番茄黃化曲葉病毒與番茄褪綠病毒復(fù)合侵染對(duì)番茄黃化曲葉病毒傳播的影響

羅瑞雪, 趙 丹, 潘求一, 曾 穎, 張戰(zhàn)泓,史曉斌, 張德詠, 史彩華, 劉 勇*

(1. 長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 荊州 434000; 2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 長(zhǎng)沙 410125;3. 雙峰縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 婁底 417700; 4. 安鄉(xiāng)縣植保植檢站, 常德 415600;5. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所, 長(zhǎng)沙 410125)

番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV),隸屬于雙生病毒科Geminiviridae,菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus[1],具有單鏈(ss)環(huán)狀DNA基因組[2-3],大小約2.8 kb。TYLCV于1964年在以色列被首次報(bào)道[4],隨后在全球各地迅速傳播,中國(guó)于2006年在上海被首次報(bào)道[1]。TYLCV由煙粉虱Bemisiatabaci以持久性方式傳播[5],在田間造成的損失高達(dá)80%～100%[6]。感染TYLCV后,植株發(fā)育遲緩并向上卷曲、黃化,植株葉片會(huì)變少、變小[7-8]。番茄褪綠病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)隸屬于長(zhǎng)線形病毒科Closteroviridae,毛形病毒屬Crinivirus,于20世紀(jì)90年代中期在美國(guó)佛羅里達(dá)州被首次報(bào)道,中國(guó)于2004年在臺(tái)灣被首次報(bào)道[10],迄今已在35個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)生[9]。ToCV是由煙粉虱傳播的半持久性RNA病毒。帶毒煙粉虱取食健康植株后,可造成植株100%的發(fā)病率[9]。與大多數(shù)植物病毒不同,感染ToCV的植株表現(xiàn)為老葉先發(fā)病,葉脈間黃化褪綠、變厚變脆且邊緣向內(nèi)卷曲[7-8],一般要3～4周才表現(xiàn)癥狀[7-8]。

TYLCV與ToCV復(fù)合侵染自2013年在山東壽光被首次報(bào)道以來,在江蘇和云南等地相繼被報(bào)道,且TYLCV和ToCV的發(fā)病率都在逐年上升[11-13]。復(fù)合侵染的番茄植株中,TYLCV的帶毒量比ToCV高262～436倍[14],且復(fù)合侵染會(huì)給番茄造成10%以上的減產(chǎn),嚴(yán)重時(shí)甚至絕收[8,15-16]。已有研究表明,植株發(fā)生復(fù)合侵染時(shí)會(huì)產(chǎn)生協(xié)生作用,發(fā)病癥狀更為嚴(yán)重,加速寄主植物死亡[17-19]。復(fù)合侵染還會(huì)提高病毒的基因重組概率,導(dǎo)致病毒的侵染能力和擴(kuò)散速度增加[20-22]。TYLCV和ToCV復(fù)合侵染番茄植株后,顯著提高煙粉虱獲取和傳播ToCV的效率[23],但是復(fù)合侵染對(duì)TYLCV傳播的影響,缺乏研究。針對(duì)這一問題,本文研究了TYLCV和ToCV復(fù)合侵染番茄植株后煙粉虱獲取和傳播TYLCV效率的變化,以及TYLCV在煙粉虱和番茄體內(nèi)積累量的變化,并進(jìn)一步明確了復(fù)合侵染是否影響煙粉虱對(duì)TYLCV的傳播,為研究TYLCV和ToCV復(fù)合侵染后二者產(chǎn)生的協(xié)生作用及分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植株:番茄品種為‘鉆紅美娜’,該品種不抗TYLCV。

供試?yán)ハx:Q型煙粉虱,由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所張友軍研究員饋贈(zèng),之后放在45 cm×50 cm×60 cm的養(yǎng)蟲籠內(nèi),(26±1)℃、RH (70±5)%、光周期L∥D=16 h∥8 h條件下,用健康番茄飼養(yǎng),定期做生物型的鑒定[24]。

供試菌液:含TYLCV的農(nóng)桿菌菌液由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所周雪平團(tuán)隊(duì)饋贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1番茄中TYLCV的鑒定

