microRNA-45調(diào)控魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡*

童細(xì)焱 趙泰成

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）又稱(chēng)震顫麻痹，是一種多發(fā)于中老年人的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以中腦黑質(zhì)致密帶腹外側(cè)部的多巴胺能神經(jīng)元大量變性和進(jìn)行性缺失，以及神經(jīng)元胞漿中Lewy 小體形成為特征性病理改變。神經(jīng)疾病現(xiàn)在是全球殘疾的主要來(lái)源，而世界上增長(zhǎng)最快的神經(jīng)疾病是帕金森病。隨著社會(huì)老齡化，預(yù)計(jì)到2040 年將達(dá)到1 200 萬(wàn)以上[1-2]。PD 的研究已有190 多年，但其病因及致病機(jī)制仍未徹底明確，目前可能的相關(guān)因素有老齡化、環(huán)境工業(yè)和農(nóng)業(yè)污染、遺傳因素、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和泛酸-蛋白酶體系統(tǒng)功能異常等[3]。

miRNA-451 是近年發(fā)現(xiàn)的一種多功能miRNA，目前已證實(shí)其在血液系統(tǒng)疾病、神經(jīng)發(fā)育、心血管疾病及腫瘤等方面具有重要作用。研究者在對(duì)帕金森病輕度認(rèn)知障礙患者的血漿外泌體miRNA 篩選分析中發(fā)現(xiàn)miRNA-451 在帕金森患者血漿外泌體中的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組[4]。但是miRNA-451在PD 發(fā)生與進(jìn)展中的作用機(jī)制尚不明確。

本研究以魚(yú)藤酮處理PC12 細(xì)胞建立的帕金森病細(xì)胞模型為研究對(duì)象，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，在PC12 細(xì)胞損傷模型中分別抑制和增強(qiáng)miRNA-451的 表達(dá)，采用Real-time PCR 檢測(cè)miRNA-451對(duì)Bcl-2、Bax 的表達(dá)水平的影響，旨在分析miRNA-451 對(duì)帕金森病細(xì)胞模型凋亡的影響，為以miRNA-451 為靶點(diǎn)的帕金森病治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12 細(xì)胞系購(gòu)買(mǎi)于凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清（四季青）；DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Gibco 公司）；魚(yú)藤酮（rotenone）、二甲基亞砜（Sigma 公司）；miRNA-451模擬物（miRNA-451 mimics）、miRNA-451 抑制劑（miRNA-451-inhibitor）、無(wú)義序列及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 所需引物（均由上海生物工程有限公司合成）；總RNA 提取試劑盒（北京TIANGEN 公司提供）；Lipofectamine 2000、Trizol 試劑（invitrogen 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司）。RT 反應(yīng)使用新加坡ABI2720 型PCR 儀，PCR 檢測(cè)采用杭州博日FQD-96A Realtime PCR system 進(jìn)行。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物配置 PC12 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，每隔2～3 天用0.125%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。魚(yú)藤酮用二甲基亞砜（DMSO）配制成1 mmol/L 儲(chǔ)存液于常溫避光保存，然后稀釋成所需濃度使用。

1.3.2 MTT 法篩選魚(yú)藤酮最佳處理濃度 收集對(duì)數(shù)期PC12 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×104/mL，96 孔板中每孔加入100 μL，置5% CO2、37 ℃條件培養(yǎng)箱中12 h，至細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，每孔加入100 μL 不同濃度的魚(yú)藤酮（0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L），均設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，每孔加入20 μL，5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，棄除培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)液，加入DMSO 溶液150 μL/孔，置恒溫?fù)u床上低速搖勻10 min，至結(jié)晶顆粒完全溶解。利用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，波長(zhǎng)OD 570 nm 條件下測(cè)量吸光值。計(jì)量公式：細(xì)胞存活率（%）=（OD 實(shí)驗(yàn)組/OD 對(duì)照組）×100%。

1.3.3 PC12 細(xì)胞損傷模型的建立 將PC12 細(xì)胞接種于96 孔板中，濃度為5×104/mL，待細(xì)胞融合80%后棄去培養(yǎng)液，加入含魚(yú)藤酮（1 μmol/L）的DMEM 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，即可造成損傷模型。

