基于TLR4/NF-κB信號通路研究清開靈口服液防治肺炎的作用機(jī)制

陳紅英，李 新，許 浚，張鐵軍，李 卿，歐陽冬生，徐 旭*

基于TLR4/NF-κB信號通路研究清開靈口服液防治肺炎的作用機(jī)制

陳紅英1, 2，李 新3，許 浚3，張鐵軍3，李 卿3，歐陽冬生1*，徐 旭3*

1. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 臨床藥理研究所，湖南 長沙 410008 2. 廣州白云山明興制藥有限公司，廣東 廣州 510250 3. 天津藥物研究院，天津市中藥質(zhì)量標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗室，天津 300301

基于Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路研究清開靈口服液防治肺部炎癥的作用及機(jī)制。SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組及清開靈口服液低、中、高劑量（4、8、16 mL/kg）組和頭孢氨芐（175 mg/kg）組，各給藥組ig相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)6 d。給藥同時進(jìn)行造模，肺部注射肺炎克雷伯菌菌液造模3 d，對照組肺部注射生理鹽水。給藥結(jié)束后采集大鼠血液、肺泡組織灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），進(jìn)行菌落培養(yǎng)和計數(shù)；采用全自動血液細(xì)胞分析儀檢測白細(xì)胞數(shù)量及中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞比例；采用ELISA法檢測血清中白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-2、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、緩激肽（bradykinin，BK）、單核細(xì)胞趨化因子（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）水平及環(huán)氧化酶-1（cyclooxygenase-1，COX-1）、COX-2活性；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察大鼠肺組織病理變化；采用免疫組化法檢測肺組織TLR4蛋白表達(dá)；采用Western blotting法檢測肺組織磷酸化p65（phosphorylated p65，p-p65）、p65、磷酸化NF-κB抑制因子（phosphorylated inhibitor of NF-κB，p-IκB）和IκB表達(dá)。與模型組比較，清開靈口服液組大鼠全血及BALF中經(jīng)培養(yǎng)后的菌落數(shù)顯著降低（＜0.05）；全血中白細(xì)胞數(shù)目及中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞比例均顯著降低（＜0.05、0.01）；血清中IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、BK、MCP-1水平及COX-1、COX-2活性均顯著降低（＜0.05、0.01）；肺實(shí)質(zhì)中炎性細(xì)胞浸潤、紅細(xì)胞滲出及肺泡上皮細(xì)胞脫落等現(xiàn)象明顯減少；肺組織中TLR4蛋白陽性表達(dá)明顯減少，p-p65/p65和p-IκB/IκB蛋白表達(dá)水平顯著下降（＜0.05、0.01）。清開靈口服液具有抑制肺炎克雷伯菌所致肺炎的作用，其機(jī)制可能與調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)。

肺炎克雷伯菌；肺炎；清開靈口服液；炎癥；Toll樣受體4/核因子-κB信號通路

肺炎克雷伯菌肺炎是由肺炎克雷伯菌引起一種常見的肺炎類型，通常表現(xiàn)為支氣管肺炎和支氣管炎。肺炎克雷伯菌屬于革蘭氏陰性菌，是醫(yī)院內(nèi)感染的主要致病菌，患者多以老人、嬰幼兒、慢性病人、免疫功能低下者為主。由于肺炎克雷伯菌致病性強(qiáng)，且越來越具多重耐藥性[1]，即使采用抗菌治療，也會導(dǎo)致高并發(fā)癥和高死亡率[2]。

