施用生物刺激劑對空心菜種植增效減排效應研究

許紀元，郝雅瓊，孫海軍，董剛強，閔炬*，施衛(wèi)明

（1.中國科學院南京土壤研究所，土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室，南京 210008；2.南京林業(yè)大學林學院，南京 210037；3.安利（中國）植物研發(fā)中心，江蘇 無錫 214115）

我國蔬菜產(chǎn)量占世界蔬菜總產(chǎn)量的50%，已成為世界上最大的蔬菜生產(chǎn)國。蔬菜高產(chǎn)離不開肥料（特別是化肥）的投入。集約化蔬菜種植體系為追求高產(chǎn)，常投入大量氮肥，但氮肥利用率僅為18%左右。未被作物吸收利用的氮素可通過NH揮發(fā)損失，或在氮轉(zhuǎn)化的硝化-反硝化過程中產(chǎn)生NO氣體等，從而造成一系列環(huán)境問題。因此，亟需發(fā)展蔬菜種植體系增效減排的高效施肥技術。

生物刺激劑是指促進植物生長、提升作物品質(zhì)、提高植物抗逆性的一大類非養(yǎng)分物質(zhì)。已報道的生物刺激劑包括黃腐酸類物質(zhì)、海藻提取物、殼聚糖類物質(zhì)、蛋白質(zhì)水解物與多肽類物質(zhì)、微生物菌劑等多種類型。生物刺激劑對植物產(chǎn)生的生長促進作用主要通過對根系生長的促進效果、對養(yǎng)分吸收的維持和促進效果、對土壤微生物群落的改良作用等途徑來實現(xiàn)。生物刺激劑的促生作用并非依靠自身的養(yǎng)分作用，而是通過其關鍵成分決定，且生物刺激劑主要成分與其種類顯著相關。葉面噴施某種蛋白質(zhì)水解物可使菜豆增產(chǎn)25%，同時提高菜豆32%的豆莢種子數(shù)量和38%的平均株高；黃腐酸類物質(zhì)的使用可提高菠菜的養(yǎng)分吸收效率和菠菜體內(nèi)養(yǎng)分運輸速率；殼聚糖可提高長豆角豆莢可溶性蛋白含量、可溶性糖含量和維生素C含量，并增加了單果質(zhì)量、單株結莢數(shù)和單位面積產(chǎn)量；微生物菌劑施用可使番茄總產(chǎn)量和前期產(chǎn)量分別提高34.4%和42.4%。目前生物刺激劑的應用研究多集中于其對作物產(chǎn)量的影響，而對蔬菜種植的增效減排效應的評價尚缺乏。為此，本研究通過兩季（2018年和2019年）的空心菜土柱試驗，選取有代表性的6種生物刺激劑（黃腐酸類物質(zhì)、海藻提取物、殼聚糖、魚蛋白、大豆蛋白水解物、微生物菌劑）與氮肥配施，觀測不同生物刺激劑對空心菜產(chǎn)量、氮肥利用率、NH揮發(fā)和NO排放的影響，為提高菜地氮素利用率、減少氮環(huán)境排放提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗地概況

供試空心菜（Forsk）品種為港種大白骨通心菜310特選種，由深圳市范記種子有限公司提供。生物刺激劑包括黃腐酸（HA，山東興禾生物科技股份有限公司）、海藻提取物（AE，深圳神寶農(nóng)業(yè)科技有限公司，純度為50%）、殼聚糖（9012-76-4）（CT，國藥集團化學試劑有限公司）、魚蛋白（FPH，山東省田旺生物有限公司）、大豆蛋白水解物（PPH，江蘇長晶生物工程有限公司）、微生物菌劑（FC，山東綠隴生物科技有限公司）。

供試土壤取自江蘇省宜興市周鐵蔬菜種植基地（31°16'N，119°54'E）的設施菜地，根據(jù)《中國土壤系統(tǒng)分類檢索》，供試土壤類型為普通肥熟旱耕人為土。土壤基礎理化性質(zhì)如表1所示，其中土壤pH測定時的土水比為1∶2.5（∶），土壤電導率測定采用風干土，土水比為1∶5（∶）。

