)子位置的關(guān)系,以及i1與i3大小幾乎相等可知,轉(zhuǎn)子位于180°電角度位置。

2.5 免疫組化檢測骨骼肌組織中LC3蛋白表達(dá)

取“2.4”項(xiàng)下脫蠟后的切片進(jìn)行抗原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化氫酶阻斷，滴加山羊血清封閉，滴加LC3抗體（1∶500），4 ℃孵育過夜，滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG聚合物，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，流水沖洗，蘇木素染色，流水沖洗，1%鹽酸乙醇分化液分化，梯度脫水，二甲苯透明，封片，于顯微鏡下觀察。

2.6 Western blotting檢測骨骼肌組織中mTOR、Beclin1和LC3蛋白表達(dá)

各組大鼠骨骼肌組織剪碎后，放入含蛋白酶抑制劑的裂解液，勻漿提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中封閉2 h，分別加入mTOR（1∶1000）、p-mTOR（1∶1000）、Beclin1（1∶2000）、LC3（1∶1000）抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加入山羊抗兔二抗（1∶5000），搖床孵育2 h，TBST洗滌，進(jìn)行凝膠成像分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果采用Graphpad prism 8.0軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊進(jìn)行兩兩比較，若方差不齊則采用Brown-Forsythe和Welch方差分析。

3 結(jié)果

3.1 MS大鼠成模體長、體質(zhì)量、腹圍、Lee’s指數(shù)和血壓測定

如圖1所示，大鼠飼養(yǎng)4周后體長、體質(zhì)量、腹圍及Lee’s指數(shù)均呈現(xiàn)出增長趨勢，飼養(yǎng)8周后模型組大鼠體質(zhì)量、腹圍、Lee’s指數(shù)與對照組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.05），飼養(yǎng)12、14周后模型組大鼠體長與對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.05），模型組大鼠在造模階段收縮壓和舒張壓從12周開始至14周明顯升高（＜0.01）。

3.2 雙清平化方對MS大鼠FBG和PG2h的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠FBG和PG2h均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，給藥4周后，二甲雙胍組和雙清平化方高劑量組大鼠FBG顯著降低（＜0.01），二甲雙胍組和雙清平化方中、高劑量組PG2h顯著降低（＜0.05、0.01）；給藥8周后，二甲雙胍組和雙清平化方中、高劑量組FBG和PG2h均明顯降低（＜0.05、0.01）。

3.3 雙清平化方對MS大鼠OGTT-AUC、INS、HOMA-IR及GHb的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組大鼠OGTT-AUC、INS、HOMA-IR和GHb均明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，給藥4周后，二甲雙胍組和雙清平化方中、高劑量組OGTT-AUC明顯下降（＜0.05、0.01）；給藥8周后，二甲雙胍組和雙清平化方中、高劑量組OGTT-AUC和HOMA-IR明顯下降（＜0.05、0.01），二甲雙胍組和雙清平化方高劑量組INS和GHb均明顯下降（＜0.01）。

A-對照組 B-模型組 與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，1 mm Hg＝133 Pa

A-對照組 B-模型組 C-二甲雙胍組 D-雙清平化方低劑量組 E-雙清平化方中劑量組 F-雙清平化方高劑量組 與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下圖同

圖3 雙清平化方對MS大鼠OGTT-AUC、INS、HOMA-IR及GHb的影響(, n = 10)

3.4 雙清平化方對MS大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中HDL-C水平顯著降低（＜0.01），TC、TG和LDL-C水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中HDL-C水平顯著升高（＜0.01），TC、TG和LDL-C水平均顯著降低（＜0.01）。