清開靈口服液由板藍(lán)根、金銀花、梔子、水牛角、珍珠母、黃芩苷、膽酸、豬去氧膽酸8種中藥材提取而成，處方來源于古代著名方劑安宮牛黃丸，具有清熱解毒、鎮(zhèn)靜安神的作用，用于外感風(fēng)熱、火毒內(nèi)盛所致的發(fā)熱、煩躁不安、咽喉腫痛、舌質(zhì)紅絳、苔黃、脈數(shù)者；上呼吸道感染、病毒性感冒、急性化膿性扁桃體炎、急性咽炎、急性氣管炎、高熱見上述證候者，并記載于《中國藥典》2020年版一部[3]。同處方品種清開靈注射液已被用于中醫(yī)治療新型冠狀病毒（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）[4]。本研究旨在探討清開靈口服液對肺炎克雷伯菌所致肺炎大鼠的抗菌、消炎作用及其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，5～6周齡，體質(zhì)量180～200 g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0010。動物飼養(yǎng)在天津藥物研究院新藥評價有限公司實(shí)驗動物屏障系統(tǒng)SYXK（津）2011-0005，溫度維持在20～26 ℃，相對濕度維持在40%～70%，通風(fēng)次數(shù)為10～15次/h全新風(fēng)，光照為12 h/12 h明暗交替，自由進(jìn)食飲水。動物實(shí)驗獲得天津藥物研究院新藥評價有限公司實(shí)驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號No.2020072801）。

1.2 菌株

肺炎克雷伯菌（ATCC9997）購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.3 藥品與試劑

清開靈口服液（批號1200205，10 mL/支）購自廣州白云山明興制藥有限公司；頭孢氨芐片（批號191001，0.25 g/片）購自天津市中央藥業(yè)公司；大鼠白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）ELISA試劑盒（批號2004061）、IL-2 ELISA試劑盒（批號2003251）、IL-6 ELISA試劑盒（批號2003271）、IL-10 ELISA試劑盒（批號2004283）、環(huán)氧化酶-1（cyclooxygenase-1，COX-1）ELISA試劑盒（批號2004121）、COX-2 ELISA試劑盒（批號2004122）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號2003281）、緩激肽（bradykinin，BK）ELISA試劑盒（批號2004051）、單核細(xì)胞趨化因子-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）ELISA試劑盒（批號2004061）均購自上海西唐生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號15E13B46）、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（批號15I01A38）均購自博士德生物公司；0.22 μm PVDF膜（批號ISEQ00010）購自美國Millipore公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（批號KF005）、β-actin抗體（批號AF7018）、p65抗體（批號AF5006）、磷酸化p65（phosphorylated p65，p-p65）抗體（批號AF2006）、核因子-κB抑制因子（inhibitor of NF-κB，IκB）抗體（批號AF5002）、p-IκB抗體（批號AF2002）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號S0001）均購自美國Affinity公司；Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）抗體（批號ab32536）購自英國Abcam公司。

1.4 儀器

BC-2800Vet型全自動血液細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；DENLEY DRAGON Wellscan MK 3型酶標(biāo)儀、Wellwash 4 MK2型洗板機(jī)、MAXQ2000型水平搖床、Sorvall ST 8R型高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；PowerPac HC型電泳儀、Trans-Blot SD Cell轉(zhuǎn)印儀、ChemiDoc XRS型全自動多功能化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；CHR-100型恒溫金屬?。ㄉ虾０途翆?shí)業(yè)有限公司）；ASP200S型全自動組織脫水機(jī)、G1150H＋C型包埋機(jī)、ARM2235型切片機(jī)、DM4000B型正置熒光顯微鏡（德國Leica公司）。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組及清開靈口服液低、中、高劑量（4、8、16 mL/kg）組和頭孢氨芐（175 mg/kg）組，每組10只。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，各給藥組ig相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig生理鹽水（2 mL/只），1次/d，連續(xù)6 d。給藥同時進(jìn)行造模，除對照組外，其余各組大鼠于給藥后肺內(nèi)注射0.2 mL肺炎克雷伯菌菌液（1×107CFU/mL），對照組給予生理鹽水，1次/d，連續(xù)3 d。

2.2 外周血及支氣管肺泡組織灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）分析

末次給藥后1 h，大鼠麻醉后腹主動脈取血，采用全自動血液細(xì)胞分析儀測定外周血白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞百分比；無菌操作將全血接種至血瓊脂平板中，培養(yǎng)24 h后，于倒置顯微鏡下進(jìn)行菌落計數(shù)。收集肺泡沖洗液，于孵育箱中培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行菌落計數(shù)。

