響應(yīng)面法優(yōu)化辛烯基琥珀酸籽粒莧淀粉酯制備工藝

陳櫻,汪之禾,王亞娟,仇丹

（寧波工程學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院,浙江 寧波 315211）

0 引言

籽粒莧（Amaranthus）是一類古老的可糧飼兼用的、莧科莧屬的草本植物，主要有A.hypochondriacus，A.cruentus和A.caudates等品種，常見的有K112、R104和K45等[1]。因其適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)豐富和產(chǎn)量大等特點(diǎn)，在國(guó)外，籽粒莧制作出的食品被視為極富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，從而得到很多消費(fèi)者青睞，因此關(guān)于籽粒莧的研究已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一[2-5]。籽粒莧的籽實(shí)中含有約15%～22%的蛋白質(zhì)、58%～66%的淀粉、6.88%左右的脂肪、9%～16%的膳食纖維，及豐富的維生素和礦物質(zhì)[6]，而籽粒莧的品種是造成這些營(yíng)養(yǎng)素含量不同的主要原因，因此目前國(guó)內(nèi)外研究領(lǐng)域主要致力于籽粒莧的育種栽培，及其中蛋白質(zhì)、脂肪等的研究。

也有部分學(xué)者將關(guān)注點(diǎn)放在作為淀粉的使用上，比如夏雪娟等人[7]研究比較了玉米、木薯、紅薯和籽粒莧淀粉的理化性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：K112品種籽粒莧淀粉的溶解度、透明度及沉降速率均低于其他三種淀粉，且其凍融穩(wěn)定性較差；BHOSALE等學(xué)者[8-9]使用辛烯基琥珀酸酐（OSA）對(duì)籽粒莧淀粉進(jìn)行改性，發(fā)現(xiàn)其凍融穩(wěn)定性有較大幅度的提升，且改性后粘度增加；吳媛莉等人[10]探究了籽粒莧淀粉經(jīng)OSA疏水化改性后用作Pickering乳化劑，發(fā)現(xiàn)高取代度的OSA改性籽粒莧淀粉可得到穩(wěn)定性較好的乳液。但是對(duì)于籽粒莧淀粉的酯化工藝優(yōu)化方面的研究未見涉及，而籽粒莧淀粉顆粒呈多角形，粒徑較小在0.5～3μm[7]，將其使用OSA酯化后有望作為顆粒乳化劑使用。同時(shí)，在這些研究者的工作中涉及到的OSA與淀粉反應(yīng)得到產(chǎn)物的取代度（DS）均使用滴定法測(cè)定，而該方法忽略了游離辛烯基琥珀酸的含量，從而降低了結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，本研究采用高效液相法為檢測(cè)手段，以籽粒莧淀粉酯的DS為響應(yīng)值，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定影響規(guī)律，然后采用響應(yīng)面法優(yōu)化最佳酯化參數(shù)，以期為高效、經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)OSA改性莧菜籽淀粉提供參考。

1 試驗(yàn)條件與方法

1.1 材料與試劑

籽粒莧籽實(shí)（R104），山東省曹縣草業(yè)科技研究中心；辛烯基琥珀酸酐，分析純，上海能源化工有限公司；乙腈和甲醇，色譜純，天津賽福科技有限公司；其他化學(xué)品為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HR2094粉碎機(jī)，飛利浦；TDZ5-WS臺(tái)式低速離心機(jī)，湘儀儀器有限公司；GZX-9140MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀，Waldbronn，Germany；ZD-2型自動(dòng)滴定儀，上海精密科學(xué)公司；KMS-181E型水浴鍋，上海崇豐科學(xué)儀器有限公司。

1.3 籽粒莧淀粉的提取

淀粉的提取參考KONG[11]的研究方法，從籽粒莧籽實(shí)中提取淀粉。具體操作如下：在0.1 mol/L氫氧化鈉水溶液中加入籽粒莧籽實(shí)，4℃的條件下浸泡24 h；用粉碎機(jī)打漿約3 min，然后過(guò)濾，用去離子水洗滌濾渣，直至不能洗出白色淀粉；于3 000 r/min下離心10 min，下層沉淀于50℃烘箱中干燥并研磨，得到籽粒莧淀粉（Amaranth starch,簡(jiǎn)稱AS）。