表1 供試菜地土壤基礎理化性質(zhì)Table 1 Soil type and major characteristics（0～20 cm）of the field site

江蘇省宜興市年平均降雨量1 177 mm，年平均氣溫15.7℃，氣候為亞熱帶季風氣候，試驗期間當?shù)氐慕涤旰蜌鉁刈兓鐖D1所示。

圖1 兩季試驗期（2018年和2019年）試驗點的日均溫和降雨量Figure 1 Average daily temperature and rainfall at the experimental site during the experiment periods（2018 and 2019）

1.2 試驗設計

試驗于2018年6—7月（第一季）和2019年8—9月（第二季）在光照通風正常的空地上開展。采用土柱模擬試驗，土柱直徑為35 cm，高度為60 cm，底部放入20 cm深珍珠巖，后填入50 kg過2 mm篩的風干設施菜地土壤，壓實、灌水，調(diào)節(jié)土柱內(nèi)土壤水分含量至當?shù)夭说靥镩g持水量水平，土壤容重1.16 g·cm。于土柱內(nèi)均勻移栽6棵2片真葉時期的空心菜，生長35 d后采獲。

試驗設置8個處理：不施氮對照處理（CK）、常規(guī)施氮處理（N），以及常規(guī)施氮分別配施6種生物刺激劑處理（N+HA、N+AE、N+CT、N+FPH、N+PPH、N+FC），每個處理3次重復。除CK處理不施氮肥外，其余所有處理的氮、磷、鉀肥投入均保持一致。其中氮肥采用尿素，氮肥（N）用量為1.15 g·盆，相當于120 kg·hm，分兩次施用，基肥、追肥分配比為1∶1。磷肥（PO）和鉀肥（KO）用量為0.38 g·盆和0.77 g·盆，相當于40 kg·hm和80 kg·hm，磷肥采用磷酸二氫鉀，鉀肥采用過硫酸鉀和磷酸二氫鉀，均一次性基施。6種生物刺激劑分別與氮肥同時添加，將肥料與生物刺激劑溶于水中，根部澆灌，2個肥期用量分配比為1∶1。生物刺激劑的總用量如表2所示，均換算自推薦用量。兩季基肥分別于2018年6月25日和2019年8月20日施入，追肥分別于2018年7月10日和2019年9月6日施入。定期澆水使土壤始終保持濕潤狀態(tài)。

表2 生物刺激劑的單季總用量（mg·盆-1）Table 2 Total amount of biostimulants to per vegetable season（mg·pot-1）

1.3 樣品的采集與測定

1.3.1 產(chǎn)量與氮肥表觀利用率

試驗結束后，收獲空心菜，稱取地上部生物量計算產(chǎn)量，然后在105℃下殺青30 min，繼續(xù)在75℃下烘干72 h至恒質(zhì)量。隨后用植物粉碎機將樣品粉碎，通過濃HSO-HO消煮并采用凱氏定氮法測定植株樣品氮含量并計算吸氮量。

利用氮肥的表觀利用率（）來比較不同生物刺激劑處理的氮利用效率，計算公式如下：

1.3.2 NH揮發(fā)

采用海綿吸收法收集裝置內(nèi)的NH揮發(fā)通量，采樣裝置為聚氯乙烯硬質(zhì)塑料管，內(nèi)徑15 cm，高20 cm。采樣時分別將兩塊厚度為2 cm、直徑為16 cm的海綿均勻浸以15 mL磷酸甘油溶液，下層海綿（樣品）置于塑料管中部，上層海綿（隔離空氣中的NH）與塑料管頂部齊平。各處理施基肥后分別于2018年6月25、27、29日和2019年8月20、22、24、26日更換下層海綿；追肥后分別于2018年7月10、12、14、16日和2019年9月6、8、10、12日更換下層海綿；基肥期采樣結束后至追肥開始之前的時間段內(nèi)（2018年6月29日—7月10日和2019年8月26日—9月4日），放置海綿吸收土壤揮發(fā)的NH，直至追肥前更換下層海綿。海綿樣品中的NH采用1 mol·LKCl溶液浸提，靛酚藍比色法測定。用以下公式計算NH揮發(fā)通量，NH揮發(fā)累積排放量為NH揮發(fā)通量之和：