用CTAB法提取番茄的總DNA。特異性引物TYLCV-F/TYLCV-R(表1)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為190 bp[23],退火溫度為58℃。經(jīng)驗(yàn)證該引物特異性及擴(kuò)增效率良好。使用南京諾維贊(Vazyme)生物公司2×TaqPlus Master Mix Ⅱ (Dye Plus)試劑盒,按照說明書步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳凝膠進(jìn)行檢測(cè),紫外燈下觀察并記錄結(jié)果,將條帶正確的PCR產(chǎn)物純化回收后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,比對(duì)序列是否正確。

1.2.2煙粉虱中TYLCV的鑒定

單頭煙粉虱DNA的提取:用蛋白酶K和樹脂提取單頭煙粉虱的DNA,后續(xù)鑒定步驟參照1.2.1。用CTAB法提取多頭煙粉虱的總DNA,后續(xù)鑒定步驟參照1.2.1。

1.2.3番茄和煙粉虱中ToCV的鑒定

用TRIzol法提取番茄或煙粉虱的總RNA后用南京諾維贊(Vazyme)生物公司的cDNA試劑盒,按照說明書合成cDNA。以cDNA為模板,采用特異性引物ToCV-F/ToCV-R(表1)擴(kuò)增,目的片段長(zhǎng)度為439 bp[22],退火溫度為60℃,后續(xù)步驟參照1.2.1。

1.2.4侵染性克隆與蟲傳毒株

將TYLCV病毒侵染性克隆接種在含有卡那霉素(50 mg/L)和利福平(50 mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上,28℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。將活化后的農(nóng)桿菌菌體溶解在去離子水中,濃度為OD600=2。使用1 mL醫(yī)用注射器,在健康番茄長(zhǎng)出3～4片真葉時(shí),將農(nóng)桿菌菌液注射到番茄莖稈上,每株番茄接種0.5 mL菌液。接種后放置溫室內(nèi)45 cm×50 cm×60 cm的養(yǎng)蟲籠中,于(26±1)℃、RH (70±5)%、光周期L∥D=16 h∥8 h條件下培育。15 d后用1.2.1的方法進(jìn)行檢測(cè),將100頭健康煙粉虱轉(zhuǎn)移到感染了TYLCV的毒株上飼毒48 h后,取出全部煙粉虱將其轉(zhuǎn)移到健康番茄(3～4片真葉期)上取食48 h,15 d后用1.2.1的方法進(jìn)行檢測(cè)。

復(fù)合侵染的番茄采自田間,經(jīng)過PCR以及小RNA測(cè)序確定無其他病毒復(fù)合侵染,放入溫室內(nèi)45 cm×50 cm×60 cm的養(yǎng)蟲籠中,(26±1)℃、RH (70±5)%、光周期L∥D=16 h∥8 h條件下培養(yǎng)。將100頭健康煙粉虱放到TYLCV和ToCV復(fù)合侵染的病株上取食48 h后,取出全部的煙粉虱將其放到健康番茄(3～4片真葉)上取食48 h,15 d后用1.2.1的方法檢測(cè)TYLCV,30 d后用1.2.3的方法檢測(cè)ToCV。選擇TYLCV的病毒量一致的復(fù)合侵染與單獨(dú)侵染的番茄進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 番茄與煙粉虱帶毒情況檢測(cè)所用引物信息

1.3 番茄黃化曲葉病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系建立

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以TYLCV的DNA為模板,以TYLCV-qF和TYLCV-qR(表1)為特異性引物,該引物根據(jù)TYLCV 的AV2 gene (Gene ID: 949226)進(jìn)行設(shè)計(jì)[25],目的片段長(zhǎng)度為100 bp,退火溫度為58℃,經(jīng)驗(yàn)證該引物特異性及擴(kuò)增效率良好。使用2×TaqPlus Master Mix Ⅱ (Dye Plus)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,純化回收目的片段后,連接至pMD18-T 載體,并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞TreliefTM5α Chemically Competent Cell(北京擎科生物有限公司),在37℃恒溫箱中培養(yǎng)12～16 h后,以TYLCV-qF和TYLCV-qR為引物進(jìn)行菌落PCR檢測(cè),將陽(yáng)性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