1.3.4 分組與轉(zhuǎn)染 魚(yú)藤酮處理后，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒，按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)將1×105/mL 密度的PD 細(xì)胞模型接種于6 孔板中。實(shí)驗(yàn)分為四組：陰性對(duì)照抑制劑組（PD 細(xì)胞模型+inhibitor-無(wú)義序列，inhibitor-NC組）、miRNA-451 抑制劑組（PD 細(xì)胞模型+miRNA-451-inhibitor，miRNA-451-inhibitor組）、陰性對(duì)照模擬物組（PD 細(xì)胞模型+mimics-無(wú)義序列，mimics-NC組）及miRNA-451 模擬物組（PD 細(xì)胞模型+miRNA-451-mimics，miRNA-451-mimics組）。

1.3.5 Real-time PCR 檢測(cè)miRNA-451、Bcl-2、Bax的表達(dá)水平轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后，收集各組細(xì)胞，采用Trizol 試劑提取細(xì)胞總RNA，按試劑盒說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行cDNA 合成和以miRNA-451 和U6 引物進(jìn)行Real-time PCR 檢測(cè)，設(shè)立3 個(gè)復(fù)孔，以U6 作為內(nèi)參。Bcl-2、Bax 表達(dá)水平檢測(cè)：提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以Bcl-2、Bax 引物進(jìn)行Real-time PCR 檢測(cè)，設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，以GAPDH 作為內(nèi)參。Real-time PCR 的結(jié)果用2-ΔΔCt計(jì)算。引物序列見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR中所需引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（）表示，使用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT 法篩選魚(yú)藤酮最佳處理濃度 0～100 μmol/L魚(yú)藤酮處理PC12 細(xì)胞24 h 后，PC12 細(xì)胞存活率隨著濃度的增高逐漸下降，呈濃度依賴(lài)性，細(xì)胞存活率以相對(duì)于載體的百分比來(lái)測(cè)量。1 μmol/L 魚(yú)藤酮干預(yù)后細(xì)胞存活率為（49.4±3.0）%，與0 μmol/L魚(yú)藤酮相比存活率降低（P＜0.05），見(jiàn)表2，圖1。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用魚(yú)藤酮的濃度為1 μmol/L。

表2 MTT法檢測(cè)魚(yú)藤酮對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響

圖1 魚(yú)藤酮對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 在PC12 細(xì)胞損傷模型中轉(zhuǎn)染miRNA-451 模擬物或抑制劑72 h 后，Realtime PCR 檢測(cè)miRNA-451 的表達(dá)，與inhibitor-NC組（miRNA-451 表達(dá)量為1）相比，miRNA-451-inhibitor組miRNA-451 的表達(dá)量（0.27±0.05）明顯降低（P＜0.01）；與mimics-NC組（miRNA-451表達(dá)量為1）相比，miRNA-451-mimics組中miRNA-451 的表達(dá)水平（12.95±2.33）明顯升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 miR-451的表達(dá)水平

2.3 Real-time PCR 檢測(cè)Bcl-2 和Bax mRNA 表達(dá)水平 miRNA-451-mimics組Bcl-2 mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），miRNA-451-inhibitor組Bcl-2 mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）。miRNA-451-mimics組Bax mRNA 表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）；miRNA-451-inhibitor組Bax mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。見(jiàn)表3，圖3。