式中：為NH揮發(fā)通量，kg·hm·d；為單個裝置采集到的NH-N的量，mg；為采樣裝置覆蓋土壤的面積，m；為該樣品連續(xù)捕獲的時間，d。

1.3.3 NO排放

采用靜態(tài)箱-氣相色譜法測定NO排放通量，取樣時將方蓋PVC靜態(tài)箱（40 cm×40 cm×60 cm）置于水槽底座中形成一密閉空間，然后在密閉15、30 min和45 min時采集箱內(nèi)氣體樣品，每次施肥后0、2、4 d和6 d采集樣品，用氣相色譜儀（HP7820A，Agilent Technologies，CA，USA）分析其NO濃度。通過以下公式計算NO排放通量，采用累積加和法計算空心菜季的NO累積排放量：

式中：為NO排放通量，μg·m·h；為標準大氣壓下NO氣體的密度，1.25 kg·m；為靜態(tài)箱高度，cm；Δ/Δ為靜態(tài)箱單位時間內(nèi)的氣體濃度變化量，μg·L·h；為采樣時的絕對溫度，K。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016對數(shù)據(jù)進行基礎統(tǒng)計分析，采用SPSS 20.0對不同處理地上部氮吸收、產(chǎn)量、NH揮發(fā)和NO排放進行單因素方差分析（One-way ANOVA）及Duncan多重比較（＜0.05）。圖形采用Origin 16.0繪制，圖中所有數(shù)據(jù)均為每個處理3次重復的平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 不同生物刺激劑處理對地上部氮吸收的影響

由圖2可以看出，添加生物刺激劑可提高空心菜地上部氮吸收量，兩季試驗地上部氮吸收量從高到低均依次為N+HA、N+AE、N+CT、N+FPH、N+FC、N+PPH，與N處理相比，N+HA和N+AE處理顯著提高了空心菜地上部20.4%～63.2%和21.4%～54.6%的氮吸收。N+CT處理顯著促進了第一季空心菜地上部氮吸收（37.0%），第二季也表現(xiàn)為促進作用，但差異不顯著。其余生物刺激劑處理不同程度地促進了空心菜的地上部氮吸收，但與N處理相比無顯著的統(tǒng)計學差異。

圖2 不同生物刺激劑處理對兩茬空心菜地上部氮吸收的影響Figure 2 Response of N uptake of water spinach to different biostimulant treatments

2.2 不同生物刺激劑處理對產(chǎn)量的影響

不同生物刺激劑處理下的空心菜產(chǎn)量如圖3所示，兩季試驗中生物刺激劑處理均可以增加空心菜產(chǎn)量，2018年增產(chǎn)效果從高到低依次為N+HA、N+AE、N+CT、N+FC、N+FPH、N+PPH，2019年依次為N+AE、N+HA、N+CT、N+FC、N+FPH、N+PPH。其中，與N處理相比，N+HA和N+AE處理顯著增加了兩季試驗中空心菜的產(chǎn)量，分別增長26.8%～32.9%和24.1%～28.0%，N+CT處理與N處理相比增產(chǎn)效果不顯著，但兩季的產(chǎn)量均值增長幅度仍達到11.7%～17.1%。N+FPH、N+PPH和N+FC處理對空心菜產(chǎn)量沒有顯著影響。結果表明，兩季試驗中的N+HA、N+AE和N+CT處理相較于其他生物刺激劑處理更能促進空心菜產(chǎn)量增加，增產(chǎn)幅度達到11.7%～32.9%，這與其對地上部氮吸收的促進效果相一致（圖2）。

圖3 不同生物刺激劑處理對兩茬空心菜產(chǎn)量的影響Figure 3 Impacts of biostimulant amendments on water spinach yields during two seasons