選擇測(cè)序序列完全正確的陽(yáng)性克隆接種于含有氨芐青霉素(100 mg/L Amp+)的LB液體培養(yǎng)基,37℃,250 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h,用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)粒濃度和OD值后,運(yùn)用公式計(jì)算質(zhì)粒濃度拷貝數(shù):C=[(A×10-9)×(6.02×1 023)]/(B×660 dalton/bp),其中A為質(zhì)粒濃度(ng/μL),B為分子堿基數(shù),C為質(zhì)粒濃度拷貝數(shù)(拷貝/μL),將其作為TYLCV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品使用。

用DNase/RNase free water將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按照10倍梯度進(jìn)行稀釋,獲得終濃度為5.15×108～5.15×1012拷貝/μL的5個(gè)質(zhì)粒樣品作為模板,使用南京諾維贊(Vazyme)生物公司的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行qPCR,每個(gè)濃度進(jìn)行4次技術(shù)重復(fù),得到Ct平均值后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光PCR絕對(duì)定量

用CTAB法提取番茄或煙粉虱的總DNA,用NanoDrop測(cè)定所提DNA的OD260/OD280以及濃度,將DNA濃度統(tǒng)一定量到500 ng/μL作為模板DNA,進(jìn)行qPCR檢測(cè),將所得Ct值代入回歸方程y=-3.072x+37.568計(jì)算得出TYLCV的拷貝數(shù),其中x為質(zhì)粒濃度拷貝數(shù)對(duì)數(shù),y為循環(huán)閾值(Ct),每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.4 ToCV與TYLCV復(fù)合侵染對(duì)煙粉虱獲取TYLCV效率以及積累量的影響

取400頭健康的煙粉虱進(jìn)行2 h的饑餓處理,分別在兩種病毒復(fù)合侵染和TYLCV單獨(dú)侵染15 d后的番茄上放入200頭煙粉虱飼毒48 h。

隨機(jī)取10頭煙粉虱,使用1.2.2的方法提取單頭煙粉虱DNA,根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果計(jì)算10頭煙粉虱的帶毒率,每個(gè)處理重復(fù)5次。

隨機(jī)取10頭煙粉虱參照1.2.2方法提取煙粉虱的總DNA,DNA濃度統(tǒng)一定量到500 ng/μL,按照試劑盒說明書進(jìn)行qPCR檢測(cè),將Ct值代入回歸方程計(jì)算得出TYLCV的拷貝數(shù),每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.5 ToCV與TYLCV復(fù)合侵染對(duì)TYLCV傳毒率以及積累量的影響

取適量健康的煙粉虱進(jìn)行2 h的饑餓處理后,分別轉(zhuǎn)移到兩種病毒復(fù)合侵染和TYLCV單獨(dú)侵染15 d后的番茄植株上飼毒48 h。

將50頭帶毒煙粉虱饑餓處理2 h后,一起轉(zhuǎn)移到10株含3～4片真葉的健康番茄上取食48 h,隨后用吸蟲管移除煙粉虱。在10、15、20、25、30 d后取番茄頂部葉片,采用1.2.1所述方法提取番茄的總DNA,先檢測(cè)番茄植株的帶毒情況計(jì)算帶毒率,然后將DNA含量統(tǒng)一定量到500 ng/μL,按照試劑盒說明書進(jìn)行qPCR檢測(cè),得到的Ct值代入回歸方程算出TYLCV的拷貝數(shù),每處理重復(fù)5次。

分別取5、10、25、50頭的帶毒煙粉虱進(jìn)行2 h的饑餓處理后,分別轉(zhuǎn)移到10株3～4片真葉期的健康番茄上取食48 h并移除煙粉虱,15 d后采用1.2.1所述方法檢測(cè)番茄植株的帶毒情況,并計(jì)算帶毒率以此來反映煙粉虱的傳毒率。傳毒率=帶毒率=檢測(cè)到TYLCV植株數(shù)/接種植株數(shù)。每處理重復(fù)5次。