1.4 辛烯基琥珀酸籽粒莧淀粉酯（OSAS）的制備

試驗(yàn)方法參照Z(yǔ)HU[12]等人，并做適量修改。具體為：稱取10.0 g AS于四口燒瓶中，加適量去離子水配成一定濃度的淀粉乳，用3%NaOH溶液調(diào)節(jié)淀粉乳pH至一定值，繼續(xù)攪拌20 min；而后在5 min內(nèi)緩慢加入淀粉重3%的OSA，期間使用自動(dòng)電位滴定儀檢測(cè)并維持反應(yīng)的pH。在設(shè)定溫度下反應(yīng)一定時(shí)間后，使用0.1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，過(guò)濾并用去離子水及無(wú)水乙醇各洗3次，后將沉淀置于80℃的烘箱中干燥得OSAS。OSAS的取代度使用QIU等[13]的方法測(cè)定，液相色譜參數(shù)：安捷倫Agilent1260高效液相色譜儀，ZORBAX-SB-C18柱；流動(dòng)相：乙腈和水（0.1%三氟乙酸（TFA））的混合物（45:55，v/v）；檢測(cè)波長(zhǎng)為200 nm；流速1 mL/min；檢測(cè)溫度為30℃；進(jìn)樣量20μL。

1.4.1 單因素試驗(yàn)

以淀粉酯中DS為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究淀粉濃度、反應(yīng)溫度、pH及反應(yīng)時(shí)間四個(gè)因素對(duì)反應(yīng)效率的影響。

1.4.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

利用Box-Behnken的方法對(duì)影響DS值的重要參數(shù)的水平和變量間的交互作用進(jìn)行分析和優(yōu)化，其因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.4.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均為3次試驗(yàn)的平均值。使用軟件Design-Expert（Version 10.0.5，State-Ease Inc.,Minneapolis,Minnesota,USA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 淀粉乳濃度對(duì)OSAS取代度的影響

籽粒莧淀粉乳濃度對(duì)其酯化產(chǎn)物DS的影響見圖1。如圖1所示，在淀粉乳濃度為10%～30%范圍內(nèi)，隨著籽粒莧淀粉濃度的增加，相應(yīng)的OSAS的DS幾乎呈線性增加；而當(dāng)濃度大于30%后，因濃度的增加使得淀粉乳液的粘度增大，進(jìn)而導(dǎo)致淀粉酯中的DS降低。因此反應(yīng)淀粉乳濃度優(yōu)選30%，該濃度較美人蕉、秈稻和糯玉米淀粉的最佳濃度都低[14-15]，原因?yàn)樽蚜Ｇ{淀粉顆粒較小，隨著粒徑的減小，淀粉的表面能增加，使淀粉顆粒更容易團(tuán)聚。

2.1.2 酯化溫度對(duì)OSAS取代度的影響

酯化反應(yīng)溫度的升高可增加OSA的溶解度，同時(shí)也會(huì)促進(jìn)淀粉顆粒的溶脹性，使得OSA與淀粉顆粒接觸的幾率增加，從而可在一定程度上加快反應(yīng)速率[14]。圖2結(jié)果顯示：隨著酯化反應(yīng)溫度從30℃升高到60℃，OSAS的DS值不斷增加。但由于溫度超過(guò)60℃，籽粒莧淀粉會(huì)糊化，進(jìn)而破壞淀粉的顆粒結(jié)構(gòu)，同時(shí)當(dāng)反應(yīng)溫度在60℃時(shí)，OSAS的取代度為0.017 3，可達(dá)到大部分淀粉酯作為乳化劑的使用要求，故本試驗(yàn)研究酯化溫度為60℃。

圖1 淀粉乳濃度對(duì)取代度的影響

圖2 酯化溫度對(duì)取代度的影響

2.1.3 pH對(duì)OSAS取代度的影響

pH對(duì)取代度的影響如圖3所示。隨著pH的增加，取代度先增大后減小，當(dāng)pH為8.5時(shí)，DS達(dá)到最大值。該結(jié)果可表明：當(dāng)pH小于8.5時(shí)，不能充分活化籽粒莧淀粉的羥基以進(jìn)行酸酐部分的親核反應(yīng)，而選pH大于8.5則有利于酸酐水解[15]。因此，選擇pH為8.5進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)OSAS取代度的影響