2.3 不同生物刺激劑處理對氮肥表觀利用率的影響

圖4表明，生物刺激劑可提高空心菜氮肥的表觀利用率。兩季試驗的從高到低均依次為N+HA、N+AE、N+CT、N+FPH、N+FC、N+PPH。與N處理相比，N+HA和N+AE處理顯著提高了空心菜的，增幅為34.7%～108.9%和30.9%～94.0%。N+CT處理顯著促進了第一季的，增幅為63.6%，第二季增幅為26.7%，但與N處理相比差異不顯著。N+FPH和N+FC處理促進了空心菜，但與N處理相比無顯著差異。N+PPH處理提高了第一季空心菜，增幅為7.3%，但降低了第二季的，降幅為15.1%

圖4 不同生物刺激劑處理對空心菜氮素表觀利用率的影響Figure 4 Impacts of biostimulant amendments on the RENof water spinach

2.4 不同生物刺激劑處理對土壤NH3揮發(fā)的影響

如圖5所示，不同處理NH揮發(fā)通量變化趨勢基本一致，添加氮肥明顯增加了肥期的NH揮發(fā)通量。施肥后的2～4 d內(nèi)土壤NH揮發(fā)通量達到峰值，之后逐漸下降，基肥期的NH揮發(fā)通量峰值高于追肥期。不同生物刺激劑對土壤NH揮發(fā)通量的影響有差異，與N處理相比，除了N+FC處理之外，其余處理在每次施肥后都減小了NH揮發(fā)通量，其中，N+HA和N+AE處理NH揮發(fā)通量減小最為明顯。

圖5 不同生物刺激劑處理下的NH3揮發(fā)通量Figure 5 NH3 volatilization fluxes under different biostimulants treatments

本研究中，兩季施氮處理NH揮發(fā)累積排放量分別為2.32～3.70 kg·hm（以N計，下同）和2.76～4.62 kg·hm，占氮素投入量的1.9%～3.1%和2.3%～3.8%，且不同生物刺激劑處理對空心菜季設施土壤NH揮發(fā)累積排放量有不同影響（圖6）。其中，與N處理相比，N+HA和N+AE處理分別顯著降低NH揮發(fā)損失的15.0%～17.2%和21.3%～27.4%；N+CT處理可顯著降低第二季NH揮發(fā)損失（19.8%），而對第一季NH揮發(fā)損失影響不顯著；N+FPH處理顯著降低第一季NH揮發(fā)損失（12.6%），而對第二季NH揮發(fā)損失影響不顯著；N+PPH處理與N處理相比無顯著差異，即對土柱NH揮發(fā)損失無顯著影響。綜合兩季空心菜種植期NH揮發(fā)監(jiān)測結果可知，與N處理相比，N+AE和N+HA處理的NH揮發(fā)減排效果最好，N+CT和N+FPH處理具有NH揮發(fā)減排的潛力，N+FC處理可能會導致NH揮發(fā)增加?？梢?，生物刺激劑會顯著影響設施蔬菜土壤NH揮發(fā)，其影響效果與生物刺激劑類型有關。

圖6 不同生物刺激劑處理對空心菜種植設施菜地土壤NH3揮發(fā)的影響Figure 6 Impacts of biostimulant amendments on NH3 volatilization from intensive vegetable soil planted with water spinach

2.5 不同生物刺激劑處理對土壤N2O排放的影響

如圖7所示，不同處理NO排放速率變化趨勢基本一致，添加氮肥處理明顯增加了NO排放速率。施肥后的2～3 d，土壤NO排放速率達到峰值，不同生物刺激劑對土壤NO排放速率的影響有所差異。與N處理相比，生物刺激劑處理總體上不同程度地提高了土壤NO排放速率，尤其是提高了第一次施肥期的NO排放速率，第一季和第二季第一次施肥后的NO排放速率峰值分別增加了274.6～576.9μg·m·h（以N計，下同）和42.6～455.4 μg·m·h，這可能是生物刺激劑影響下土壤NO排放總量增高的原因之一。