2.3 各組大鼠血清中炎癥因子檢測

取各組大鼠全血，4 ℃、3000 r/min離心10 min，取血清，按照試劑盒說明書測定IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、MCP-1、TNF-α、BK水平和COX-1、COX-2活性。

2.4 肺組織病理觀察

取各組大鼠部分肺組織，于4%多聚甲醛中固定72 h后，石蠟包埋并切片成4 μm厚的薄片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織損傷情況（包括肺泡充血、出血、浸潤或血管壁上的中性粒細(xì)胞聚集）。

2.5 免疫組化法檢測肺組織TLR4蛋白表達(dá)

取各組大鼠部分肺組織，于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片后，經(jīng)檸檬酸鹽抗原修復(fù)、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷、TLR4抗體孵育、DAB顯色、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后，于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，并對其陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

2.6 Western blotting檢測肺組織NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取各組大鼠部分肺組織，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的蛋白質(zhì)裂解液，冰上裂解30 min，離心后取上清進(jìn)行蛋白定量及變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中封閉1～2 h，分別加入p-IκB、IκB、p-p65、p65和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜5次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，室溫孵育1 h，TBST洗膜5次后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，并在凝膠成像系統(tǒng)中拍照，采用Image J軟件進(jìn)行分析。

2.7 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 清開靈口服液對肺炎模型大鼠外周血及BALF菌落數(shù)的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組大鼠外周血及BALF中菌落數(shù)顯著增加（＜0.05）；與模型組比較，清開靈口服液中、高劑量組和頭孢氨芐組大鼠外周血中菌落數(shù)顯著減少（＜0.05），各給藥組大鼠BALF中菌落數(shù)均顯著減少（＜0.05）。

3.2 清開靈口服液對肺炎模型大鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞百分比的影響

如表2所示，與對照組比較，模型組大鼠外周血白細(xì)胞數(shù)量和中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞比例均顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組外周血白細(xì)胞數(shù)量和單核細(xì)胞比例均顯著降低（＜0.05、0.01），清開靈口服液中、高劑量組和頭孢氨芐組大鼠外周血中性粒細(xì)胞比例顯著降低（＜0.05、0.01）。

表1 清開靈口服液對肺炎模型大鼠外周血及BALF菌落數(shù)的影響(, n = 6)

Table 1 Effect of Qingkailing Oral Liquid on number of colonies in peripheral blood and BALF of pneumonia model rats(, n = 6)

組別劑量外周血菌落數(shù)BALF菌落數(shù) 對照—00 模型—7.00±5.51#44.00±34.34# 清開靈口服液4 mL/kg2.83±3.495.83±6.15* 8 mL/kg1.00±2.45*3.33±3.88* 16 mL/kg0.00±0.00*2.50±3.89* 頭孢氨芐175 mg/kg0.50±0.84*2.67±3.20*

與對照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

#< 0.05##< 0.05control group;*< 0.05**< 0.05model group, same as below tables

3.3 清開靈口服液對肺炎模型大鼠血清中炎癥因子水平的影響

如圖1所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、BK、MCP-1水平及COX-1、COX-2活性均顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、BK、MCP-1水平及COX-1、COX-2活性均顯著降低（＜0.05、0.01），清開靈口服液中、高劑量組和頭孢氨芐組大鼠血清中TNF-α水平顯著降低（＜0.05、0.01）。

表2 清開靈口服液對肺炎模型大鼠外周血白細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞比例的影響(, n = 6)

Table 2 Effect of Qingkailing Oral Liquid on peripheral blood leukocytes and percentages of neutrophils and monocytes in pneumonia model rats (, n = 6)