表3 各組Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)水平（）

表3 各組Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)水平（）

*與GAPDH 比較，P＜0.05；**與GAPDH 比較，P＜0.01。

圖3 Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)水平

3 討論

PD 是一種緩慢進(jìn)展的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，發(fā)病初期若能及時(shí)診斷并給予正確治療，多數(shù)患者發(fā)病數(shù)年內(nèi)仍能有較好的生活質(zhì)量或繼續(xù)工作。PD被認(rèn)為是一種病因不明的多病因疾病，特征性臨床癥狀包括運(yùn)動(dòng)癥狀（靜止性震顫、動(dòng)作遲緩和肌強(qiáng)直等）和非運(yùn)動(dòng)癥狀（認(rèn)知障礙、嗅覺(jué)障礙、睡眠障礙等）。隨著社會(huì)老齡化，PD 的致殘率和癡呆率逐年上升，患者的生活質(zhì)量明顯下降，并給患者的家庭及社會(huì)造成巨大負(fù)擔(dān)。近年來(lái)在病理生理學(xué)和對(duì)癥治療方面已經(jīng)取得了許多進(jìn)展，但仍有一些至關(guān)重要的問(wèn)題有待解決，其中最主要的是如何改變疾病進(jìn)展。但目前的治療方法無(wú)法改變疾病的進(jìn)展，因此PD 的防治研究應(yīng)引起廣泛重視[5-6]。

魚(yú)藤酮是植物毛魚(yú)藤的有效成分，目前被廣泛用作殺蟲(chóng)劑，作為一種特效的線粒體復(fù)合物Ⅰ抑制劑，通過(guò)抑制線粒體呼吸鏈電子傳遞，導(dǎo)致細(xì)胞線粒體功能喪失，細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，長(zhǎng)期接觸可引起多巴胺神經(jīng)退行性病變。線粒體功能障礙是PD 發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制[7]。因此，魚(yú)藤酮常用于PD 研究的動(dòng)物和細(xì)胞模型建立[8-9]。

PC12 細(xì)胞是一種來(lái)源于大鼠的腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，具有神經(jīng)分泌（兒茶酚胺、多巴胺和去甲腎上腺素）、離子通道和神經(jīng)遞質(zhì)受體的功能[10]。在常規(guī)條件下可作為一種兒茶酚胺樣細(xì)胞，具有增殖細(xì)胞的一些特性。但在神經(jīng)生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)下可增殖和分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，具有神經(jīng)元相似的形態(tài)、生理和生化功能，而且在常規(guī)條件下易于培養(yǎng)，因此PC12 細(xì)胞廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)模型[11-12]。

miRNA-451 位于人類(lèi)17 號(hào)染色體上的一種雙順?lè)醋觤iRNA 基因位點(diǎn)，主要在紅細(xì)胞中高度表達(dá)，其余組織和細(xì)胞中表達(dá)較低。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-451 是一種腫瘤增殖的調(diào)節(jié)子，其不僅可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖而且能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞分化來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[13-15]。近年來(lái)研究者報(bào)道阿爾茨海默病、帕金森病和抑郁癥等疾病中也存在著miR-144/451 的表達(dá)異常[16]。帕金森病病理主要表現(xiàn)為多巴胺能神經(jīng)元的大量退化和進(jìn)行性缺失。而神經(jīng)元的死亡主要有凋亡、自噬性死亡和壞死幾種形式。因此推測(cè)miRNA-451 可能與帕金森病的神經(jīng)元凋亡有關(guān)[17-19]。

Bcl-2 是哺乳動(dòng)物中重要的抗凋亡基因，Bax 是與Bcl-2 功能相對(duì)的基因，其不但能拮抗Bcl-2 的抑制凋亡作用，而且有直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能；Bcl-2 和Bax 基因之間的平衡在細(xì)胞凋亡過(guò)程中有重要的調(diào)控作用[20-21]。

本研究通過(guò)魚(yú)藤酮處理腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC12 細(xì)胞，構(gòu)建PD 細(xì)胞模型。將miRNA-451-mimic、miRNA-451-inhibitor 轉(zhuǎn)入魚(yú)藤酮損傷后的PC12 細(xì)胞模型中，采用Real-time PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞中Bcl-2 和Bax mRNA 的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-451-mimics組Bcl-2 mRNA 表達(dá)下調(diào)、Bax mRNA 表達(dá)上調(diào)，而miRNA-451-inhibitor組Bcl-2 mRNA 表達(dá)上調(diào)、Bax mRNA 表達(dá)下調(diào)。因此，推測(cè)miRNA-451 可以通過(guò)抑制Bcl-2、上調(diào)Bax mRNA 的表達(dá)來(lái)促進(jìn)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷模型凋亡。然而，miRNA-451 調(diào)控魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型凋亡的具體通路還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。