3.5 雙清平化方對MS大鼠骨骼肌組織病理變化的影響

如圖5所示，腓腸肌HE染色后，光鏡下可見細(xì)胞核為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)、肌纖維、膠原纖維和紅細(xì)胞呈深淺不一的紅色。對照組大鼠骨骼肌肌纖維排列整齊、胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核排列正常、形態(tài)規(guī)則；模型組大鼠骨骼肌纖維排列疏松紊亂，胞質(zhì)不勻，細(xì)胞核增多并出現(xiàn)核內(nèi)移，見少量炎細(xì)胞浸潤；與模型組比較，雙清平化方低、中劑量組肌纖維排列有所好轉(zhuǎn)，細(xì)胞核增多，核內(nèi)移減少，炎細(xì)胞浸潤明顯改善；二甲雙胍組和雙清平化方高劑量組纖維排列相對整齊，胞質(zhì)較為均勻，細(xì)胞核形態(tài)有所好轉(zhuǎn)，細(xì)胞核及核內(nèi)移減少，未見炎細(xì)胞浸潤。

圖4 雙清平化方對MS大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的影響 (, n = 10)

圖5 雙清平化方對MS大鼠骨骼肌組織病理變化的影響(×40)

Masson染色結(jié)果顯示，對照組大鼠腓腸肌結(jié)構(gòu)完整，肌纖維排列整齊且形態(tài)規(guī)則，未見明顯萎縮，肌纖維間膠原纖維較少；模型組出現(xiàn)增生的結(jié)締組織，膠原纖維逐漸增多且肌纖維間距因膠原纖維的增生而變寬；與模型組比較，雙清平化方低劑量組膠原纖維減少；雙清平化方中劑量組肌纖維間距縮短，結(jié)締組織和膠原纖維減少；二甲雙胍組和雙清平化方高劑量組肌纖維形態(tài)較規(guī)則，纖維間距縮短，膠原纖維減少，未見增生的結(jié)締組織。

3.6 免疫組化法檢測MS大鼠骨骼肌組織中LC3蛋白表達(dá)

如圖6所示，與對照組比較，模型組大鼠骨骼肌組織中LC3蛋白陽性表達(dá)顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠骨骼肌組織中LC3蛋白陽性表達(dá)均顯著升高（＜0.01）。

3.7 Western blotting檢測MS大鼠骨骼肌組織中mTOR、Beclin1和LC3蛋白表達(dá)

如圖7所示，與對照組比較，模型組大鼠骨骼肌組織中p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），Beclin1和LC3蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，雙清平化方高劑量組大鼠骨骼肌組織中p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），Beclin1和LC3蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）。

圖6 雙清平化方對MS大鼠骨骼肌組織中LC3蛋白表達(dá)的影響

圖7 雙清平化方對MS大鼠骨骼肌組織中p-mTOR、Beclin1和LC3蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

自噬異?？赏ㄟ^內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、促炎癥信號途徑等導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生[11]。骨骼肌是機(jī)體葡萄糖、脂質(zhì)攝取和利用的主要部位，約70%的葡萄糖通過胰島素依賴的方式被骨骼肌攝取利用，同時骨骼肌也是發(fā)生胰島素抵抗的重要靶組織[12]。研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者骨骼肌內(nèi)細(xì)胞器發(fā)生重構(gòu)、外膜細(xì)胞退化及凋亡、肌膜下線粒體減少、肌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積等，在臨床上表現(xiàn)為胰島素抵抗，而自噬異?？赡苁侵饕蛑籟13]。因此，探索MS骨骼肌胰島素抵抗與自噬關(guān)系并指導(dǎo)藥物治療研究具有重要學(xué)術(shù)價(jià)值。改善胰島素抵抗是治療和預(yù)防MS的重要策略，從調(diào)節(jié)自噬途徑研究中藥改善胰島素抵抗也是一個新的研究方向。骨骼肌自噬對血糖、血脂比較敏感，高糖、高脂可激活mTOR誘導(dǎo)的自噬活性降低，表現(xiàn)為自噬體形成的標(biāo)志物L(fēng)C3II的表達(dá)減少[14]；Bloemberg等[15]研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌細(xì)胞mTOR活性升高可抑制細(xì)胞自噬信號通路，參與了MS的發(fā)病。mTOR、Beclin1和LC3是自噬通路中主要標(biāo)志物，可用于評價(jià)組織細(xì)胞自噬水平[16]。mTOR是負(fù)性調(diào)節(jié)自噬的重要信號，mTOR被抑制時可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[17]；Beclin1又名Atg6，作為自噬通路上的一個平臺蛋白，通過與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）形成新復(fù)合物來調(diào)節(jié)其他ATG蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中定位，進(jìn)而促進(jìn)自噬體膜的形成并調(diào)節(jié)自噬活性[18]；LC3是定位在雙層膜和自噬體的特異性信號蛋白，可剪切為LC3Ⅰ和LC3II 2種同源物，其中LC3II作為脂質(zhì)化表達(dá)于自噬體膜上，其含量和自噬泡的數(shù)量可以反映組織的自噬水平[19-20]。為此，通過觀察藥物對mTOR、Beclin1和LC3等主要標(biāo)志物表達(dá)的影響及對HOMA-IR、糖脂代謝指標(biāo)的變化，可進(jìn)一步判斷自噬與胰島素抵抗的關(guān)系及藥物對自噬的調(diào)節(jié)作用。