組別劑量白細(xì)胞數(shù)/(×109·L?1)中性粒細(xì)胞占比/%單核細(xì)胞占比/% 對照—7.93±1.4918.52±4.732.23±0.64 模型—25.30±8.57##50.98±4.77##4.78±0.76## 清開靈口服液4 mL/kg17.68±4.05*50.15±7.003.32±0.12** 8 mL/kg14.43±3.31*42.97±6.31**3.23±0.15** 16 mL/kg13.75±3.51*41.52±5.59*3.10±0.20** 頭孢氨芐175 mg/kg14.47±5.11*37.32±4.44**2.97±0.16**

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，圖4同

3.4 清開靈口服液對肺炎模型大鼠肺組織病理變化的影響

如圖2所示，對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)無滲出物，肺泡間隔無增厚，肺泡間隔內(nèi)毛細(xì)血管無明顯充血、擴(kuò)張及炎癥細(xì)胞浸潤。模型組大鼠肺泡腔內(nèi)充滿滲出的纖維素，相鄰肺泡纖維素絲經(jīng)肺泡間孔相連接現(xiàn)象多見，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增厚及毛細(xì)血管擴(kuò)張明顯，肺間質(zhì)見大量炎性細(xì)胞浸潤及紅細(xì)胞滲出。清開靈口服液低、中劑量組可見肺泡腔內(nèi)纖維素滲出較少，相鄰肺泡纖維素絲經(jīng)肺泡間孔相連接現(xiàn)象較模型組少見，部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞融合，部分肺泡間隔增厚，肺間質(zhì)有少量炎癥細(xì)胞浸潤。清開靈口服液高劑量組肺組織肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)僅有極少量炎癥細(xì)胞浸潤。頭孢氨芐組大鼠肺組織可見肺泡腔內(nèi)纖維素滲出較模型組少，相鄰肺泡纖維素絲經(jīng)肺泡間孔相連接現(xiàn)象較模型組少見，部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增厚，肺泡腔及肺間質(zhì)有少量滲出液。

3.5 清開靈口服液對肺炎模型大鼠肺組織中TLR4蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，對照組大鼠肺組織中僅檢測到少量TLR4蛋白陽性表達(dá)，模型組肺組織中TLR4蛋白陽性表達(dá)增加，各給藥組肺組織TLR4蛋白陽性表達(dá)明顯減少。

3.6 清開靈口服液對肺炎模型大鼠肺組織中p-p65/p65和p-IκB/IκB蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組大鼠肺組織中p-p65/p65和p-IκB/IκB蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，清開靈口服液中、高劑量組和頭孢氨芐組大鼠肺組織中p-p65/p65和p-IκB/IκB蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

圖2 各組大鼠肺組織病理變化(HE, ×200)

圖3 各組大鼠肺組織TLR4蛋白表達(dá)(×200)

圖4 各組大鼠肺組織p-p65/p65和p-IκB/IκB變化(, n = 3)

4 討論

肺炎克雷伯菌于1882年在肺炎患者的肺中分離得到。該菌在環(huán)境中無處不在，經(jīng)常在醫(yī)療設(shè)備中被發(fā)現(xiàn)。近年來，臨床中應(yīng)用抗生素的種類及范圍不斷擴(kuò)大，使得肺炎克雷伯菌對于各類抗生素產(chǎn)生耐藥性，并且耐藥性日趨嚴(yán)重。耐藥菌株所引發(fā)的院內(nèi)感染的發(fā)生率也呈現(xiàn)逐年遞增趨勢，有報道指出地中海周邊的27家醫(yī)院發(fā)生的院內(nèi)感染，約有10%為肺炎克雷伯菌引起[5]。而在我國，肺炎克雷伯菌是引發(fā)院內(nèi)感染的第二大致病菌群[6]。