圖4展示了反應(yīng)時(shí)間對(duì)OSAS取代度的影響。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間從30 min增加到90 min，DS值顯著增加，主要借助于OSA在淀粉顆粒中的擴(kuò)散和吸附作用[16]；而超過(guò)90 min后，反應(yīng)時(shí)間對(duì)DS無(wú)明顯影響。對(duì)比美人蕉和大米淀粉的酯化條件，籽粒莧淀粉酯化達(dá)到平衡的時(shí)間相對(duì)較短[17]，主要還是由于其粒徑較小，OSA擴(kuò)散到淀粉顆粒表面所需的時(shí)間短。

圖3 pH對(duì)取代度的影響

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)取代度的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以反應(yīng)時(shí)間（A）、反應(yīng)溫度（B）和反應(yīng)pH（C）三個(gè)因素做自變量，以O(shè)SAS的取代度DS為響應(yīng)值（Y），采用響應(yīng)面法探究籽粒莧淀粉在不同條件下的取代度，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

使用Design-Expert軟件對(duì)DS進(jìn)行回歸分析，得到響應(yīng)值（YDS）與反應(yīng)時(shí)間（A）、溫度（B）和pH值（C）之間的二次多元回歸方程：

該方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.950 6，表明該模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果擬合度高，數(shù)據(jù)可靠。通過(guò)ANOVA對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析

如果模型中每個(gè)項(xiàng)的F值較大且P值較小，則響應(yīng)變量是顯著的。因此，回歸方程的方差分析結(jié)果表明，因子A（時(shí)間）、B（溫度）、C（pH）、A2（時(shí)間的平方）和C2（pH的平方）是顯著的模型項(xiàng)（P＜0.05)。在試驗(yàn)所選的三個(gè)因素中，對(duì)DS的影響順序?yàn)椋悍磻?yīng)時(shí)間＞pH＞反應(yīng)溫度。

采用Design-Expert10.0分析軟件獲得兩因素交互作用的響應(yīng)面圖見圖5，兩因素交互項(xiàng)的三維圖越陡峭，等高線呈橢圓形則表明對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著。圖5中的陡峭順序?yàn)椋篈C＞BC＞AB，即時(shí)間與pH的交互項(xiàng)最陡峭，表明反應(yīng)時(shí)間與pH的交互作用對(duì)OSAS的酯化程度影響最顯著，這與模型的方差分析相符。

圖5 兩因素的交互作用對(duì)OSAS的取代度的響應(yīng)面圖：

利用Design-Expert 10.0軟件進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合，得到預(yù)測(cè)的籽粒莧淀粉酯化最佳工藝條件為：反應(yīng)pH 8.3、反應(yīng)時(shí)間84 min及溫度48.1℃，預(yù)測(cè)的DS為0.020 4。為了驗(yàn)證模型的有效性，考慮到實(shí)際情況將最佳提取條件定為：反應(yīng)pH 8.3、反應(yīng)時(shí)間90 min及溫度48.0℃，在此工藝下，淀粉酯的取代度為HPLC法測(cè)定為0.020 2，滴定法測(cè)定為0.021 1，與預(yù)測(cè)值總體吻合，說(shuō)明該模型合理。

3 結(jié)論

本研究利用堿提法從籽粒莧籽實(shí)中提取了籽粒莧淀粉顆粒，通過(guò)響應(yīng)面分析建立了水相法制備籽粒莧淀粉酯的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，結(jié)果如下：

（1）反應(yīng)時(shí)間對(duì)籽粒莧淀粉酯的反應(yīng)效率影響最顯著，其次是pH。在所選的3個(gè)因素中，反應(yīng)溫度的影響最小。

（2）淀粉酯的取代度（DS）與反應(yīng)時(shí)間（A）、溫度（B）和pH（C）間的多元回復(fù)方程為：

（3）辛烯基琥珀酸籽粒莧淀粉酯的最佳工藝條件為：淀粉濃度30%，反應(yīng)時(shí)間84 min，pH 8.3，反應(yīng)溫度48.1℃。在此條件下得到的籽粒莧淀粉酯的理論取代度為0.020 4，驗(yàn)證試驗(yàn)中OSAS的取代度為0.020 2，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.98%。

綜上說(shuō)明可以用此回歸模型對(duì)籽粒莧淀粉的辛烯基琥珀酸酯化進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。