圖7 不同生物刺激劑處理下的N2O排放速率Figure 7 N2O emission rates under different biostimulants treatments

本研究中，兩季施氮處理NO累積排放量分別為1.36～1.90 kg·hm（以N計，下同）和2.43～3.01 kg·hm，占 氮 素 投 入 量 的1.12%～1.58%和2.02%～2.51%，如圖8所示，不同生物刺激劑處理均促進了土壤NO累積排放量。其中N+HA、N+AE、N+PPH和N+FC處理均顯著提高了兩季空心菜試驗期間的NO排放，與N處理相比，分別增加了0.36～0.52、0.37～0.49、0.39～0.45、0.54～0.58 kg·hm。N+CT處理顯著促進了第二季空心菜種植土壤NO的排放（0.36 kg·hm），但對第一季NO的排放無顯著影響。N+FPH處理對兩季空心菜的NO排放均無顯著影響。綜上所述，生物刺激劑添加會影響設施菜地土壤NO排放，具體影響效果與生物刺激劑種類有關。

圖8 不同生物刺激劑處理對空心菜種植設施菜地土壤N2O排放的影響Figure 8 N2O emissions from intensive vegetable soil planted with water spinach following biostimulant amendments

3 討論

3.1 不同生物刺激劑處理增產(chǎn)增效效果

本研究中，施用黃腐酸、海藻提取物和殼聚糖類生物刺激劑對空心菜有顯著的增產(chǎn)效果。與常規(guī)施氮相比，添加黃腐酸類物質(zhì)（N+HA）、海藻提取物（N+AE）、殼聚糖（N+CT）處理顯著提高了空心菜產(chǎn)量（15.0%～29.2%），同時提高了地上部氮吸收（26.2%～40.3%）及氮表觀利用率（40.5%～62.4%）。因此，施用生物刺激劑促進空心菜產(chǎn)量提升的主要原因之一是其增加了空心菜對氮的吸收，提高了氮利用率。SMOLE?等發(fā)現(xiàn)黃腐酸類物質(zhì)能夠顯著提高水培條件下菠菜（L.）葉和根的生物量，KOCIRA等發(fā)現(xiàn)噴施海藻提取物可以顯著提高大豆產(chǎn)量（9.2%），以上均與本研究結果一致。此外，不同生物刺激劑還存在其他促生機制。黃腐酸類物質(zhì)可以通過調(diào)控根區(qū)細胞質(zhì)膜H離子泵活性促進根區(qū)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成及細胞自身分生和生長，從而顯著促進玉米苗期根系生長；海藻提取物類物質(zhì)含有的大量海藻酸、海藻多糖及多種植物促生物質(zhì)（如抗氧化劑、藻類蛋白、藻類萜和植物生長激素等）可顯著提高生菜早期的總根長（40%～83%）；殼聚糖類物質(zhì)可定向改變番茄苗根際微生物群落豐富度和多樣性，提高毛單胞菌科屬、假單胞菌科纖維弧菌屬、根瘤菌科根瘤菌屬和亞硝化單胞菌科亞硝化螺菌屬等促進植物生長的根際微生物活性。因此，生物刺激劑添加后作物產(chǎn)量的增加可能是多種因素共同作用的結果。

與常規(guī)施氮相比，添加魚蛋白（N+FPH）、大豆蛋白水解物（N+PPH）、微生物菌劑（N+FC）處理下空心菜產(chǎn)量和氮表觀利用率均沒有顯著提高。這與COLLA等和NGUYEN等的研究結果不一致，前者發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)水解物類物質(zhì)可以通過促進植物根系硝化還原酶和谷氨酰胺合成酶的活性及不定根的生長來提高植物的養(yǎng)分吸收，進而提高作物產(chǎn)量，后者研究發(fā)現(xiàn)、和3種微生物菌劑可在各個階段促進大麥生長，提高其產(chǎn)量。生物刺激劑的促產(chǎn)機理較為復雜，易受多種因素的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，微生物菌劑能夠顯著提高低氮投入條件下生菜作物地上部氮的吸收，而在高氮投入條件下對氮吸收的影響不顯著，土壤氮水平的差異可能導致生物刺激劑促生效果的差異。有研究證明生物刺激劑施用方式不同（葉施或根施）對金魚草生長的影響存在差異，不同于前人研究中的葉面噴施方式，本試驗采用的根部施肥方式更易受到植物生長所處根系環(huán)境的影響，從而可能改變生物刺激劑的作用效果，導致促生效果存在差異。