1.6 ToCV與TYLCV復(fù)合侵染和TYLCV單獨(dú)侵染對(duì)番茄葉片內(nèi)葉綠素含量的影響

取適量健康的煙粉虱進(jìn)行2 h的饑餓處理后,分別轉(zhuǎn)移到復(fù)合侵染和TYLCV單獨(dú)侵染15 d后的番茄植株上飼毒48 h,分別取50頭帶毒煙粉虱進(jìn)行2 h的饑餓處理后,轉(zhuǎn)移到10株3～4片真葉期的健康番茄上取食48 h并移除煙粉虱,在15 d后取番茄頂部葉片,用葉綠素測(cè)定儀檢測(cè)葉片的葉綠素含量。每處理重復(fù)5次。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2012軟件整理試驗(yàn)數(shù)據(jù),IBM SPSS Statistics 21進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。復(fù)合侵染對(duì)煙粉虱獲取TYLCV效率以及積累量的影響、在煙粉虱數(shù)量相同時(shí),復(fù)合侵染對(duì)TYLCV傳毒率的影響、在傳毒后天數(shù)相同時(shí),復(fù)合侵染對(duì)TYLCV傳毒率和積累量的影響、復(fù)合侵染和TYLCV單獨(dú)侵染對(duì)番茄葉片內(nèi)葉綠素含量的影響均采用獨(dú)立樣本t測(cè)驗(yàn)(t-test)進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn);在侵染方式相同的條件下,不同數(shù)量的煙粉虱對(duì)TYLCV傳毒率的影響、相同數(shù)量煙粉虱傳毒后不同天數(shù)對(duì)TYLCV的傳毒率以及積累量的影響采用單因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄黃化曲葉病毒SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系建立

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度在5.15×108～5.15×1012拷貝/μL時(shí),質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度和Ct值兩者之間呈良好的線性關(guān)系(圖1)。該標(biāo)準(zhǔn)曲線將用于后續(xù)TYLCV含量的測(cè)定。

圖1 TYLCV含量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of TYLCV amount by real-time quantitative PCR

2.2 ToCV與TYLCV復(fù)合侵染對(duì)煙粉虱獲取TYLCV效率以及積累量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明,煙粉虱在TYLCV和ToCV復(fù)合侵染、TYLCV單獨(dú)侵染的番茄植株上飼毒48 h后,單頭煙粉虱的TYLCV獲毒率分別為88%和74%(圖2a)。煙粉虱體內(nèi)TYLCV病毒的拷貝數(shù)分別為1.58×1010拷貝/μL和0.49×1010拷貝/μL(圖2b)。在復(fù)合侵染的番茄上取食的煙粉虱的帶毒率和病毒拷貝數(shù)都顯著高于在TYLCV單獨(dú)侵染的番茄上取食的煙粉虱。

圖2 煙粉虱取食復(fù)合感染和單獨(dú)感染TYLCV 植株后的獲毒率和帶毒量Fig.2 Acquisition rate and accumulation of TYLCV by Bemisia tabaci feeding on co-infected and single-infected tomato

2.3 ToCV與TYLCV復(fù)合侵染對(duì)TYLCV傳毒率以及積累量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明,對(duì)TYLCV的傳毒率與煙粉虱數(shù)量呈正相關(guān),且同等數(shù)量的煙粉虱中取食ToCV與TYLCV復(fù)合侵染的番茄植株的煙粉虱對(duì)TYLCV的傳毒率明顯高于取食TYLCV單獨(dú)侵染的番茄植株的煙粉虱。分別將25頭取食復(fù)合侵染和單獨(dú)侵染番茄的煙粉虱接種至健康番茄上，15 d后對(duì)TYLCV的傳毒率分別為90%和74%。50頭分別取食復(fù)合侵染和單獨(dú)侵染番茄的煙粉虱對(duì)TYLCV的傳毒率均達(dá)到100%(圖3)。

圖3 復(fù)合侵染和單一侵染條件下不同數(shù)量煙粉虱對(duì)TYLCV的傳毒率Fig.3 Transmission rate of TYLCV by different numbers of Bemisia tabaci on co-infected and single-infected tomato

取食復(fù)合侵染和TYLCV單獨(dú)侵染番茄的煙粉虱傳毒后10 d，番茄植株帶毒率分別為80%和60%,傳毒后15 d番茄植株的帶毒率均達(dá)到100%(圖4a)。

TYLCV的病毒積累量與煙粉虱傳毒后的天數(shù)不相關(guān),取食復(fù)合侵染和TYLCV單獨(dú)侵染番茄后,煙粉虱傳毒的番茄植株體內(nèi)TYLCV的累積量分別為2.03×1011拷貝/μL和0.67×1011拷貝/μL(圖4b)。