抗菌中藥在我國應(yīng)用歷史悠久，具有低耐藥性、多作用靶點(diǎn)的抗菌效果。中成藥清開靈口服液具有清熱解毒、鎮(zhèn)靜安神的作用，臨床上對呼吸道疾病具有較好的治療作用。本研究結(jié)果顯示，清開靈口服液能明顯抑制肺炎克雷伯菌在大鼠體內(nèi)的繁殖，降低肺炎大鼠外周血白細(xì)胞數(shù)量及中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞比例。中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在宿主防御、對抗肺炎克雷伯菌方面至關(guān)重要，其中，中性粒細(xì)胞（包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10等）被認(rèn)為是細(xì)胞因子的重要來源，可作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑對病菌感染引起的炎癥進(jìn)行調(diào)控[6]。單核細(xì)胞產(chǎn)生至少2組炎癥蛋白介質(zhì)（IL-1β和TNF-α）[8]。

細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）是指機(jī)體對病毒、細(xì)菌等外界刺激所產(chǎn)生的一種過度免疫應(yīng)答，易導(dǎo)致后續(xù)炎性細(xì)胞因子急劇升高，致使機(jī)體免疫系統(tǒng)失調(diào)，出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)、多器官功能衰竭等臨床表現(xiàn)的綜合征[9]。CRS也被認(rèn)為是COVID-19的主要作用機(jī)制[10-11]。CRS發(fā)生時，體液中多種細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、MCP-1等迅速大量產(chǎn)生，趨化中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等致炎癥部位，對病菌進(jìn)行高效殺傷的同時也對宿主正常器官組織造成嚴(yán)重?fù)p傷。本研究結(jié)果顯示，清開靈口服液可顯著降低肺炎大鼠外周血中的細(xì)胞因子（IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、COX-1、COX-2、BK、MCP-1）的大量釋放，避免大量細(xì)胞因子的聚集對器官造成大面積的損傷。

一般而言，肺部對顆粒物可啟動機(jī)械防御，即咳嗽和黏液纖毛運(yùn)動；對于機(jī)械防御未能阻攔的顆粒物及病原體可啟動第二道防御即病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）。TLRs是主要的上皮PAMPs受體，在受到外界病原體的侵襲后，TLRs的激活誘導(dǎo)了TLR4/NF-κB信號通路的激活，刺激肺部炎癥的細(xì)胞因子和趨化因子的大量釋放。當(dāng)TLR4受到脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激時，IκB作為NF-κB復(fù)合體中的一部分，形成p-IκB，隨后被泛素化，最后從復(fù)合體中分離，激活NF-κB，導(dǎo)致LPS信號向下游傳導(dǎo)，因此IκB對TLR4/NF-κB信號通路的傳導(dǎo)具有重要作用。NF-κB是一個眾所周知的核轉(zhuǎn)錄因子，磷酸化的NF-κB可移位至細(xì)胞核，與1個特定的DNA序列相結(jié)合，導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生[12-13]。

研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19在肺、肝、腎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等多種細(xì)胞中激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，導(dǎo)致IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α和各種趨化因子的產(chǎn)生。老年人和代謝綜合征患者中NF-κB的敏感使這組人群易感染COVID-19，并導(dǎo)致更嚴(yán)重的并發(fā)癥，包括高死亡率。調(diào)節(jié)NF-κB的活化水平，抑制IκB磷酸化，抑制TNF-α釋放可減少CRS的發(fā)生，減輕COVID-19的嚴(yán)重程度。抑制NF-κB通路在緩解COVID-19重癥中具有潛在的治療作用[14]。

肺炎克雷伯菌的主要毒力因子LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁的組成成分，能保護(hù)細(xì)菌逃避宿主免疫[15]。在LPS誘導(dǎo)的肺炎發(fā)生發(fā)展中，TLR4作為LPS的受體，控制著LPS炎癥信號的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及NF-κB的激活和大量炎癥介質(zhì)的釋放[16]。TLR4可能參與識別S蛋白并通過MyD88依賴性信號通路導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子的激活，也會導(dǎo)致大量趨化因子和細(xì)胞因子（IL-1、IL-6、MCP-1）的大量釋放，參與募集吸引白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞到病灶部位，并持續(xù)擴(kuò)增，此時在釋放炎性介質(zhì)消滅病毒的同時也損傷了自身的免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和正常細(xì)胞的功能[17]。當(dāng)肺組織炎癥發(fā)展到一定疾病階段，會阻塞肺泡和毛細(xì)血管間的氣體交換，肺泡出現(xiàn)代償性的變大，出現(xiàn)肺間質(zhì)增生等。本研究發(fā)現(xiàn)清開靈口服液能夠顯著降低肺組織中TLR4的表達(dá)，抑制下游TLR4/NF-κB信號通路p-IκB、p-p65的激活，降低細(xì)胞因子風(fēng)暴對自身器官帶來的損傷。