中醫(yī)沒有MS病名，就其臨床特征與中醫(yī)脾癉相類，根據(jù)《黃帝內(nèi)經(jīng)》“肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿”的發(fā)病機(jī)制，結(jié)合臨床證候分析發(fā)現(xiàn)MS患者嗜食肥甘厚味、精神壓力大，形體肥胖且肝陽亢盛者居多，病機(jī)特點(diǎn)為肝胃火旺、氣機(jī)失暢、痰濁不化[12]。針對病機(jī)結(jié)合本課題組多年從肝胃郁熱治療MS經(jīng)驗(yàn)，選擇了藥食同源的中藥組成雙清平化方。方中夏枯草、蒲公英清肝胃郁熱為君藥，桑葉、珍珠粉、決明子、生山楂、萊菔子、海藻粉、炒蕎麥粉助主藥平肝清胃化濁為臣藥，葛根升陽、生津?yàn)樽羰顾?，全方清肝胃郁熱、理氣化濁、升降有序。中藥藥理研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英、桑葉、葛根可有效改善胰島素抵抗[21-22]；夏枯草、草決明、山楂、萊菔子等可有效調(diào)節(jié)血脂、降血壓等，通過理論分析全方配伍具有MS中醫(yī)病機(jī)針對性及調(diào)節(jié)糖脂代謝、改善胰島素抵抗的藥理針對性，并且配方均由藥食同源中藥組成，臨床應(yīng)用具有良好的順應(yīng)性。為此，本研究通過考察雙清平化方對MS大鼠糖脂代謝及對骨骼肌自噬信號蛋白表達(dá)的影響，評價(jià)其藥理效應(yīng)并初步探究其對骨骼肌自噬及胰島素抵抗的作用機(jī)制。

本研究參照文獻(xiàn)方法[7-8]制備MS模型，結(jié)果顯示模型組大鼠體長、體質(zhì)量、腹圍、Lee’s指數(shù)、FBG、PG2h、OGTT-AUC、GHb、HOMA-IR及血脂水平與對照組相比均明顯升高，表明MS大鼠建模成功。雙清平化方干預(yù)后可降低大鼠FBG、PG2h、OGTT-AUC、GHb、HOMA-IR及血脂水平，表明雙清平化方對MS具有調(diào)節(jié)作用并改善胰島素抵抗。通過免疫組化和Western blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠骨骼肌組織中mTOR蛋白表達(dá)上調(diào)，Beclin1和LC3蛋白表達(dá)下調(diào)，骨骼肌出現(xiàn)纖維排列疏松紊亂，胞質(zhì)不勻，細(xì)胞核增多、核內(nèi)移及少量炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，由此表明，高脂高糖誘導(dǎo)的MS模型大鼠骨骼肌存在自噬抑制及炎癥激活現(xiàn)象。雙清平化方組大鼠骨骼肌組織中mTOR蛋白表達(dá)下調(diào)，Beclin1和LC3蛋白表達(dá)上調(diào)，骨骼肌病理具有一定的改善，說明雙清平化方可調(diào)節(jié)MS大鼠骨骼肌自噬信號蛋白的表達(dá)，促進(jìn)高脂高糖環(huán)境下骨骼肌自噬，對于保護(hù)骨骼肌的自身穩(wěn)態(tài)是有益的。