2.4 ToCV與TYLCV復(fù)合侵染和TYLCV單獨(dú)侵染對(duì)番茄葉片內(nèi)葉綠素含量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明,煙粉虱傳毒后15 d,ToCV與TYLCV復(fù)合侵染和TYLCV單獨(dú)侵染的番茄植株其葉片葉綠素含量都顯著低于健康番茄植株(圖5),但兩者之間沒有明顯的差異。

圖5 復(fù)合感染、單獨(dú)感染和健康的番茄葉片內(nèi)葉綠素含量Fig.5 Contents of chlorophyll in co-infected, single TYLCV-infected and healthy tomato leaves

3 結(jié)論與討論

TYLCV目前是菜豆金色花葉病毒屬中研究的最為全面的單組分病毒之一[26-27]。TYLCV與其他病毒在田間容易發(fā)生復(fù)合侵染,2014年在我國(guó)山東首次發(fā)現(xiàn)TYLCV和ToCV的復(fù)合侵染,之后復(fù)合侵染在我國(guó)呈逐年上升的趨勢(shì)[10-12]。本試驗(yàn)主要研究了TYLCV和ToCV復(fù)合侵染與TYLCV單獨(dú)侵染對(duì)介體昆蟲Q型煙粉虱的獲毒率、傳毒率、番茄植株體內(nèi)病毒量積累的影響。結(jié)果表明,取食復(fù)合侵染番茄植株的煙粉虱的獲毒率要高于取食TYLCV單獨(dú)侵染番茄植株的煙粉虱,分別為88%和74%。取食復(fù)合侵染和單獨(dú)侵染番茄植株后的煙粉虱傳毒率隨煙粉虱數(shù)量的增加而顯著升高,25頭煙粉虱的傳毒率分別為90%和74%,50頭煙粉虱的傳毒率均為100%,說明TYLCV和ToCV復(fù)合侵染提高了煙粉虱對(duì)TYLCV的獲取和傳播,這一現(xiàn)象需要引起重視和提前防范,以減少病毒侵染所造成的損失。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示,TYLCV和ToCV復(fù)合侵染促進(jìn)了煙粉虱對(duì)TYLCV的傳播,TYLCV和ToCV復(fù)合侵染的番茄體內(nèi)TYLCV的積累量大約是TYLCV單獨(dú)侵染的3倍。造成差異的原因可能與植物防御反應(yīng)降低有關(guān)。因?yàn)門YLCV侵染可以抑制植物的JA防御途徑[28],而ToCV侵染也可以降低植物的JA防御反應(yīng)以及萜類揮發(fā)物的釋放[29],推測(cè)二者復(fù)合侵染后更大程度地降低了植物的防御反應(yīng)。該推測(cè)還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

復(fù)合侵染也促進(jìn)了煙粉虱對(duì)ToCV的傳播,并且復(fù)合侵染的煙粉虱和番茄體內(nèi)ToCV的積累量大約是ToCV單獨(dú)侵染的4倍[22],說明兩種病毒復(fù)合侵染促進(jìn)了煙粉虱對(duì)兩種病毒的傳播,可能是由于兩種病毒共同起作用時(shí),引起了介體昆蟲與傳毒相關(guān)特性的改變[30]。對(duì)于TYLCV和ToCV復(fù)合侵染番茄后,番茄植株體內(nèi)及其與煙粉虱的互作機(jī)制還有待研究,可能是由于復(fù)合侵染與單獨(dú)侵染相比,改變了煙粉虱體內(nèi)防御和代謝相關(guān)的酶。前期研究發(fā)現(xiàn),隨著煙粉虱體內(nèi)ToCV含量的升高,α-葡糖苷酶活性也逐漸升高[31],推測(cè)α-葡糖苷酶能夠促進(jìn)煙粉虱對(duì)病毒的獲取,而復(fù)合侵染情況下煙粉虱體內(nèi)的α-葡糖苷酶也可能進(jìn)一步被激活,從而促進(jìn)了煙粉虱對(duì)病毒的獲取。這需要后期進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究發(fā)現(xiàn),TYLCV和ToCV復(fù)合侵染促進(jìn)了煙粉虱對(duì)TYLCV的傳播,因此,探明復(fù)合侵染下病毒-媒介昆蟲-植物三者之間的協(xié)同機(jī)制對(duì)于植物病毒的防治和治理具有重要意義。