綜上所述，清開靈口服液可明顯改善肺炎克雷伯菌誘導(dǎo)的大鼠肺炎病理變化，抑制病原微生物內(nèi)繁殖，抑制免疫亢進(jìn)，減輕炎癥引起的CRS，其機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Qingkailing Oral Liquid in preventing and treatment of pneumonia based on TLR4/NF-κB signaling pathway

CHEN Hong-ying1, 2, LI Xin3, XU Jun3, ZHANG Tie-jun3, LI Qing3, OUYANG Dong-sheng1, XU Xu3

1. Department of Clinical Pharmacology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China 2. Guangzhou Baiyunshan Mingxing Pharmaceutical Co., Ltd., Guangzhou 510250, China 3. Tianjin Key Laboratory of Quality Markers of Traditional Chinese Medicine, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300301, China

To study the effect and mechanism of Qingkailing Oral Liquid (清開靈口服液, QKL) on pulmonary inflammation based on Toll-like receptor 4 (TLR4)/nuclear factor-κB (NF-κB) signaling pathway.SD rats were randomly divided into control group, model group, QKL low-, medium-and high-dose (4, 8, 16 mL/kg) groups and cephalexin (175 mg/kg) group. Each administration group was ig corresponding drugs for 6 d. Models were established at the same time of administration, and models were established by pulmonary injection ofsolution for 3 d, control group was injected with normal saline. After the administration, blood and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of rats were collected for colony culture and counting; Automatic blood cell analyzer was used to detect the number of white blood cells (WBC) and ratio of neutrophils and monocytes; ELISA was used to detect interleukin-1 (IL-1), IL-2, IL-6, IL-10, tumor necrosis factor-α (TNF-α), bradykinin (BK), monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) levels and cyclooxygenase-1 (COX-1), COX-2 activities in serum; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes of lung tissue in rats; Immunohistochemical staining was used to detect protein expression of TLR4 in lung tissue; Western blotting was used to detect protein expressions of phosphorylated p65 (p-p65), p65, phosphorylated inhibitor of NF-κB (p-IκB) and IκB in lung tissue.Compared with model group, number of colonies in whole blood and BALF after culture were significantly decreased in QKL group (< 0.05), number of WBCs and percentage of neutrophils and monocytes in whole blood were significantly decreased (< 0.05, 0.01), IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, TNF-α, BK, MCP-1 levels and COX-1, COX-2 activities in serum were significantly reduced (< 0.05, 0.01); Inflammatory cell infiltration, erythrocyte exudation, and alveolar epithelial cell detachment in lung parenchyma were significantly reduced; TLR4 protein positive expression in lung tissue were significantly reduced, p-p65/p65 and p-IκB/IκB protein expressions were significantly decreased (< 0.05, 0.01).QKL has an inhibitory effect on pneumonia caused by, and its mechanism may be related to regulating TLR4/NF-κB signaling pathway.

; pneumonia; Qingkailing Oral Liquid; inflammation; Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)19 - 6101 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.016

2022-06-24

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（2019YFC1711304）；國家自然科學(xué)基金資助項目（81830111）

陳紅英，女，高級工程師，研究方向為中藥新藥研究。E-mail: 2215183393@qq.com

歐陽冬生，男，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為臨床藥理學(xué)。E-mail: 801940@csu.edu.cn

徐 旭，男，研究員，研究方向為中藥產(chǎn)品開發(fā)與中藥藥理。Tel: (022)23006846 E-mail: xux@tipr.com.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]