3.2 不同生物刺激劑處理的環(huán)境減排效果

生物刺激劑對設施菜地土壤NH揮發(fā)的影響與刺激劑類型有關。與常規(guī)施氮相比，添加黃腐酸類物質(zhì)（N+HA）、海藻提取物（N+AE）、殼聚糖（N+CT）處理降低了9.6%～24.2%的NH揮發(fā)量。上述3種生物刺激劑的添加，提高了空心菜地上部氮吸收和氮表觀利用率，減少了氮損失，這可能是NH揮發(fā)降低的原因。而添加微生物菌劑（N+FC）處理顯著提高空心菜季土壤NH揮發(fā)。微生物菌劑類物質(zhì)可能是通過提升土壤中的NH-N含量進而導致空心菜季菜地土壤NH揮發(fā)增加。此外，微生物菌劑類物質(zhì)可能通過直接影響土壤微生物群落組成及其豐度，或間接影響植物根系次生分泌物的組成以改變根際氮轉(zhuǎn)化微生物群落，導致本研究中微生物菌劑類物質(zhì)與其他生物刺激劑對土壤氮轉(zhuǎn)化過程的影響不同。

與常規(guī)施氮處理相比，6種生物刺激劑處理均增加了土壤NO排放，增幅為8.4%～29.8%。生物刺激劑可以直接調(diào)控土壤氮轉(zhuǎn)化微生物的活性，或通過調(diào)節(jié)土壤pH、提供有機碳源、刺激根系分泌物等調(diào)節(jié)根際微生物，從而控制土壤硝化反硝化過程，促進NO排放。本研究結果與SOUZA等的研究結果一致，其研究發(fā)現(xiàn)某種含氮轉(zhuǎn)化微生物的生物刺激劑添加導致土壤NO排放顯著增加32%。此外，黃腐酸類物質(zhì)可以通過耦合土壤中鐵、錳等活性金屬介導土壤氮的轉(zhuǎn)化，促進土壤NO的形成及排放，還可以通過介導土壤NO的氧化還原轉(zhuǎn)化影響土壤中氮的去向。本研究中，生物刺激劑添加導致的NO排放損失量為0.16～0.56 kg·hm，僅占氮肥投入量的0.1%～0.5%，處于較低水平。在應用生物刺激劑時，聯(lián)合其他NO減排措施（如添加硝化抑制劑、生物質(zhì)炭）、有機肥代替化肥等，可以有效控制NO排放。

4 結論

（1）兩季種植結果表明，與常規(guī)施氮相比，氮肥配施黃腐酸類物質(zhì)、海藻提取物和殼聚糖處理增產(chǎn)增效最為顯著，增產(chǎn)幅度為15.0%～29.2%，氮表觀利用率提高40.5%～62.4%。

（2）與常規(guī)施氮相比，氮肥配施黃腐酸類物質(zhì)、海藻提取物和殼聚糖可降低土壤NH揮發(fā)損失9.6%～24.2%。此外，生物刺激劑施用存在NO排放增加的風險，建議在配施生物刺激劑的同時實施NO減排措施，以便降低溫室氣體排放。

（3）綜合考慮6種生物刺激劑在產(chǎn)量、氮肥表觀利用率和NH、NO排放上的效果，發(fā)現(xiàn)在空心菜等葉菜上應用黃腐酸類、海藻提取物、殼聚糖類生物刺激劑與氮肥配施，可促進產(chǎn)量、提高氮肥利用率并減少NH揮發(fā)。