綜上所述，雙清平化方能夠有效改善MS大鼠糖、脂代謝、胰島素抵抗及骨骼肌的自身穩(wěn)態(tài)，其作用機(jī)制可能與下調(diào)mTOR、上調(diào)Beclin1和LC3的蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)骨骼肌自噬水平有關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of Shuangqing Pinghua Recipe on autophagy pathway protein expressions in skeletal muscle of rats with metabolic syndrome

FU Wen-hao1,2, TIAN Chun-yu1, LA Xiao-jin1, ZHANG Guo-wei1, ZHANG Min1, WANG Yao-yao1, CHEN Rui-jun1, WANG Xiu-ping3, LI Ji-an1

1. Hebei Provincial Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Diabetes and Its Complications, Traditional Chinese Medicine College, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, China 2. Shexian Hospital of Traditional Chinese Medicine, Handan 056400, China 3. Institute of Coastal Agriculture, Hebei Academy of Agriculture andForestry Sciences, Tangshan 063210, China

To observe the effects of Shuangqing Pinghua Recipe (雙清平化方, SPR) on Lee’s index, blood glucose, blood lipids and mammalian target of rapamycin (mTOR), Beclin1 and microtubule-associated protein1 light chain 3 (LC3) protein expressions in skeletal muscle of rats with metabolic syndrome, and explore the mechanism of SPR on improving glucose and lipid metabolism.A high-fat diet with 10% fructose water was fed and combined with the application of-nitro--arginine methyl ester (-NAME) and streptozotocin (STZ) to induce metabolic syndrome model. Rats with metabolic syndrome were treated with SPR or metformin for 8 weeks, rats were periodically tested for body weight, body length, abdominal circumference, blood pressure and glucose tolerance, glycosylated hemoglobin (GHb), insulin (INS), total cholesterol (TC), and triglycerides (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), and area under the glucose curve (OGTT-AUC) and insulin resistance index (HOMA-IR) were calculated. Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes of skeletal muscle tissue; Masson staining was used to observe the morphological changes of skeletal muscle fibers; Immunohistochemistry was used to detect the expression of LC3 protein in skeletal muscle tissue; Western blotting was used to detect mTOR, Beclin1 and LC3 protein expressions in skeletal muscle tissue.Compared with control group, fasting blood glucose (FBG), 2 h postprandial glucose (PG2h), OGTT-AUC, HOMA-IR, INS, GHb, TC, TG and LDL-C levels were significantly increased (< 0.01), HDL-C level was significantly decreased (< 0.01) in model group, mTOR protein expression in skeletal muscle tissues was significantly up-regulated (< 0.01), Beclin1 and LC3 protein expressions were significantly down-regulated (< 0.01). Compared with model group, FBG, PG2h, OGTT-AUC, HOMA-IR, INS, GHb, TC, TG and LDL-C levels in SPR group were significantly decreased (< 0.05, 0.01), HDL-C level was significantly increased (< 0.01), mTOR protein expression in skeletal muscle was significantly up-regulated (< 0.01), Beclin1 and LC3 protein expressions were significantly down-regulated (< 0.01).SPR can improve insulin resistance, improve glucose and lipid metabolism, and inhibit the pathological changes of skeletal muscle in rats with metabolic syndrome. Its mechanism may be related to regulating skeletal muscle autophagy and activating mTOR, Beclin1 and LC3 protein expressions.

Shuangqing Pinghua Recipe; metabolic syndrome; skeletal muscle; autophagy; insulin resistance

R285.5

A

0253 - 2670(2022)19 - 6108 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.017

2022-04-28

科技部對發(fā)展中國家常規(guī)性科技援助項(xiàng)目（KY201904005）；唐山市糖尿病中西醫(yī)結(jié)合防治團(tuán)隊(duì)（19130205C）

付文浩（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治代謝綜合征。Tel: 15369076939 E-mail: begoodful@163.com

李繼安，博士生導(dǎo)師，教授，主要從事內(nèi)分泌、糖脂代謝研究。E-mail: lnyy@vip.sina.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]